Временные методические указания по определению хлорорганических пестицидов (ДДТ, ДДЭ, ДДД, альфа- и гамма-ГХЦГ) в рыбе и рыбной продукции методом газожидкостной хроматографии (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 22 октября 1981 г. N 2482-81)

1. Краткая характеристика препаратов

Краткая характеристика препаратов изложена в книге "Методы определения микроколичеств пестицидов" издательство "Колос", 1977 г.

2. Методика определения хлорорганических пестицидов в рыбе и рыбной продукции

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении пестицидов из пробы органическим растворителем, очистке экстракта и определении содержания пестицидов методом газожидкостной хроматографии.

2.1.2. Метрологическая характеристика

Метрологическая характеристика дана в таблице 1.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода определения хлорорганических пестицидов газожидкостной хроматографией при n = 5, доверительной вероятности

Препарат	Предел обнаружения, мг/кг	Среднее значение определения, %	Средняя квадратичная ошибка единичного измерения, Sn	Средняя квадратичная ошибка среднего арифметич.	Коэффициент вариации единичного измерения, %	Доверительный интервал, % W	Относительная погрешность измерения, %
Альфа-ГХЦГ	0,003	85,50	2,35	1,08	3,90	3,00	4,90
Гамма-ГХЦГ	0,002	62,60	6,88	3,08	10,99	8,56	13,67
ДДД	0,009	82,00	8,12	3,63	9,91	10,09	12,30
ДДТ	0,020	70,25	5,85	2,92	8,33	8,12	11,56
ДДЭ	0,007	69,60	8,17	3,66	11,74	10,17	14,61

Чувствительность метода мкг.

Предел обнаружения 0,002 мг/кг анализируемой пробы.

2.1.3. Избирательность метода

Другие хлорорганические пестициды (альдрин, дильдрин, гептахлор и др.) определению не мешают.

2.2. Реактивы и растворы

Гексан х.ч. ТУ 6-09-3375-78.

Эфир петролейный по ГОСТ 11992-66 (температура кипения от +40 до 60°С), ч.

Бензол по ГОСТ 5955-75, х.ч.

Судан IV по ТУ 711-47-69, ч.д.а.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-66, х.ч., высушенный при температуре +150°С в течение 5 ч.

Силикагель марки АСКГ (активированный силикагель крупнопористый гранулированный) по ГОСТ 3956-76 с размером зерен 0,20-0,50 мм, высушенный при температуре от +150°С до +180°С.

Спирт этиловый технический по ГОСТ 17229-78 марки А.

Ацетон по ГОСТ 2603-79, х.ч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72, не содержащая хлоридов.

Стандарты хлорорганических пестицидов.

Хроматом N-AW-ДМСS, пропитанный 5% SE-30 (импортный), размер частиц 0,160-0,200 мм.

Хроматон N-AW-ДМСS , пропитанный ПФМС-4, размер частиц 0,125-0,160 мм.

2.3. Приборы и посуда

Газовый хроматограф "Цвет-106" (c детектором электронного захвата или другой прибор подобного типа).

Мясорубка с диаметром отверстий решетки 3 мм.

Гомогенизатор или измельчитель тканей.

Аппарат для встряхивания.

Прибор для отгонки органических растворителей по МРТУ 42-2589-66 или ротационный испаритель типа УЛ-042 25У4 по ГОСТ 10800-77 (или другой подобного типа).

Насос вакуумный масляный или водоструйный лабораторный стеклянный по ГОСТ 10996-75.

Аппарат экстракционный (аппарат Сокслета).

Баня водяная по ТУ 61-1-423-72.

Весы лабораторные рычажные по ГОСТ 24104-80 Е.

Колонки хроматографические стеклянные размером 450х20 мм.

Микрошприц вместимостью 10 мкл.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556-75, обезжиренная в аппарате Сокслета.

Воронка химическая по ГОСТ 8613-75 с диаметром 3,5-4,5 см.

Воронка для сыпучих веществ по ГОСТ 8682-70 с нормальным шлифом N 29.

Груша резиновая.

Колбы мерные по ГОСТ 1770-74 Е вместимостью 50, 100 и 200 .

Колбы отгонные круглодонные со шлифом N 14 по ГОСТ 17004-71 вместимостью 100, 150 и 500 .

Молоточек деревянный.

Пипетки по ГОСТ 20292-74 Е вместимостью 1; 2; 5; 10; 15; 20 и 25 .

Палочка стеклянные.

Лопаточки стеклянные.

Пробирки мерные стеклянные по ГОСТ 10515-75 вместимостью 5 и 10 .

Стаканы химические по ГОСТ 10394-72 вместимостью 150 и 200 .

Цилиндры мерные по ГОСТ 1770-74 вместимостью 25, 50, 100 и 150 .

Шпатель фарфоровый по ГОСТ 9147-73.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Проверка чистоты бензола, гексана и петролейного эфира.

Бензол, гексан в петролейный эфир проверяют на чистоту на газовом хроматографе. Для этого 50 каждого растворителя упаривают до объема 5 . Для анализа берут 5 мкл. Появление на хроматограмме дополнительного пика свидетельствует о недостаточной чистоте растворителя.

Очистку растворителей проводят перегонкой над азотнокислым серебром или активированным углем (1 ) отбирая фракции, выделяющиеся: для гексана - при температуре от +60 до +70°С; для петролейного эфира - от +40 до +60°С; для бензола - от +78 до +81°С.

2.4.2. Проверка чистоты силикагеля АСКГ.

Силикагель промывает 50 петролейного эфира и растворитель отбрасывают. Следующую порцию растворителя пропускают через силикагель, отжимают грушей в отгонную колбу и упаривают до объема 5 . Для анализа берут 5 мкл. Появление на хроматограмме дополнительного пика свидетельствует о том, что силикагель загрязнен.

Очистку силикагеля проводят бензолом или смесью бензола и петролейного эфира (1 + 1). Силикагель заливают бензолом (смесью) и выдерживают 1 сутки. Затем бензол (смесь) отгоняют под вакуумом, а силикагель высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

Все органические растворители, остающиеся после упаривания проб и промывки колонок, могут использоваться повторно после перегонки над активированным углем или азотнокислым серебром (1 ).

2.4.3. Проверка активности силикагеля*(1).

0,5 1%-ного спиртового раствора судана IV растворяют в 1 г жира, прибавляют 1 раствора пестицидов в гексане (с содержанием 0,1 нг по гамма-ГХЦГ), объем доводят гексаном до 20 и вносят на колонку с 80 силикагеля АСКГ предварительно промытого петролейным эфиром (50 ).

Через 20 минут после стекания последней капли растворитель отжимают, а пестициды элюируют 110 смеси бензол-петролейный эфир (в соотношении 30 + 80).

Неокрашенный элюат собирают в отгонную колбу вместимостью 150 , упаривают до 0,1 и переносят в мерную пробирку трижды промыв колбу гексаном. Объем доводят гексаном до 5 . 5 мкл этого раствора вводят в газовый хроматограф. Если содержание пестицидов близко к внесенному, считают активность силикагеля достаточной.

В случае недостаточной активности силикагель АСКГ активируют высушиванием при +120°С в течение 2 часов.

2.4.4. Приготовление стандартных растворов.

2.4.4.1. Раствор А.

20 мг гамма-ГХЦГ и 30 мг альфа-ГХЦГ растворяют в 50 н-гексана. Полученный раствор разводят в 10 раз.

В 1 раствора содержится 40 мкг гамма-ГХЦГ и 60 мкг альфа-ГХЦГ.

2.4.4.2. Раствор Б.

14 мг ДДЭ, 18 мг ДДД и 40 мг ДДТ растворяют в 100 гексана.

В 1 раствора содержится соответственно 140, 180 и ...

2.4.4.3. Основной раствор.

Основной раствор получают путем смешивания 2 стандартного раствора А и 2 стандартного раствора Б. Объем доводят н-гексаном до 200 . Полученный раствор содержит в 5 мкл (нг): гамма-ГХЦГ - 2,0; альфа-ГХЦГ - 3,0; ДДЭ - 7,0; ДДД - 9,0; ДДТ - 20,0.

2.4.4.4. Приготовление рабочих растворов.

Раствор N 1

10 основного раствора вносят в мерную колбу вместимостью 200 , доводят до метки н-гексаном. 1 полученного раствора содержит 20 нг гамма-ГХЦГ. В 5 мкл содержится 0,1 нг гамма-ГХЦГ.

Раствор N 2

35 раствора N 1 соединяют с 15 н-гексана. 1 полученного раствора содержит 14 нг. В 5 мкл содержится 0,07 нг гамма-ГХЦГ.

Раствор N 3

20 раствора N 1 соединяют с 20 н-гексана. 1 полученного раствора содержит 6 нг. В 5 мкл содержится 0,05 нг гамма-ГХЦГ.

Раствор N 4

15 раствора N 1 соединяют с 35 н-гексана. 1 полученного раствора содержит 10 нг. В 5 мкл содержится 0,03 нг гамма-ГХЦГ.

2.4.5. Подготовка хроматографа к работе.

При работе на хроматографе "Цвет-106" или другом приборе с детектором электронного захвата применяется спиралеобразная колонка длиной 1 м и диаметром 4 мм, заполненная смесью хроматона N-АW-ДМСS, пропитанный 5%-ным SЕ-30 с размером частиц 0,160-0,200 мм и хроматона N-AW-ДМСS, пропитанного ПФМС-4 с размером частиц 0,125-0,160 мм в соотношении 1 + 4.

Температура термостата колонок должна быть от +190 до +210°С, детектора +240°С, а испарителя +230°С. Скорость поддува газа-носителя (азот особой чистоты) на детектор 80 . Скорость газа-носителя через колонку - 75 . Рабочая шкала электрометра А. Быстродействие - 0,5 с.

Время удерживания хлорорганических пестицидов при условиях хроматографирования на данном хроматографе:

альфа-ГХЦГ - 1 мин;

гамма-ГХЦГ - 1 мин 15 с;

п.п' - ДДЭ - 4 мин 20 с;

п.п' - ДДД - 5 мин 40 с;

п.п' - ДДТ - 7 мин 15 с.

2.4.6. Отбор проб.

Отбор проб производят в соответствии с методическими указаниями Минздрава СССР N 2051-79, утвержденными зам. Главного государственного санитарного врача СССР А.И. Заиченко 25 августа 1979 г.

2.5. Проведение определения

2.5.1. Подготовка пробы

Рыбу очищают от чешуи, внутренних органов и разделывают на филе. Исследуемый образец (филе)*(2) массой около 250 г измельчают 1-3 раза на мясорубке (в зависимости от консистенции ткани) с решеткой, имеющей отверстия диаметром 3 мм и тщательно перемешивают. Для более тонкого измельчения образца (кроме жировой ткани) фарш дополнительно рекомендуется измельчать в гомогенизаторе.

Пробу печени морских млекопитающих массой 100-200 г измельчают на мясорубке, тщательно перемешивают и в случае необходимости дополнительно измельчают в гомогенизаторе.

Жирную печень рыб (например, печень трески и др.) предварительному измельчению не подвергают.

Пробу жира разогревают до температуры, предусмотренной стандартом при определении прозрачности (+40 - +60°С) в зависимости от вида жира, тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в чистую сухую пробирку (колбу) с притертой пробкой.

2.5.2. Извлечение пестицидов

2.5.2.1. Из сырья жирного и средней жирности

Навеску исследуемого образца массой 10 г (содержание жира в навеске не должно превышать 1 г; масса чистого жира не более 1 г)*(3), взвешенную с погрешностью не более 0,01 г*(4), растирают по частям в чистой фарфоровой ступке, добавляя порциями безводный сернокислый натрий (в соотношении 1 + 4), до получения рассыпчатой массы, переносят ее в плоскодонную колбу с притертой пробкой, заливают в нее гексан или другой растворитель (ацетон, хлороформ, эфир петролейный и др.) в количестве в 2 раза большем по отношению к массе навески с сернокислым натрием и встряхивают в аппарате 1 ч. После этого смесь фильтруют в мерный цилиндр вместимостью 100 через воронку Бохнера с бумажным фильтром, трижды промывают осадок растворителем и доводят до фиксируемого объема. Отжатие растворителя производят под вакуумом (300 мм ртутного столба).

2.5.2.2. Из тощего сырья (менее 3% жира)

При исследовании тощего сырья морских животных (рыба, млекопитающие, беспозвоночные) экстракцию липидов проводят следующим образом: 10-25 г измельченного образца (рекомендуется измельчение навеска производить в гомогенизаторе) тщательно перетирают с сернокислым натрием (до получения рассыпчатой массы) и трижды экстрагируют петролейным эфиром или гексаном (порциями, из расчета трех объемов на 1 весовую часть). Экстракты собирают в делительную воронку, промывают 3 раза 2%-ным раствором сернокислого натрия порциями по 40 . Промытый экстракт сушат над безводным сернокислым натрием, переносят в мерный цилиндр и доводят объем до 30 .

2.5.2.3. Из сухих продуктов.

При исследовании сухих продуктов (рыбная кормовая мука, сухие белковые концентраты, водоросли и др.) экстракцию пестицидов проводят ацетоном трехкратно, нагревая смесь до закипания растворителя. Экстракты объединяют, ацетон отгоняют на ротационном испарителе, а остаток растворяют в гексане.

Для выделения пестицидов из липидов в стеклянную колонку (450х20 мм) помещают около 500 мг обезжиренной ваты и насыпают 70-75 силикагеля АСКГ. Абсорбент уплотняют постукиванием деревянным молоточком, промывают 50 петролейного эфира (температура кипения +40 - +70°С) и отжимают с помощью резиновой груши.

На колонку вносят по 25 экстракта или раствора пестицидов в жире, подготовленных, как указано выше, дают жидкости стечь и снова абсорбент отжимают. Прошедший через колонку растворитель отбрасывают.

Пестициды элюируют в круглодонную отгонную колбу ротационного испарителя вместимостью 150 смесью бензола и петролейного эфира (30 + 80), которую вносят порциями по 20-30 . Через 10 минут после стекания последней капли растворителя вновь отжимают абсорбент. Элюат концентрируют до 0,1 . Концентрированный элюат переносят гексаном в мерную пробирку, ополаскивая отгонную колбу не менее трех раз небольшим количеством гексана, и доводят объем до 5 или 10 .

2.5.3. Проведение испытания

Из пробирки микрошприцем, тщательно промытым гексаном, отбирают 5 мкл раствора пестицидов и вводят их в колонку газового хроматографа, предварительно подготовленного к работе. Получают хроматографическую запись.

В случае возникновения сомнения, что в исследуемом образце присутствуют полихлорированные бифенилы, дальнейшие исследования проводят в соответствии с методическими указаниями N 1792 по определению хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов при их совместном присутствии в объектах внешней среды, утвержденных 18 ноября 1977 года.

2.6. Обработка результатов

Содержание хлорорганических пестицидов X в пробе (мг/кг) вычисляют по формуле:

,

где h - высота пика пробы, см;

- высота пика стандартного раствора, см;

C - количество пестицидов, введенное в хроматограф со стандартным раствором, нг (см. таблицу 2);

V - общий объем рабочей пробы раствора пестицидов, ;

- объем раствора пестицидов рабочей пробы, взятой для анализа, мкл;

m - масса навески исследуемого образца, г (при взятки аликвотной части экстракта липидов масса навески должна быть уменьшена соответственно кратности аликвотной части).

Таблица 2

Содержание пестицидов в стандартных растворах, нг

Номер раствора	Объем, мкл	Содержание
		альфа-ГХЦГ	гамма-ГХЦГ	ДДЭ	ДДД	ДДТ
1	5	0,150	0,100	0,350	0,450	1,000
	4	0,120	0,080	0,280	0,360	0,800
	3	0,090	0,060	0,210	0,270	0,600
2	5	0,105	0,070	0,245	0,315	0,700
	4	0,084	0,056	0,186	0,252	0,560
	3	0,063	0,042	0,147	0,180	0,420
3	5	0,075	0,050	0,175	0,225	0,500
	4	0,060	0,040	0,140	0,180	0,480
	3	0,045	0,030	0,105	0,135	0,300
4	5	0,045	0,030	0,105	0,135	0,300
	4	0,036	0,024	0,084	0,108	0,240
	3	0,027	0,018	0,063	0,081	0,180
5	5	0,015	0,010	0,035	0,045	0,100

2.7. Требования безопасности

Необходимо соблюдать требования по технике безопасности, принятые при работе с органическими растворителями.

3. Авторы

Настоящие методические указания подготовлены сотрудниками Всесоюзного научно-исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО) заведующим лабораторией техно-химического контроля производства рыбных продуктов кандидатом технических наук Головиным Анатолием Никифоровичем и младшим научным сотрудником Конищевой Еленой Николаевной.

______________________________

*(1) - разработано в бывшей Центральной Исследовательской лаборатории "Центрэкспертпродимпорт".

*(2) - наличие кожи указывается

*(3) - при содержании жира в пробе более 1 г на колонку с силикагелем берется аликвотная часть экстракта липидов.

*(4) - взвешивание жира проводят с погрешностью не более 0,001 г.

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

А.И. Заиченко