Энзимно-хроматографический метод определения фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах и биосубстратах (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 19 октября 1979 г. N 2086-79)

Метод позволяет определять большую часть фосфорорганических пестицидов, угнетающих холинэстеразу. Применение хроматографии в тонком слое, а также использование различных способов активации соединений дает возможность избирательно анализировать различные фосфорорганические пестициды и токсические продукты их превращений. Высокая чувствительность детектирования (0,1-5 нг) позволяет использовать аликвотные части экстрактов, что дает возможность исключить в ряде случаев очистку их, а также проводить хроматографирование каждой пробы в нескольких повторностях.

Модификация метода заключается в замене дефицитного сорбента силикагеля "Мерк" отечественным сорбентом силикагелем КСК и в разработке условий проявления на отечественном сорбенте.

1. Характеристика действующих веществ

Фосфорорганические пестициды - эфиры фосфорной, тиофосфорной и дитиофосфорной кислот, угнетающих холинэстеразу.

Общие структурные формулы:

где

R - алкил

R' - ароматический или алифатический остаток

R'' - водород или алкил

Фосфорные (ДДВФ и др.) и тиолфосфорнокислые эфиры (рицид, циодрин, фенитрооксон и др.) можно прямо энзиматически определять с большой чувствительностью, а тионфосфорнокислые эфиры (метафос, метилнитрофос, пиразофос, цианокс, фоксим и др.), дитиофосфаты (карбофос, фталофос, фозалон, фосфамид и др.), эфиры фосфоновой кислоты (хлорофос) необходимо предварительно активировать.

2. Методика определения фосфорорганических пестицидов энзимно-хроматографическим методом

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении фосфорорганического пестицида из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке, если необходимо, охлажденным ацетоном и определении методом хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением без активации или после активации препарата на пластинке. Препараты, угнетающие холинэстеразу, проявляются в виде белых пятен на голубом фоне. Чувствительность обнаружения ФОП 0,0001-0,001 мкг. Количественное определение производят путем сравнения размера пятен проб и стандарта.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

- Диапазон определяемых концентраций 0,1-50 мкг пестицидов в анализируемой пробе

- Предел обнаружения 0,0001-0,001 мкг в зависимости от исследуемого пестицида (см. табл. 2)

- Размах варьирования 77-113%

- Среднее значение определения стандартных количеств пестицидов - 92%

- Стандартное отклонение 12,7%

- Относительное стандартное отклонение 0,14

- Доверительный интервал среднего при p = 0,95 и .

Метод специфичен для соединений, угнетающих холинэстеразу.

2.2. Реактивы и растворы

Ацетон, х.ч.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а.

Н-гексан, х.ч.

Этиловый спирт ректификат

Бром

Натрий серноватистокислый - 0,1 М водный раствор (2,48 г растворяют в 100 мл воды).

Силикагель марки КСК, дробленный и просеянный через сито 100 меш.

Кальций сернокислый , ч.д.а., просушенный в сушильном шкафу при температуре 160°С в течение 6 часов

Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ-7П-57-69

Калий железосинеродистый - 0,05 М водный раствор (1,645 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды)

Калий железистосинеродистый - 0,05 М водный раствор (2,11 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды)

Буферный раствор рН - 8,69 - готовят смесь ортофосфорной (2,1 мл), уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с рН 8,69 к 100 мл указанной смеси прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который готовят растворением 0,800 г NaОН в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 мл.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота (свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора, фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.

Основной стандартный раствор (А) исследуемого фосфорорганического пестицида - 100 мкг/мл (10 мг пестицида в 100 мл ацетона).

Рабочие стандартные растворы готовят разбавлением основного раствора "А".

Раствор "Б" - 0,5 мл раствора "А" доводят в мерной колбе до 100 мл ацетоном (содержание пестицида составляет 0,5 мкг/мл).

Раствор "В" - 5 мл раствора "Б" доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание препарата 0,1 мкг/мл).

Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл буферного раствора, 2 мл раствора железосинеродистого калия и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед опрыскиванием. На пластинку расходуется 3-4 мл смеси.

2.3. Приборы и посуда

Ротационный испаритель тип ИР-1М

Баня водяная Термостат СШ-35

Ступка керамическая 7 см

Круглодонные или грушевидные колбы на шлифах емк. 25, 50 и 100 мл

Мерные пробирки на шлифах емк. 5-10 мл

Эксикаторы

Воронки фильтровальные - 5 см

Фильтры бумажные (красная лента)

Камера для хроматографирования

Камера для опрыскивания

Стеклянные пластинки размером 9х12 см

Пульверизаторы стеклянные

Компрессор или баллон с азотом или со сжатым воздухом для равномерного мелкодисперсного опрыскивания пластинок

Пипетки емк. 1 мл, 5 мл, 10 мл

Мерные колбы емк. 25 мл, 100 мл

Микрошприц на 10 мкл

Микропипетки до 0,1 мл

2.4. Подготовка к определению

Для приготовления пластинок из силикагеля КСК на 12 пластинок берут 35 г силикагеля, 2 г сернокислого кальция, подготовленного как описано выше, и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с сернокислым кальцием растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки строго в горизонтальном положении в течение 18-20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.

2.5. Ход анализа

2.5.1. Экстракция

Растительные продукты (овощи, фрукты, зерно, трава) - 25-50 г измельченной пробы (зерно не измельчают) дважды экстрагируют ацетоном, порциями по 10-15 мл и присоединяют его к фильтрату. Растворитель под вакуумом упаривают до 2-3 мл на ротационном испарителе при температуре водяной бани 40-45°С. Переносят остаток в мерную пробирку с притертой пробкой, ополаскивают ацетоном колбу для отгонки и доводят объем экстракта в пробирке до 5 мл.

Биологические субстраты (кровь, печень, почки, легкие, селезенка, мышечные ткани, жир, мозг, кал, моча). Для анализа берут 1-2 г материала, тщательно измельчают, помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 30 мл ацетона и оставляют на час, периодически встряхивая. Сливают ацетон декантацией, заливают пробу повторно и оставляют на 30 мин. Ацетоновые экстракты объединяют, сушат безводным сернокислым натрием (3-5 г) и упаривают растворитель, как описано выше.

2.5.2. Очистка экстрактов

Если после отгонки растворителя до 2-3 мл экстракт мутный, растворитель отгоняют под вакуумом при комнатной температуре досуха. Сухой остаток смывают охлажденным при 0°С ацетоном, смывы фильтруют через бумажный фильтр в мерную пробирку. Общий объем растворителя 5 мл. Ацетоновый экстракт выдерживают 10-15 мин при комнатной температуре, затем доводят объем в пробирке точно до 5 мл. Закрывают притертой пробкой и хорошо перемешивают.

2.5.3. Хроматография в тонком слое

С целью уменьшения краевого эффекта с хроматографической пластинки снимают с краев вдоль направления движения подвижной фазы (со стороны 12 см) по 2-3 мм слой сорбента. Затем вдоль этой же стороны пластинку разделяют полосами на 4 равные части. На 1-ю и 3-ю полосы на расстоянии 1,5 см от нижнего края наносят по 10 мкл стандартного раствора "Б" и "В", т.е. 0,001 мкг и 0,005 мкг действующего начала*, на 2-ю и 4-ю - 2 и 10 мкл соответственно пробы. Пластинку с нанесенными растворами помещают в хроматографическую камеру, в которую налита соответствующая смесь растворителей (табл. 1) за 30 мин до хроматографирования. Когда фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и дают растворителю испариться. Затем проводят ингибирование. Если необходима активация, пестициды на пластинке перед ингибированием активируют.

Таблица 1

Величина фосфорорганических пестицидов на силикагеле КСК

Пестицид	Подвижная фаза		Подвижная фаза
Фталофос	хлороформ	47	четыреххлористый углерод		24
Р = 0 фталофос	"	12	"		-
Цидеал	"	81	"		40
Фенкаптон	"	98	"		50
Фозалон	"	77	"		39
Метафос	"	79	гексан:ацетон 4:1		40
Метилнитрофос	"	91	"		43
Фенитрооксон	"	72	"		24
Карбофос	"	46	"		-
Байтекс	"	80	гексан:ацетон 9:1		37
Валексон	"	85	"		43
Абат	"	70	"		25
Цианокс	"	74	"	2:1	45
Рицид	"	30	-		-
Циодрин	"	78	"		47
Афуган	"	40	-		-
Хлорофос	"	0	гексан:ацетон 1:1		34
ДДВФ	"	13	"		56
Фосфамид	"	0	бензол:ацетон 3:2		55
Антио	"	0	"		85
Дибром	"	63	бензол:диоксан 9:1		53
Корал	"	90			68
ДДВФ	"	13			45

2.5.4. Активация слабых ингибиторов холинэстеразы

Для увеличения чувствительности определения слабые ингибиторы холинэстеразы (см. табл. 2) активируют путем перевода их в Р = 0 форму. Существуют следующие способы активации:

1. Эфиры тионфосфорной и дитиофосфорной кислоты:

а) окисление парами брома;

б) окисление раствором брома;

в) окисление УФ-светом.

Таблица 2

Пределы определения фосфорорганических пестицидов на силикагеле КСК

Пестицид	до активации	после активации
		пары брома	раствор брома	УФ-облучение	раствор аммиака
Фталофос	н.о.	1	0,1	0,1
Р = 0 фталофос	0,1	0,1	0,1	0,3
Цидеал	н.о.	5	1	5
Фенкаптон	н.о.	10	5	5-10
Фозалон	н.о.	1	5	5-10
Метафос	н.о.	1	0,2	5
Метилнитрофос	н.о.	3	0,2	5
Фенитрооксон	1,0	-	-	-
Карбофос	н.о.	50	0,5	10
Байтекс	н.о.	100	100	н.о.
Валексон	н.о.	10	1-5	н.о.
Абат	н.о.	5-10	5	10-20
Цианокс	н.о.	1	1	5
Рицид	0,1	0,1	0,1	-
Циодрин	0,1	-	-	-
Афуган	н.о.	1	0,3	2
Хлорофос	1000	1000	1000	н.о.	10
ДДВФ	10	н.о.	10	н.о.	10
Фосфамид	н.о.	500	500	10
Антио	н.о.	500	500	10
Корал	н.о.	10	10	10
Дибром	10	-	-	-	10

______________________________

н.о. - не обнаружено при максимальной концентрации 10000 нг

2. Эфиры фосфоновой кислоты типа хлорофоса - активация аммиаком.

Окисление в парах брома. После хроматографирования и удаления растворителя с пластинки ее помещают на 1 мин в эксикатор, насыщенный парами брома. После удаления избытка брома с пластинки ( мин) проводится ингибирование. Чувствительность определения для ряда пестицидов с применением этого и других способов активации приведена в таблице 2.

Окисление водным раствором брома. После хроматографирования и удаления растворителя с пластинки ее опрыскивают насыщенным водным раствором брома до слабого увлажнения слоя. После 15 мин экспозиции при комнатной температуре избыточный бром удаляется легким опрыскиванием пластинки 0,1 М раствором тиосульфата натрия. Далее проводится ингибирование.

Окисление под УФ-светом. После хроматографирования и испарения растворителя с пластинки ее помещают на 15-20 мин под УФ-свет (лампа ПРК-4) на расстоянии 20 см от источника света. Далее проводится ингибирование.

Активация аммиаком (для эфиров фосфоновой кислоты типа хлорофоса) - пластинки после хроматографирования и удаления растворителя с пластинки опрыскивают разбавленным раствором аммиака (1 часть аммиака + 4 части воды) до слабого увлажнения слоя. Экспозиция 15 мин при комнатной температуре. Далее проводится ингибирование.

2.5.5. Проведение ингибирования

После активации и высушивания при комнатной температуре пластинки опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют в течение 40-60 мин в насыщенном водными парами термостате при температуре 38°С. (Для увлажнения в термостате ставят чашку Петри с водой).

2.5.6. Проявление пластинок

После инкубации пластинки опрыскивают проявляющим раствором и помещают в термостат при 38°С. Пестициды проявляются в течение 10-30 мин в виде белых пятен на голубом фоне. Чувствительность обнаружения в зависимости от пестицида 0,0001-0,001 мкг.

Количественное определение проводят путем сравнения площади пятна пробы с наиболее близкой к ней по величине площадью стандарта.

Прямопропорциональная зависимость площади пятна от концентрации соблюдается для большинства пестицидов в пределах 0,0001 мкг до 0,1 мкг.

2.6. Обработка результатов

Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле:

, где

A - содержание препарата в стандарте, мкг

- площадь пятна стандарта,

- площадь пятна пробы,

- объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл

V - общий объем экстракта, мл

P - масса пробы, взятой для анализа, г.

2.7. Настоящие методические указания разработаны М.В. Письменной, ВНИИ гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс, г. Киев.

3. Требования безопасности

Соблюдаются требования безопасности обычно рекомендуемые для работы с химическими реактивами.

Литература

1. ...; ... 44,2, 414 (1969)

2. ... 43, р. 105-123 (1972)

______________________________

* Если пределы обнаружения пестицидов больше 1 нг (см. табл. 2), стандартные растворы "Б" и "В" наносят либо в больших объемах (0,1 мл), либо готовят их с большим содержанием пестицидов

Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР

А.И. Заиченко