Приложение 3-2. Инструкция по проведению диагностики COVID-19 с применением иммунохимических методов

Приложение 3-2

Инструкция
по проведению диагностики COVID-19 с применением иммунохимических методов

Общие положения

Иммунохимические методы дополняют комплекс клинических, инструментальных и лабораторных методов диагностики COVID-19, включая молекулярно-генетические методы (ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-LAMP).

Иммунохимические исследования для диагностики COVID-19 могут проводится во всех лабораториях Российской Федерации вне зависимости от их организационно-правовой формы, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека III - IV патогенности и условия для исследований с применением иммунохимических методов.

Иммунохимические методы диагностики COVID-19

Эффективность иммунохимических методов исследования зависит от стадии инфекционного процесса, состояния иммунной системы пациента, а также от иммунохимических характеристик применяемых диагностических наборов, условий хранения и сроков годности реагентов. Для выявления антител к SARS-CoV-2 используются методы иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохемилюминесцентные (ИХЛ) и иммунохроматографические методы. Для проведения исследования должны применяться зарегистрированные в установленном порядке на территории Российской Федерации тест-системы в соответствии с инструкциями по их применению (Приложение 5-1, 5-2).

Иммунохроматографические методы - быстрые диагностические тесты, рассматриваются как тесты "у постели больного" (время получения результата - 10-30 минут). Иммунохроматографические тесты являются качественными тестами и позволяют определить наличие антител к SARS-CoV-2 (IgM, IgG, суммарные антитела).

Разработанные до настоящего времени методы ИФА и ИХЛ позволяют получать качественные, полуколичественные (коэффициент позитивности) и количественные результаты. Для проведения исследований требуется специальное оборудование. Время получения результата при применении ИФА тестов - 2-5 ч, ИХЛ - 1-2 ч.

Определение уровня антител в диагностике COVID-19 позволяет определить различные фазы инфекционного процесса:

- активная фаза - при определении диагностически значимого уровня IgA или IgM в единственном образце или значимым нарастанием уровня IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом в 2-4 недели;

- фаза сероконверсии - антитела могут не выявляться в первичном образце и выявляются во взятых через несколько дней образцах;

- фаза реконвалесценции - концентрация IgA и IgM существенно снижается (падение титра в 2-4 раза) во время выздоровления, при сохраняющихся IgG через 2 недели после курса лечения и позднее;

- перенесенная инфекция - персистенция IgG без роста его уровня в парных сыворотках и отсутствие IgA и IgM. Определение уровня IgG в высоких титрах через 4 недели после вакцинации позволяет подтвердить наличие поствакцинального иммунитета.

Сбор, хранение и транспортировка диагностического материала

Биоматериалом при иммунохимических исследованиях может быть, в зависимости от типа тестирования и согласно инструкциям производителей, капиллярная кровь, сыворотка, плазма, цельная венозная кровь.

Забор крови для серологических исследований проводят в утренние часы после 12-часового ночного голодания. Накануне взятия проб крови пациент должен воздержаться от физических нагрузок, приема алкоголя и лекарств. Оптимальным временем для взятия проб крови на лабораторные исследования является промежуток с 7 до 10 ч утра.

Забор крови на исследование проводит медицинский персонал в процедурном кабинете медицинских организаций.

Для проведения серологических исследований берется венозная кровь в объеме 3-5 мл в вакуумные пробирки (вакутейнеры), предназначенные для биохимических и серологических исследований. Сразу после взятия необходимо осторожно перевернуть пробирку 8-10 раз, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась. После плавного перемешивания пробирку помещают в штатив.

На пробирке указывают ФИО, дату и время сбора материала, номер анализа или используют штрихкодирование пробирки.

При транспортировке пробирки с кровью должны быть плотно закрыты, прочно установлены в штативы в вертикальном положении, чтобы предотвратить их встряхивание или опрокидывание, установлены вдали от нагревательных приборов и защищены от воздействия яркого солнечного света. Пробирки с кровью для серологических анализов транспортируют в термоконтейнерах с надписью: "пробы крови для лабораторных исследований". В термоконтейнере должна поддерживаться температура от 4 до 8°С. Пробы крови от больного с установленным диагнозом COVID-19 помещают в дополнительный вторичный контейнер, затем - в термоконтейнер с надписью: "пробы с инфицированным материалом".

Образцы крови должны быть доставлены в лабораторию в кратчайшие сроки. В журнале учета лабораторных исследований регистрируют время доставки проб в лабораторию.

Допустимо хранение образцов цельной крови:

- при температуре 20-25°С - не более 2 часов;

- при температуре 2-8°С - не более 6 ч с момента взятия материала.

Сроки хранения проб сыворотки при температуре 2-8°С - не более 4 дней.

Хранение проб сывороток от 5 дней до 1 года осуществляют в замороженном виде при температуре не выше минус 18°С. Длительное хранение проб (более года) осуществляется при температуре не выше минус 40°С.

Лабораторные этапы диагностики

Преаналитический, аналитический и постаналитические этапы исследований проводятся в строгом соответствии с инструкциями производителей применяемых наборов реагентов.

Интерпретация результатов исследований методами амплификации нуклеиновых кислот и определения антител к SARS-CoV-2

Результаты исследования SARS-CoV-2				Интерпретация
РНК	Антиген	IgM/ IgA	IgG
-	-	-	-	Отсутствие инфекции COVID-19. Ранее COVID-19 не болел
+	+	-	-	Острая фаза инфекции. Серонегативный период. Результат может предшествовать появлению симптомов COVID-19
+	+	+	-	Острая фаза инфекции, Начало развития иммунного ответа
+	+	+	+	Острая фаза инфекции, выраженный иммунный ответ на инфекцию COVID-19
-	-	+	+	Поздняя фаза заболевания или выздоровление, выраженный иммунный ответ.
-	-	-	+	Наличие инфекции COVID-19 в прошлом или период выздоровления. Сформирован иммунитет к SARS-CoV-2

Интерпретация результатов иммунохимических исследований должна проводиться с учетом анамнеза и клинических данных, а также результатов других лабораторных и инструментальных исследований.

Необходимо также учитывать вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Ложноположительные результаты могут появиться при наличии в крови пациента так называемых "перекрестно-реагирующих" антител, сходных по своим иммунохимическим свойствам со специфическими антителами (других коронавирусов, ревматоидным фактором IgM).

Ложноотрицательные результаты могут быть при исследовании биологических образцов, взятых на серонегативном этапе развития инфекции, или при применении тест-систем/наборов реагентов с низким уровнем чувствительности. Ложноотрицательные результаты могут быть получены при обследовании пациентов со сниженным иммунитетом.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты могут также появляться при нарушении правил проведения лабораторных исследований на всех этапах. Для исключения ложноположительных результатов необходимо ввести алгоритм последовательного тестирования пациентов, у которых получены первоначальные положительные результаты, с использованием другого теста. С этой целью необходимо использовать тест-систему с максимальными чувствительностью и специфичностью, а также с одновременным выявлением антител классов A, M, G, которая будет играть роль референтной (верифицирующей) тест-системы.

Дезинфекция, обращение с отходами при проведении диагностики COVID-19 с применением иммунохимических методов проводится аналогично требованиям к дезинфекции и обращению с отходами с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.