Методические указания по биотестированию природных и сточных вод (утв. министром охраны окружающей среды и природных ресурсов РТ А.И.Щеповских 30 мая 1997 г.)

"Утверждаю"

Министр охраны окружающей среды

и природных ресурсов РТ А.И.Щеповских

от 30 мая 1997 г.

Методические указания
по биотестированию природных и сточных вод

Разработаны: ЦСИАК Министерства охраны окружающей среды и природных ресурсов РТ; ЛХБИ ИОФХ КНЦ РАН; ЛЭБ КГУ.

Исполнители: Зобов В.В., к.б.н. (ЛХБИ), Степанова Н.Ю. (ЦСИАК), Петров А.М., к.б.н. (ЦСИАК), Селивановская С.Ю., к.б.н. (ЛЭБ), Шагидуллин Р.Р., к.ф-м.н. (ЦСИАК).

Вводимое в 1997 году в Российской Федерации постановление по взиманию платы за сброс возвратных вод с учетом их токсичности, необходимость интенсификации работы биологических очистных сооружений требуют освоения и внедрения методов биотестирования в практику контроля за качеством сточных и природных вод.

Методические указания составлены с учетом практического опыта биотестирования и предназначены для сотрудников региональных инспекций Минприроды РТ и ведомственных лабораторий, контролирующих качество природных и сточных вод, работу биологических очистных сооружений и включают: методы определения острого токсического действия вод при кратковременном биотестировании на ракообразных (Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis), инфузориях (Раrаmеcium cuadatum); методы определения острого и хронического токсического действия вод на водорослях (Scenedesmus quadricauda).

Содержание

Введение

Создание системы экологического мониторинга, необходимость которого обусловлена неблагоприятными изменениями в биосфере под действием синтетических соединений, позволяет не только оценивать спектр токсического действия загрязняющих веществ на различные группы организмов, но и моделировать их воздействие на экосистемы в целом.

Несовершенство существующих подходов к экологической оценке различных объектов, основанных на трудоемком и длительном химико-аналитическом определении концентраций отдельных групп и индивидуальных веществ, требует использования интегральных оценочных показателей, которые с максимальной надежностью могут оперативно охарактеризовать экологическую опасность комплекса загрязнителей. Таким интегральным показателем является токсичность. Необходимостью получения достоверных данных о токсичности, адекватных реальной ситуации, объясняется возросший интерес к биологическим тест-объектам. Этот выбор определяется тем, что гидробионты являются, во-первых, характерными представителями биоценозов водоемов и активных илов, во-вторых, используются в качестве индикаторных организмов при оценке состояния искусственных и природных экосистем.

1. Общие положения

Методические указания по биотестированию воды разработаны с целью обеспечения специалистов лабораторий системы Министерства охраны окружающей среды и природных ресурсов РТ, а также отраслевых лабораторий, контролирующих качество природных и сточных вод, работу биологических очистных сооружений пособием для оценки токсичности вод методами биотестирования.

В соответствии с п.5.7 и положением N 1 Правил охраны поверхностных вод (1991 г.) биотестирование является обязательным элементом системы оценки и контроля качества воды [1, 2].

Данные указания включают: методики определения острого токсического действия вод при кратковременном биотестировании на ракообразных, водорослях и инфузориях; метод определения хронического токсического действия вод на водорослях.

2. Биотестирование на ракообразных

Методика предназначена для определения острой токсичности природной и сточной воды, сбрасываемой в водоемы.

2.1. Принципы культивирования рачков Daphnia magna Straus и
Ceriodaphnia affinis Lilljeborg

Период созревания Daphnia magna до вымета молоди при оптимальной температуре и хорошем питании занимает 5-10 суток. Продолжительность жизни 110-150 суток, при температурах свыше 25°С она может сокращаться до 25 суток.

При оптимальных условиях содержания партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 суток. У молодых дафний число яиц в кладке 10-15, затем оно возрастает до 30-40 и более, снижаясь до 3-8 и до 0 за 2-3 суток до смерти.

Культуру дафний выращивают в термостатируемом при 18-22°С люминостате (освещенность 400-600 люкс, продолжительность светового дня 12-14 часов). Опыты по биотестированию вод желательно проводить в том же люминостате.

Для культивирования дафний используют "биологизированную" аквариумную воду со следующими параметрами: рН 7-8 (граничные значения рН от 6 до 9), жесткость общая 3-4 мг-экв/л, соотношение Ca/Mg 4:1, концентрация растворенного кислорода не менее 6-7 мг/л (граничное значение 2 мг/л).

Культуру дафний содержат в стеклянных емкостях объемом 1-5 литров, оптимальная плотность взрослых рачков 100-150 особей на 1 литр. Скорость созревания маточной культуры сильно зависит от ее исходной плотности. Наилучшие условия создаются при суточном вылове 20-30% народившейся молоди.

Каждые 7-20 суток культуру дафний обновляют в обязательном порядке. Для этого отбирают 20 половозрелых самок (яйца в выводковой камере) и помещают в индивидуальные сосуды, заполненные водой из расчета 10-100 мл на одну особь. Выметанную самками одновозрастную молодь изымают из сосудов, часть используют для биотестирования, а оставшуюся продолжают культивировать.

Кормом для дафний служат зеленые водоросли (хлорелла или сценедесмус) и хлебопекарные дрожжи. Суспензию водорослей периодически вносят в среду для культивирования дафний в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Допустимый размер клетки водоросли для кормления взрослых рачков 40-50 мкм.

В природе ведущее значение в питании рачков имеют бактерии, поэтому 1-2 раза в неделю дафний нужно подкармливать дрожжевым кормом: 1 г свежих дрожжей (или 0,3 г сухих) залить 100 мл дистиллированной воды, после набухания перемешать и отстоять 30 минут, кормить надосадочной жидкостью из расчета 3 мл на 1 л воды. Оптимальной является концентрация бактерий не менее 1 млн./1 куб.см воды. Если численность бактерий падает до 200 тыс./1 куб.см и ниже наступление половой зрелости задерживается и в пределе становится невозможной. Избыток бактерий - более 3-5 млн./1 куб.см - также вреден.

Фильтрация пищи рачками идет непрерывно. При этом они не способны отсортировывать съедобные частицы от несъедобных. Поэтому взмучивание ила на дне сосуда с дафниями недопустимо (ил забивает фильтрационный аппарат рачков и они гибнут). Другим неблагоприятным моментом в культивировании рачков является чрезмерное накопление сброшенных панцирей (карапаксов), возникающее из-за чрезмерной численности рачков, что ведет к полному исчезновению культуры.

Поскольку пол партеногенетического яйца определяется всего за 15 минут до его выхода из половой системы самки, то любое кратковременное отклонение от нормальных условий жизни может изменить процесс партеногенетического размножения рачков. Если в этот момент рачки испытывают неблагоприятное воздействие, из их яиц выводятся самцы, неудобные для биотестирования.

Для получения исходного материала для биотестирования 30-40 самок с выводковыми камерами, полными яиц или зародышей, за 1 сутки до биотестирования пересаживают в емкости объемом 0,5-2 л. После появления молоди их отделяют от взрослых особей с помощью капроновых сит с разным диаметром пор.

Принципы культивирования цериодафний аналогичны описанным для дафний. Следует помнить, что цериодафнии более требовательны к содержанию кислорода в воде (не менее 5 мг/л), оптимальная температура культивирования 23-27°С. Период созревания рачков от рождения до момента вымета молоди короче, чем у дафний - от 4 до 5 суток. Вымет молоди происходит ежесуточно или 1 раз в двое суток: первый помет - 2-6 особей. Максимальное количество молоди получают от 7-20-дневных самок - до 10 особей. Раз в сутки цериодафний кормят суспензией дрожжей (5 мл суспензии на 1 л воды), раз в неделю - суспензией водорослей (хлорелла или сценедесмус) [3, 4].

Для получения одновозрастных цериодафний из основной культуры отлавливают 20 половозрелых самок и помещают их по одной в отдельные сосуды емкостью 15 мл.

Критерием токсичности при биотестировании на рачках является гибель 50% и более особей за период 96 часов (дафнии) или 48 часов (цериодафнии) в тестируемой воде по сравнению с контролем [2, 4].

При биотестировании важно учитывать следующие моменты [5]:

- Молодь рачков в 4-5 раз более чувствительна к действию токсикантов, чем взрослые особи.

- Кормление рачков во время острого опыта уменьшает токсичность примерно в 4 раза.

- В мягкой воде токсичность веществ повышается. Ионы магния обычно уменьшают токсичность солей, ионы кальция - снижают токсичность.

- Присутствие комплексообразующих веществ (гуминовые кислоты, аминокислоты и т.п.) увеличивает накопление токсикантов, но снижает их токсичность.

- Дефицит кислорода в воде ускоряет накопление токсических веществ в водной среде.

- Солнечный свет увеличивает токсичность в основном за счет возрастания количества свободных радикалов.

2.2. Культивирование хлореллы (корм для рачков)

Приготовить маточные водные растворы:

KN03 - 25%, КН2РО4 - 12,5%, MgSO4 - 12,2%, FeSO4 х 7H2O - 1%.

Приготовить 2 маточных раствора микроэлементов (А и Б): Для этого взвесить и затем последовательно растворить в 250 мл дистиллированной воды 0,71 г Н3ВО3, 0,45 г МnСl2 х 4Н2О, 0,055 г ZnSO4 х 7H2O - (раствор А).

Взвесить и последовательно растворить в 250 мл дистиллированной воды 4,41 мг МоО3, 5,74 мг NH4VO3 - (раствор Б).

Приготовить 1000 мл среды тамия путем последовательного приливания в 1 л мерную колбу следующих объемов маточных растворов:

KNO3 (25%-раствор) - 20 мл

КН2РО4 (12,5%-раствор) - 10 мл

MgSO4 (12,2%-раствор) - 10 мл

FeSO4 х 7H2O (1%-раствор) - 1 капля

Раствор А - 1 мл.

Раствор Б - 1 мл.

Довести объем раствора дистиллированной водой до 1 литра.

Разбавить полученную концентрированную среду тамия в 5 раз: к 100 мл концентрированной среды тамия добавить 400 мл дистиллированной воды; или к 200 мл среды тамия 800 мл дистиллированной воды, и т.д.

Засеять разбавленную в 5 раз среду тамия 5-10-дневной хлореллой (до светло-зеленого окрашивания; 200 тыс.клеток/мл).

Разлить приготовленные растворы среды тамия по колбам емкостью 1-2 литра. Обеспечить непрерывную продувку воздуха через культуру и 12-часовой цикл освещения с интенсивностью 2000-3000 люкс (температура 18-20°С).

Через 3-7 суток сгустить культуру (например, путем отстаивания в течение 2-3 суток в холодильнике для получения суспензии клеток).

Хлореллу вносят в культуру дафний ежедневно из расчета 1 мл суспензии на 1 л воды, поддерживая концентрацию клеток в среде на уровне 200 тыс. в 1 мл. Суспензию (концентрат) хлореллы можно хранить в холодильнике не более 3 недель [2], маточные растворы - до 1 месяца.

2.3. Определение устойчивости Daphnia Magna Straus к бихромату калия

Прежде всего необходимо оценить пригодность лабораторной культуры дафний для последующего биотестирования вод. Эталонным токсикантом служит бихромат калия.

Материалы

Стакан емкостью 100-250 мл (21 штука).

Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке). Колба для разбавляющей (контрольной) воды (РВ) емкостью 3 л. Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), на 250 мл (1 шт.), на 500 мл (2 шт.), на 1000 мл (1 шт.).

210 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Приготовить 100 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 (1000 мг/л).

Для этого 0,1 г просушенного К2Сr2О7 растворить в 100 мл дистиллированной воды.

Расставить 21 стакан с надписями по следующей схеме:

     К1    0,25   мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л   3 мг/л

     К2    0,25   мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л   3 мг/л

     КЗ    0,25   мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л   3 мг/л

Из 0,1% маточного раствора К2Сг2О7 приготовить серию растворов с концентрациями 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3 мг/л по следующей схеме: (При всех последующих разведениях используется только профильтрованная биологизированная вода (РВ) из аквариумов с водной растительностью).

а) 1 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 999 мл РВ = 1л (1 мг/л). Из 1 литра полученного раствора 300 мл разливается поровну по трем стаканам с надписью 1 мг/л.

б) Оставшиеся 700 мл раствора (1 мг/л) идут на приготовление растворов с концентрациями 0,25 и 0,5 мг/л по следующей схеме:

125 мл 1 мг/л + 375 мл РВ = 500 мл (0,25 мг/л) (300 мл разливают по трем стаканам с надписью 0,25 мг/л),

250 мл 1 мг/л + 250 мл РВ = 500 мл (0,5 мг/л) (300 мл разливают по трем стаканам с надписью 0,5 мг/л).

в) 1 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 499 мл РВ = 500 мл 2 мг/л (300 мл разливают по трем стаканам с надписью 2 мг/л)

г) 1,5 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 498,5 мл РВ = 500 мл 3 мг/л. Из 500 мл полученного раствора 300 мл разливается по трем стаканам с надписью 3 мг/л.

д) Оставшиеся 200 мл раствора (3 мг/л) идут на приготовление раствора с концентрацией 0,75 мг/л по следующей схеме:

125 мл 3 мг/л + 375 мл РВ = 500 мл (0,75 мг/л)(300 мл разливают по трем стаканам с надписью 0,75 мг/л).

е) В стаканы К1-КЗ (контроль) разливают по 300 мл биологизированной воды.

Стаканы с растворами расставить в люминостате. Произвести замеры температуры в люминостате (норма 18-22°С), рН растворов (норма 6,5-8,5), концентрации растворенного кислорода (перед началом опыта около 6 мг/л, в конце опыта - не менее 2 мг/л). Если начальная концентрация растворенного кислорода ниже 6 мг/л, то перед разливом растворов осуществляется их аэрация до достижения концентрации растворенного кислорода 7-8 мг/л. Аэрация может быть осуществлена с помощью аквариумного микрокомпрессора. Режим освещения в люминостате - 12-часовой с интенсивностью 400-600 люкс [1, 2].

Посадка рачков

Во все стаканы с растворами посадить по 10 рачков в возрасте строго 4-24 часа. Посадку производить с помощью микропипеток со съемными пластиковыми наконечниками. Концы наконечников предварительно необходимо обрезать под величину дафнии одно-двухдневки.

Эксперимент

Подсчет выживших рачков производят визуально через 24 часа. Во время опыта рачков не кормят. Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%. Результаты заносят в протокол опыта (табл.2.1).

Таблица 2.1

Протокол опыта

Дата ___________ Температура, рН, концентрация О2 (в  начале  и  в  конце

опыта)___________________________________________________________________

Время от на- чала опыта	Количество выживших дафний (экз.)
	Контроль	0,25 мг/л	0,5 мг/л	0,75 мг/л	1 мг/л	2 мг/л	3 мг/л
	_ 1 2 3 Xk	_ 1 2 3 Хо	_ 1 2 3 Хо	_ 1 2 3 Хо	_ 1 2 3 Хо	_ 1 2 3 Хо	_ 1 2 3 Хо
24 ч	10 10 10 10	9 9 9 9	8 9 8 8,3	6 6 6 6	5 5 6 5,3	4 5 4 4,3	2 2 2 2

Обработка результатов

Смертность рачков в процентах к контролю (А) рассчитывается по формуле [2]:

                                 _    _

                                (Xk - Хо)

                          А = ------------- х 100, где

                                   _

                                   Xk

     _

     Xk - среднее арифметическое количества рачков, выживших в контроле,

     _

     Хо - среднее арифметическое количества рачков, выживших в опыте.

Результаты опытов за 24 часа наносятся на график:

"График "Концентрация K2Cr2O7, мг/л"

Из графика находят ЛК50 - концентрацию вещества, вызывающую гибель 50% особей. Для бихромата калия величина ЛК50 должна лежать в диапазоне 0,9 - 2,0 мг/л. В этом случае тест-культура дафний пригодна для определения токсичности вод [1, 2].

Более подробную характеристику токсичности бихромата калия (или любого другого индивидуального химического соединения) можно получить используя специальную программу "Биостат"-ЦСИАК (тест Литчфильда-Уилкоксона в модификации Рота) [6]:

Пример (по данным таблицы 2.1): ЛК50 = 1,23596, ЛК16 = 0,37877, ЛК84 = 4,03307, S-функция (наклон кривой) = 3,26309.

                        ЛК84/ЛК50 + ЛК50/ЛК16

                   S = -----------------------

                                  2

2.4. Определение устойчивости Ceriodaphnia Affinis к бихромату калия

Материалы

Стакан емкостью 50-100 мл (28 штук).

Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке).

Колба для разбавляющей (контрольной) воды (РВ) емкостью 3-5 л.

Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), на 250 мл (1 шт.), на 500 мл (2 шт.).

140 рачков в возрасте 0,1-8 часов. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Приготовить 100 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 (1000 мг/л).

Для этого 0,1 г просушенного К2Сr2О7 растворить в 100 мл дистиллированной воды.

Расставить стаканы с надписями по следующей схеме:

     К1     0,25 мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л  3 мг/л

     К2     0,25 мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л  3 мг/л

     К3     0,25 мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л  3 мг/л

     К4     0,25 мг/л   0,5 мг/л   0,75 мг/л   1 мг/л   2 мг/л  3 мг/л

Из 0,1% маточного раствора К2Сr2О7 приготовить серию растворов с концентрациями 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3 мг/л по следующей схеме: (При всех последующих разведениях используется только профильтрованная биологизированная вода (РВ)).

а) 0,5 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 499,5 мл РВ = 0,5 л (1 мг/л). Из полученного раствора 200 мл разливается поровну по четырем стаканам с надписью 1 мг/л (по 50 мл).

б) Оставшиеся 300 мл раствора (1 мг/л) идут на приготовление растворов с концентрациями 0,25 и 0,5 мг/л по следующей схеме:

125 мл 1 мг/л + 375 мл РВ = 500 мл (0,25 мг/л) (200 мл разливают поровну по четырем стаканам с надписью 0,25 мг/л).

100 мл 1 мг/л + 100 мл РВ = 200 мл (0,5 мг/л) (200 мл разливают поровну по четырем стаканам с надписью 0,5 мг/л).

в) 1 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 499 мл РВ = 500 мл (2 мг/л) (200 мл разливают поровну по четырем стаканам с надписью 2 мг/л).

г) 1,5 мл 0,1% К2Сr2О7 + 498,5 мл РВ = 500 мл (3 мг/л). Из 500 мл полученного раствора 200 мл разливают поровну по четырем стаканам с надписью 3 мг/л.

д) Оставшиеся 300 мл раствора (3 мг/л) идут на приготовление раствора с концентрацией 0,75 мг/л по следующей схеме:

125 мл 3 мг/л + 375 мл РВ = 500 мл (0,75 мг/л) (200 мл разливают по четырем стаканам с надписью 0,75 мг/л).

е) В стаканы К1-К4 (контроль) разливают по 50 мл биологизированной воды.

Стаканы с растворами расставить в люминостате.

Произвести замеры температуры в люминостате (норма 23-27°С), рН растворов (норма 6,5-8,5), концентрации растворенного кислорода (перед началом опыта 6 мг/л, в конце опыта - не менее 4 мг/л). Если начальная концентрация растворенного кислорода ниже 6 мг/л, то перед разливом растворов осуществляется их аэрация до достижения концентрации растворенного кислорода 7-8 мг/л. Аэрация может быть осуществлена с помощью аквариумного микрокомпрессора. Режим освещения в люминостате - 12-часовой с интенсивностью 400-600 люкс [2].

Посадка рачков

Во все стаканы посадить по 5 рачков в возрасте 0,1-8 часов. При этом разница в возрасте рачков не должна превышать 4 часа.

Эксперимент

Подсчет выживших рачков производят визуально через 24 часа. Во время опыта рачков не кормят.

Результаты заносят в протокол опыта (табл.2.2).

Обработка результатов выполняется аналогично пункту 2.3.

Таблица 2.2

Протокол опыта

Дата _____________ Температура, рН, концентрация О2 (в начале и  в  конце

опыта)___________________________________________________________________

Время от на- чала опыта	Количество выживших дафний (экз.)
	Контроль	0,25 мг/л	0,5 мг/л	0,75 мг/л	1 мг/л	2 мг/л	3 мг/л
	_ 1 2 3 4 Xk	_ 1 2 3 4 Хо	_ 1 2 3 4 Хо	_ 1 2 3 4 Хо	_ 1 2 3 4 Хо	_ 1 2 3 4 Хо	_ 1 2 3 4 Хо
24 ч	10 10 10 10 10	9 9 9 9 9	8 9 8 9 8,5	7 7 8 8 7,5	5 5 6 5 5,3	4 5 4 4 4,3	2 2 2 2 2

2.5. Определение токсичности сточной (природной) воды
на Daphnia Magna

Материалы

Стаканы емкостью 150-250 мл (8-16 штук).

Колба для разбавляющей (контрольной) воды емкостью 3 л.

Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), 1 л (1 шт.).

Мерный цилиндр или мерный стакан на 150-200 мл.

От 40 до 80 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Расставить 16 стаканов с надписями по следующей схеме:

     К1     Ст.вода б/р N 1    Ст.вода 1:10 N 5    Ст.вода 1:100 N 9

     К2     Ст.вода б/р N 2    Ст.вода 1:10 N 6    Ст.вода 1:100 N 10

     КЗ     Ст.вода б/р N 3    Ст.вода 1:10 N 7    Ст.вода 1:100 N 11

     К4     Ст.вода б/р N 4    Ст.вода 1:10 N 8    Ст.вода 1:100 N 12

Разлить по стаканам контрольную (разбавляющая вода) и испытуемую воду (ст.вода) по 150 мл на стакан:

К1-К4 - 600 мл разбавляющей воды (РВ),

Ст.вода б/р (без разбавления) - 600 мл (4 х 150 мл).

Ст.вода 1:10 - 100 мл Ст.воды б/р + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:10.

Ст.вода 1:100 - 100 мл Ст.воды 1:10 + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:100

Стаканы с растворами расставить в люминостате.

Произвести замеры температуры в люминостате (норма 18-22°С), рН растворов (норма 6,5-8,5), концентрации растворенного кислорода (перед началом опыта не менее 6 мг/л, в конце опыта - не менее 2 мг/л).

В обязательном порядке скорректировать рН проб до 6,5-8,5 с помощью растворов NaOH или НСl, если они не соответствуют указанным выше нормативам. Насыщенность тестируемых проб кислородом также должна лежать в указанных рамках.

Режим освещения в люминостате - 12-часовой с интенсивностью 400-600 люкс.

Посадка рачков

Во все стаканы посадить по 5 рачков в возрасте строго 4-24 часа.

Эксперимент

Подсчет погибших рачков производят визуально через 1, 6, 24, 48, 72, 96 часов (окончание определения острой токсичности). Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%.

Результаты заносят в протокол опыта.

Таблица 2.3

Протокол опыта

Дата __________ Температура,  рН,  концентрация  О2  (в  начале   и конце

опыта)___________________________________________________________________

Место отбора пробы ______________________________________________________

Тестируемая вода (условия опыта)	Повторности	Количество выживших рачков						Примечания
		Время от начала опыта
		1 ч	6 ч	24 ч	48 ч	72 ч	96 ч
Контроль	1 2 3 4
_ Средняя (Xk)
Опыт (Ст.вода без разбавления)	1 2 3 4
_ Средняя (Хо) % от контроля
Опыт (Ст.вода с разбавлением в n раз)	1 2 3 4
_ Средняя (Хо) % от контроля

Обработка результатов

Смертность рачков в процентах к контролю (А) рассчитывают по формуле [2]:

                                 _    _

                                (Xk - Хо)

                          А = ------------- х 100, где

                                    _

                                   Xk

     _

     Xk - среднее арифметическое количества рачков, выживших в контроле,

     _

     Хо - среднее арифметическое количества рачков, выживших в опыте.

Биотестирование прекращают, если в любой период времени в опыте гибнет 50% и более особей.

Если А >= 50%, то тестируемая вода (опыт) остротоксична.

Если А < 50%, то тестируемая вода не оказывает острого токсического действия.

Для более точного определения острой токсичности строят график, где по оси абсцисс (ось X) откладывают время в часах, а по оси ординат (ось Y) смертность в процентах к контролю (А). Из графика находят ЛТ50 - время, в течении которого погибает 50% дафний.

2.6. Определение токсичности сточной (природной) воды на
Ceriodaphnia Affinis

Материалы

Пробирки емкостью 20 мл (20-40 штук).

Пипетка на 25 мл 2-го класса точности.

Колба для разбавляющей (контрольной) воды емкостью 1 л.

От 40 до 80 рачков в возрасте 0,1-8 часов. Разница в возрасте рачков не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Расставить пробирки по 10 штук в ряду по следующей схеме:

     К1      Ст.вода б/р N 1     Ст.вода 1:10 N 1     Ст.вода 1:100 N 1

     К2      Ст.вода б/р N 2     Ст.вода 1:10 N 2     Ст.вода 1:100 N 2

     К3      Ст.вода б/р N 3     Ст.вода 1:10 N 3     Ст.вода 1:100 N 3

     К4      Ст.вода б/р N 4     Ст.вода 1:10 N 4     Ст.вода 1:100 N 4

     К5      Ст.вода б/р N 5     Ст.вода 1:10 N 5     Ст.вода 1:100 N 5

     К6      Ст.вода б/р N 6     Ст.вода 1:10 N 6     Ст.вода 1:100 N 6

     К7      Ст.вода б/р N 7     Ст.вода 1:10 N 7     Ст.вода 1:100 N 7

     К8      Ст.вода б/р N 8     Ст.вода 1:10 N 8     Ст.вода 1:100 N 8

     К9      Ст.вода б/р N 9     Ст.вода 1:10 N 9     Ст.вода 1:100 N 9

     К10     Ст.вода б/р N 10    Ст.вода 1:10 N 10    Ст.вода 1:100 N 10

Разлить по пробиркам контрольную (разбавляющая вода) и сточную воду (Ст.вода) по 15 мл:

К1-К10 - 150 мл разбавляющей воды (РВ).

Ст.вода б/р (без разбавления) - 150 мл (10 * 15 мл).

Ст.вода 1:10 - 25 мл Ст.воды б/р + 225 мл РВ = 250 мл Ст.вода 1:10.

Ст.вода 1:100 - 25 мл Ст.воды 1:10 + 225 мл РВ = 250 мл Ст.вода 1:100.

Пробирки с растворами расставить в люминостате.

Произвести замеры температуры в люминостате (норма 23-27°С), рН растворов (норма 6,5-8,5), концентрация растворенного кислорода (норма перед началом опыта 6 мг/л, в конце опыта - не менее 4 мг/л).

В обязательном порядке скорректировать рН проб до 6,5-8,5 с помощью растворов NaOH или НСl, если они не соответствуют указанным выше нормативам. Насыщенность тестируемых проб кислородом также должна лежать в указанных рамках.

Режим освещения в люминостате - 12-часовой с интенсивностью 400-600 люкс.

Посадка рачков

Во все пробирки посадить по 1 рачку в возрасте 0,1-8 часов. Разница в возрасте рачков не должна превышать 4 часа.

Эксперимент

Подсчет погибших рачков производят визуально через 1, 6, 24, 48 часов (окончание определения острой токсичности). Во время опыта рачков не кормят. Результаты заносят в протокол опыта.

Таблица 2.4

Протокол опыта

Дата __________ Температура,  рН,  концентрация  О2  (в  начале   и конце

опыта) __________________________________________________________________

Место отбора пробы ______________________________________________________

Тестируемая во- да (условия опыта)	Повторности	Количество выживших рачков				Примечания
		Время от начала опыта
		1 ч	6 ч	24 ч	48 ч
Контроль	1 2 3 4
Средняя (Xk)
Опыт (Ст.вода без разбавле- ния)	1 2 3 4
Средняя (Хо) % от контроля
Опыт (Ст.вода с разбавлением в n раз)	1 2 3 4
Средняя (Хо) % от контроля

Обработка результатов выполняется аналогично пункту 2.5. Для оценки степени острой токсичности вод можно также использовать систему Сладечека (таблица 2.5) [7]:

Таблица 2.5

Система острой токсичности
(Сладечек, 1981)

Уровень токсичности	Смертность в течение 48 ч, %	Время гибели последней особи, час
0. Катаробность (атоксичность)	0	0
Лимнотоксичность
1. Ксенотоксичность	25	8-48
2. Олиготоксичность	50	8-48
3. Бета-мезотоксичность	75	8-48
4. Альфа-мезотоксичность	90	8-48
5. Политоксичность	100	8-48
Евтоксичность
6. Изотоксичность	100	1-8
7. Метатоксичность	100	0,05-1
8. Гипертоксичность	100	1 минута
9. Ультратоксичность	100	1 секунда

3. Биотестирование с использованием водоросли Scentdesmus Quadricauda

Методика предназначена для определения токсичности природных и сточных вод.

3.1. Общие принципы культивирования микроводорослей

Эффективное культивирование одноклеточных зеленых водорослей в лаборатории определяется в основном наличием минеральных элементов в питательной среде, достаточно интенсивным освещением (2000-3000 люкс) и определенной температурой (18-20°С) [2, 3, 5, 8, 9].

Лучшей средой для выращивания зеленых водорослей для токсикологических является питательная среда Успенского N 1, которая содержит более низкую общую концентрацию солей. Все манипуляции со средой Успенского N 1 при работе с водорослью Scenedesmus проводятся при строгом соблюдении условий стерильности. Недопустимым является совместное культивирование данной водоросли с хлореллой в одном люминостате (хлорелла быстро засоряет и подавляет культуру сценедесмус).

Весьма желательно применять в токсикологических лабораториях в качестве источников искусственного освещения люминисцентные лампы дневного света (ЛДС, ДС), так как они имеют наибольшую интенсивность физиологической радиации. Культивирование микроводорослей обычно осуществляют в колбах емкостью 1-2 л.

Цикл освещения 12-14-часовой. Следует помнить, что стекло толщиной свыше 5 мм практически полностью поглощает ультрафиолетовые лучи, необходимые для роста микроводорослей и подавления роста бактерий. Плексиглас хорошо пропускает эти лучи, но обладает другим недостатком - он сильно подвержен обрастанию водорослями. Обрастания на стенках сосудов необходимо очищать тампоном, смоченным раствором лимонной кислоты.

Перегрев культуры водорослей ведет к ее гибели, тогда как снижение температуры ниже оптимальной приводит только к замедлению процесса фотосинтеза. Пресноводные микроводоросли более, чем морские, подвержены влиянию изменения рН, так как пресная вода обладает меньшей буферностью. При интенсивном фотосинтезе рН может подниматься до 10-11. В темноте происходит закисление воды за счет угольной кислоты и рН достигает значения 5,5-6,0, поэтому в течение биотестирования на микроводорослях необходим постоянный контроль концентрации водородных ионов в среде, которая в контрольных сосудах не должна изменяться более чем на 1,5 единицы. Измерение рН среды в течение всего острого опыта может служить дополнительным параметром оценки жизнеспособности водорослевых клеток. Обычно по мере старения культуры наблюдается подщелачивание среды, подкисление же растворов опытных сосудов на свету свидетельствует об угнетении водорослей.

Продолжительность опытов по выявлению токсичности вод может быть 4, 7, 14 и более дней в зависимости от поставленных задач. Максимальное накопление токсиканта в клетках водорослей отмечается, обычно, к исходу 3-4 суток, поэтому чаще всего определение острой токсичности ограничивают 4 сутками. Если в результате биотестирования на острую токсичность выявлена достоверная стимуляция роста водорослей, то для окончательного суждения о токсичности пробы необходимо ставить хронический эксперимент (до 14 суток) [5, 8, 9]. Достоверная стимуляция роста водорослей свидетельствует о наличии эвтрофирующего загрязнения, а достоверное угнетение роста водорослей - о наличии токсического загрязнения [10].

3.2. Среда Успенского N 1

Приготовление водных маточных растворов для среды Успенского N 1:

Растворить 2,5 г KNO3 в 100 мл дистиллированной воды, 1,22 г MgSO4 (б/в) или 2,5 г MgSO4 х 7Н2О в 100 мл, 14,4 г Ca(NO3)2 х 4H2O или 10 г Ca(NО3)2 (б/в) в 100 мл, 2,5 г КН2РО4 в 100 мл, 3,45 г К2СО3 в 100 мл.

Микроэлементы - вместо раствора микроэлементов вносится любая соль железа - FeSO4, Fe2(SO4)3, FeCl3, лимоннокислое Fe, железистые квасцы - 1%-й раствор.

Полученные маточные растворы проавтоклавировать 20 минут при 1 атм. или прокипятить 20-30 минут, после чего их можно использовать длительный срок.

Приготовить среду Успенского N 1. Для этого на 1 л дистиллированной воды добавить по 1 мл каждого маточного раствора, кроме соли железа. Полученный раствор проавтоклавировать (или прокипятить) и остудить. Добавить 1-2 капли соли железа (на 1 л).

Посуда

Промыть в питьевой соде, сполоснуть до 20 раз водопроводной, а затем дистиллированной водой (2 раза). Просушить в шкафу, колбы закрыть ватными пробками и бумагой. Пипетки должны быть с ватной защитой.

Стерилизация: 160°С, 1,5 часа в суховоздушном шкафу (либо автоклавирование).

Подготовка культуры

В опыте использовать 5-10 суточную культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста. Перед посевом культуру сгущают одним из трех способов: - отстаиванием 2-3 дня, центрифугированием, фильтрованием через мембранный фильтр N 4 или фильтровальную бумагу с синей лентой. Полученная суспензия (концентрат) клеток используется для последующего посева.

Посев

Производится в большую опытную колбу емкостью 1,5 л, в случае биотестирования в колбах (по 100 мл) или в колбу емкостью 150 мл при биотестировании в пенициллиновых пузырьках (по 10 мл). Обычно требуется примерно 30 мкл суспензии на 30 мл воды.

В опытных колбах после посева должно быть около 200-300 тысяч клеток водорослей в 1 мл (не более 500 тысяч/мл) - едва заметное зеленоватое окрашивание на белом фоне.

Разлив

Из большой колбы произвести разлив культуры по колбам (3 повторности по 100 мл) или пенициллиновым пузырькам (3 повторности по 10 мл).

3.3. Оценка результатов опыта по определению устойчивости культуры
к бихромату калия

Подсчет производят с помощью микроскопа (например типа "Биолам") при 80-100 кратном увеличении. Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или Фукс-Розенталя. Камеру и относящееся к ней покровное стекло обезжиривают, покровным стеклом накрывают камеру и притирают его до образования радужных колец интерференции. Из каждой колбы пипеткой наносят по одной капле тщательно перемешанной суспензии на верхний и нижний края покровного стекла. Камеру заполняют так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, избыток суспензии вытесняется по канавкам. Просматривают 16 квадратов по диагонали или все поле камеры в случае малой численности водорослей (при одном заполнении камеры просчитывают не менее 50 клеток). Из каждой колбы просматривают не менее трех проб. Вычисляют по формуле количество клеток водорослей в 1 мл суспензии:

                                m        3

                         М = ------- х 10 , где

                              n x V

m - количество подсчитанных клеток; n - количество просчитанных маленьких квадратов камеры; V - объем части камеры, имеющий площадь маленького квадрата.

Оценка токсического действия химического соединения или тестируемой воды делается на основании достоверности различий между показателями численности клеток водорослей в контроле и в опыте. При этом вычисляют [2]:

а) средние арифметические величины численности клеток - Xi и X (из двух и шести подсчетов, соответственно).

б) численность клеток в процентах от контроля. Сумма (X - Xi)

в) среднее квадратичное отклонение (б):

"Формула"

где n - количество повторностей; в данном случае (см. табл.3.1) n = 3;

в) ошибку среднего арифметического (X): S = б/корень из n;

г) Td - критерий достоверности различий двух сравниваемых величин:

"Формула"

    _    _

где Xk и Хо - сравниваемые средние величины (в контроле и опыте),

      2    2

    Sk - So  - квадраты ошибок средних в контроле и опыте.

Td рассчитывают на каждые сутки и сравнивают с табличной величиной Tst - стандартным значением критерия Стьюдента. В данном случае (табл. 3.1) для его определения принимают уровень значимости Р = 0,05 и степень свободы (n1 + n2 - 2), т.е. (3 + 3 - 2) = 4. Tst при степени свободы 4 равно 2,78.

Если Td больше или равно Tst, то различие между контролем и опытом достоверно - тестируемая вода загрязнена (токсическое или эвтрофирующее загрязнение)

Если Td меньше Tst, то различие между контролем и опытом не достоверно - тестируемая вода не загрязнена.

Для расчетов Td можно использовать калькуляторы типа МК-51 и МК-71, а также компьютерные электронные таблицы (например, программу "Сигма" ЦСИАК), что значительно ускоряет работу.

Для графического представления результатов биотестирования по оси абсцисс откладывают время в сутках, а по оси ординат либо число клеток водорослей в 1 мл, либо число клеток водорослей в процентах от контроля.

3.4. Биотестирование сточной (природной) воды на водоросли
Scedesmus Quadricauda

Биотестирование в колбах (100 МЛ):

A. Добавить последовательно в 300 мл тестируемой сточной воды (опыт) 0,3 мл KNO3, 0,3 мл MgSO4, 0,3 мл Ca(NO3)2, 0,3 мл КН2РО4, 0,3 мл К2СО3.

Добавить последовательно в 300 мл тестируемой дистиллированной воды (контроль) 0,3 мл KNO3, 0,3 мл MgSO4, 0,3 мл Ca(NO3)2, 0,3 мл КН2РО4, 0,3 мл К2СО3.

Б. Добавить в обе колбы (контроль и опыт) суспензию водорослей до концентрации 200-300 тысяч клеток, мл (не более 500 тысяч/мл!).

B. Разлить по колбам по 100 мл:

опыт 3 колбы - N 1, N 2, N 3.

контроль 3 колбы - N 4, N 5, N 6.

Г. Считать ежедневно после интенсивного встряхивания содержимого колб.

Биотестирование в пузырьках (10 мл):

А. Добавить последовательно в 30 мл тестируемой сточной воды (опыт) 30 мкл KNO3, 30 мкл MgSO4, 30 мкл Ca(NO3)2, 30 мкл КH2PО4, 30 мкл К2СО3.

Таблица 3.1

Определение устойчивости Scenedesmus Quadricauda
к действию бихромата калия

Добавить последовательно в 30 мл дистиллированной воды (контроль) 30 мкл KNO3, 30 мкл MgSO4, 30 мкл Ca(NO3)2, 30 мкл КН2РО4, 30 мкл К2СО3.

N пов- торнос- тей	Конц-ция K2Cr2O7, мг/л	Кол-во клеток водорослей		Хi	Х	% от контроля	_ _ (Х-Хi)	_ _ 2 (Х-Хi)	_ _ 2 Сумма(Х-Хi)	б	S	2 S	Td
		Сетка 1	Сетка 2
Дата начала опыта ___________________, рН = 7,4
1-е сутки после начала опыта, рН 7,8
N 1	10	20	23	21,5			1,8	3,24
N 2	10	18	20	19,0	19,7	53,4	0,7	0,49	5,3	1,6	0,9	0,8	8,69
N 3	10	19	18	18,5			1,2	1,4	Td>2,78 Отклонение от контроля дос- товерно (токсично)
N 4	1	38	40	39,0			1,2	1,4
N 5	1	35	39	37,0	37,8	103	0,8	0,7	2,2	1,0	0,6	0,4	0,54
N 6	1	39	36	37,5			0,3	0,1	Td<2,78 Отклонение от контроля не достоверно (не токсично)
N 7	0,1	38	41	39,5			2,8	8,0
N 8	0,1	39	34	36,5	36,7	99,6	0,2	0,04	15	2,8	1,6	2,5	0,07
N 9	0,1	32	36	34,0			2,7	7,3	Td<2,78 Отклонение от контроля не достоверно (не токсично)
N 10	К1	35	38	36,5			0,3	0,1
N 11	К2	32	36	34,0	36,8	100	2,8	8,0	18,3	3,0	1,7	3,03
N 12	К3	41	39	40,0			3,2	10,2
2-е сутки после начала опыта
3-е сутки ...
4-е сутки ...
Острый опыт закончен
7-е сутки ...
10-е сутки ...
14-е сутки ...
Хронический опыт закончен

Чтобы избежать работы с микрообъемами (30 мкл), можно сделать иначе: 0,1 мл каждого из 5 маточных растворов разбавить 9,5 мл дистиллированной воды и затем добавлять полученные растворы уже по 0,3 мл на 30 мл.

Б. Добавить в обе 30 мл емкости суспензию водорослей до концентрации 200-300 тысяч клеток/мл (не более 500 тысяч/мл!).

В. Разлить по пузырькам 10 мл:

опыт 3 пузырька - N 1, N 2, N 3.

контроль 3 пузырька - N 4, N 5, N 6.

Г. Считать ежедневно после интенсивного встряхивания содержимого (согласно п.3.3).

Форма записи результатов биотестирования проб сточных вод с трех предприятий приводится в таблице 3.2.

Таблица 3.2

Биотестирование сточной воды на Scedesmus Quadricauda
(биотестирование в пузырьках)

N пов- тор- но- стей

Кол-во клеток водорослей

_ Хi

_ Х

% от контро ля

_ _ (Х-Хi)

_ _ 2 (Х-Хi)

_ _ 2 Сумма(Х-Хi)

б

S

2 S

Td

Сетка 1

Сетка 2

Дата начала опыта ____________ рН каждой пробы и контроля _________________

Проба N 1. Место отбора пробы N 1 _________________________________________

1-е сутки после начала опыта, рН каждой пробы и контроля __________________

N 1

N 2

N 3

Проба N 2. Место отбора пробы N 2 _________________________________________

N 4

N 5

N 6

Проба N 3. Место отбора пробы N 3 _________________________________________

N 7

N 8

N 9

N 10

N 11

N 12

2-е сутки после начала опыта, рН каждой пробы и контроля __________________ Проба N 1

N 1

N 2

N 3

Проба N 2

N 4

N 5

N 6

Проба N 3

N 7

N 8

N 9

N 10

К1

N 11

К2

N 12

К3

3-е сутки ...

4-е сутки ...

Острый опыт закончен

7-е сутки ...

10-е сутки ...

14-е сутки ...

Хронический опыт закончен

Хронический опыт (в пузырьках)

На 7-е сутки биотестирования проводят смену контрольной и тестируемой воды в стерильных условиях. При этом в новую партию пузырьков наливают по 7,5 мл контрольной и тестируемой воды. Затем в пузырьки добавляют по 0,01 мл (10 мкл) каждого из 5 маточных растворов солей и по 2,5 мл старой культуры из пузырьков, в которых проводилось биотестирование в остром опыте. Подсчет численности клеток проводят на 7-е, 10-е и 14-е сутки.

На практике бывает удобно использовать таблицу оценки результатов биотестирования по 5-бальной шкале (таблица 3.3).

Необходимо помнить, что увеличение биомассы водорослей может быть связано с наличием эвтрофирующих загрязнений в испытуемой воде, в этом случае о наличии токсического эффекта можно судить после испытания на нескольких тест-объектах.

Таблица 3.3

Оценка степени токсичности сточной воды для водорослей (по баллам)

Баллы	Результаты биотестирования	Длительность наблюдения	Степень токсичности
1.	Отклонения от Контроля недосто- верны и составляют +-10-15%	14 суток	Вода не оказывает токсического действия
2.	Отклонения от Контроля достоверны и составляют +-15-30%	до 14 суток	Вода слабо-ток- сична (проявляет- ся в поколениях)
3.	Отклонения от Контроля достоверны и составляют +-15-30%	до 7 суток	Вода слабо-ток- сична
	Отклонения от Контроля достоверны и составляют +-30-50%	до 7 суток	Вода средне-ток- сична
4.	Отклонения от Контроля достоверны и составляют +-50-80%	до 4 суток	Вода высоко-ток- сична
5.	Отклонения от Контроля достоверны и составляют +-50-80% или более	до 1 суток	Вода гипертоксич- на

4. Биотестирование на инфузориях

В основу метода положен один из вариантов определения острой токсичности воды по выживаемости инфузорий Paramecium caudatum [11].

Используется:

- для определения токсичности сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения, что позволяет проводить технологическую корректировку режима подготовки и очистки сточных вод;

- для определения токсичности локальных потоков сточных вод, что позволяет выяснять их взаимодействие, определять вклад каждого потока в токсичность сточных вод отдельного предприятия, суммарную токсичность сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения;

- для определения токсичности водных растворов отдельных веществ и их смеси.

4.1. Принцип методики

Методика определения острой летальной токсичности сточной воды по выживаемости инфузорий основана на установлении количества погибших или обездвиженных особей после экспозиции в тестируемой воде. Критерием острой летальной токсичности является гибель или обездвиживание 50% и более особей в течение 1 часа в тестируемой воде по сравнению с их исходным количеством.

4.2. Тестовый организм

В качестве тест-объекта используют лабораторную монокультуру Paramecium caudatum Ehrenberg.

Paramecium caudatum - одноклеточные организмы размером 180-300 мкм. Тело сигарообразной или веретенообразной формы, покрытое плотной оболочкой (пелликулой). Передний конец закруглен, задний заострен. Реснички одинаковой длины, равномерно покрывают все тело парамеции, лишь на заднем конце они несколько длиннее остальных. Питание осуществляется через рот, расположенный на дне околоротовой впадины (перистом). Перистом расположен близко к центру тела. Под оболочкой по всей поверхности тела имеются многочисленные трихоцисты, выполняющие защитную функцию.

Ядерный аппарат представлен двумя видами ядер: макронуклеус один, имеет бобовидную форму, лежит в центре тела. В его выемке находится шаровидный микронуклеус. Две пульсирующие вакуоли, регулирующие водный баланс, расположены в разных концах тела. Количество пищеварительных вакуолей непостоянно и зависит от количества пищи.

Бесполое размножение осуществляется поперечным делением на две дочерние особи. Половое размножение происходит по типу коньюгации, т.е. временного соединения двух особей для обмена частями ядерного аппарата.

Питаются парамеции бактериями, мелкими жгутиконосцами, водорослями. Относятся к эвриоксибионтам, т.е. могут встречаться в среде с широким колебанием содержания растворенного в воде кислорода. Оптимальная температура 24-28°С, оптимальная концентрация солей во внешней среде составляет 600-1400 мг/л. Для инфузорий характерно быстрое размножение при наступлении благоприятных условий (2-4 деления в сутки) и такое же быстрое исчезновение при обратном явлении.

Paramecium caudatum - массовый вид в пресной воде с высоким содержанием органических веществ. В сточной воде является часто основным видом, поли-альфа-мезосапроб. Простейшие, в том числе ресничные инфузории, составляют основную часть микрофауны активного ила. Они участвуют в освобождении очищаемой воды от взвешенных бактериальных клеток и от рыхлых, плохо оседающих бактериальных агломератов, способствуя тем самым повышению эффективности очистки.

4.3. Выделение и культивирование

4.3.1. Выделение из активного ила.

Наиболее подвижную и крупную особь отлавливают из пробы активного ила очистных сооружений и переносят в микроаквариум со стерильной водопроводной водой. Путем последовательного переноса этой особи из лунки в лунку добиваются отделения ее от других простейших и цист. Затем помещают отмытую инфузорию в пробирку со средой культивирования. Через 7-8 суток из полученной таким образом монокультуры одну наиболее крупную и подвижную особь вновь переносят в свежую среду. Спустя 8-10 суток культуру можно использовать для определения токсичности.

4.3.2. Культивирование инфузорий на молоке.

Культуру парамеций выращивают на дехлорированной водопроводной воде, которую добавляют разбавленное в 20 раз такой же водой пастеризованное молоко. Пересевают культуру инфузорий один раз в месяц (при необходимости один раз в три недели). Для этого в пробирки наливают по 10 мл дехлорированной водопроводной воды, помещают в водяную баню и выдерживают в кипящей воде в течение 15-20 минут. Затем пробирки вынимают, охлаждают их содержимое и добавляют в каждую пробирку пипеткой на 1-2 мл по 1 капле (0,02 мл) разбавленного в 20 раз молока.

Пробирки помещают на сутки в термостат при температуре 27-28°С для развития бактерий, которыми питаются парамеции. Через сутки в каждую пробирку снова добавляют по одной капле разбавленного молока. Таким образом содержимое пробирок становится питательной средой для выращивания парамеций.

Пересев клеток из старой культуры на свежую питательную среду производят следующим образом. На предметный столик стереомикроскопа помещают микроаквариум. Устанавливают такое увеличение, чтобы вся лунка микроаквариума была в поле зрения. Одну из лунок заполняют старой культурой. Четыре лунки (если культура заражена другими простейшими, то шесть лунок) заполняют на 1/3 объема дехлорированной водопроводной водой. Капиллярной пипеткой отбирают небольшое количество старой культуры и переносят в первую лунку с водопроводной водой. Пипетку тщательно промывают и, наблюдая в микроскоп, переносят клетки из первой лунки во вторую, затем из второй в третью и так далее каждый раз тщательно промывая капиллярную пипетку. Таким образом, клетки парамеций отмывают от остатков старой среды и избавляют от других простейших в случае зараженной исходной культуры. Из последней лунки чистой капиллярной пипеткой инфузорий переносят в пробирки с подготовленной свежей питательной средой, помещая в каждую пробирку по одной клетке. Пробирки с посевами ставят в термостат при температуре 27-28°С.

Каждый день инфузорий кормят молоком, разбавленным в 20 раз дехлорированной водопроводной водой, добавляя пипеткой на 1-2 мл в каждую пробирку по 1 капле разбавленного молока.

Оптимальная температура содержания культуры парамеций 24-28°С. Можно оставлять культуру при комнатной температуре. Культуру содержат в темноте, чтобы не развивались водоросли.

4.3.3. Условия транспортировки тест-объекта.

Во время транспортировки тест-объекта в пробирках последние должны быть плотно закрыты инертным материалом (например, полиэтиленовыми пробками). По окончании транспортировки герметичные пробки заменяют ватными. При транспортировке допустимы колебания температуры в пределах от 8 до 30°С. Если колебания температуры при транспортировке были незначительны и не выходили за пределы 20-28°С, а пробирки были герметично закрыты не более 4 часов, адаптацию проводить не нужно. При более длительном времени транспортировки необходима суточная адаптация культуры в пробирках под ватными пробками. Во избежание гибели монокультуры, пробирки в герметично закрытом состоянии должны находиться не более 48 часов.

4.4. Материалы и оборудование

Подсчет Paramecium caudatum производят с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9, МБС-10 или иного, обеспечивающего 8-24 кратное увеличение. Конструкция микроаквариумов из прозрачного органического стекла приведена на рис.4.1. Для разбавления и внесения одинакового количества исследуемой пробы используют стандартные стеклянные пипетки. Для внесения определенного количества особей используют капилляры (рис.4.2).

"Рис.4.1. Микроаквариум для размещения и подсчета инфузорий"

"Рис.4.2. Капилляр для отбора инфузорий"

4.5. Отбор и подготовка проб для биотестирования

Пробы сточных вод отбирают в объеме 100 мл.

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора, при невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+4°С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов. В качестве контрольной используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессора в течение 7 суток.

Для определения токсичности отдельных веществ или их смеси из них готовят растворы путем добавления определенных количеств маточного раствора исследуемого(ых) вещества(в) в водопроводную дехлорированную воду. Маточные растворы готовят на дистиллированной воде.

При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре культуры.

При наличии в пробе крупнодисперсных взвесей необходима фильтрация.

При проведении биотестирования значения рН тестируемых растворов должно находиться в интервале от 6,5 до 7,6.

Биотестирование проводят в помещении, не содержащем вредных паров и газов, при рассеянном свете и температуре воздуха 18-28°С.

4.6. Проведение биотестирования

Для биотестирования неразбавленной сточной воды или ее разбавлений, а также растворов отдельных токсических веществ (смеси веществ) используют микроаквариум с лунками, который помещают на предметный столик стереомикроскопа. Одну из лунок заполняют культурой инфузорий с помощью капиллярной пипетки.

В свободные лунки капиллярной пипеткой рассаживают по 10-12 особей в каждую лунку, так чтобы на одну пробу тестируемой воды приходилось не менее 30 инфузорий в трех лунках (трехкратная повторность). При посадке тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не должно превышать 0,02 мл. Три лунки используют в качестве контрольных.

После посадки инфузорий наливают в контрольные лунки по 0,3 мл дехлорированной водопроводной воды, в опытные - по 0,3 мл пробы тестируемой воды. Отмечают время начала биотестирования и подсчитывают под микроскопом количество особей в каждой лунке.

Микроаквариум с заполненными лунками помещают в чашку Петри, на дно которой кладут фильтровальную бумагу, смоченную водой, чтобы не испарялось содержимое лунок, и выдерживают в течение 1 часа при температуре 22-24°С. По истечении этого времени производят подсчет выживших особей под микроскопом. Выжившими считаются инфузории, которые свободно перемещаются в толще воды. Обездвиженных особей относят к погибшим. Результаты подсчета записывают в рабочий журнал.

Рабочий журнал

Дата	N пробы	Количество инфузорий в тестируемой воде, экз.				Тест- параметр
		исходное		через 1 ч
		повторность 1 2 3	среднее ари- фметическое	повторность 1 2 3	среднее ари- фметическое
	1 2 3 4

4.7. Обработка и выражение результатов

Результаты биотестирования считаются правильными и учитываются, если гибель инфузорий в контрольных лунках не превышала 10%.

После подсчета особей в каждой из трех лунок находят среднее арифметическое количество инфузорий, выживших в тестируемой воде. Затем по формуле 4.1 рассчитывают тест-параметр (А) - процент погибших особей по отношению к исходному количеству инфузорий:

                            (Хn - Xk)

                      А = ------------- х 100%                      (4.1)

                               Xn

где: А - количество погибших инфузорий, %;

Xn - среднее арифметическое исходного количества особей;

Xk - среднее арифметическое количество выживших особей в тестируемой воде через 1 ч.

Тестируемую воду оценивают как оказывающую острое летальное действие, если в течение 1 ч в ней гибнет 50% и более инфузорий.

При определении острой летальной токсичности разбавлений пробы сточной воды или водного раствора отдельного вещества (смеси) устанавливают среднюю летальную кратность разбавлений (среднюю летальную концентрацию), вызывающую гибель 50% тест-объектов в течение 1 часа - ЛКр50 - 1 ч (ЛК50 - 1 ч). Для построения графика с целью расчета ЛКр50 - 1 ч (ЛК50 - 1 ч) тест-параметр выражают в условных единицах - пробитах, а кратность разбавления (концентрацию) - в логарифмических величинах. Таблица перевода тест-параметра в пробиты представлена в таблице 4.1.

Таблица 4.1

Таблица пробитных величин

Процент гибели инфузо- рий	Проби- ты	Процент гибели инфузо- рий	Проби- ты	Процент гибели инфузо- рий	Проби- ты	Процент гибели инфузо- рий	Проби- ты	Процент гибели инфузо- рий	Проби- ты
1	2,67	20	4,16	40	4,75	60	5,25	80	5,84
2	2,95	21	4,19	41	4,77	61	5,28	81	5,88
3	3,12	22	4,22	42	4,80	62	5,31	82	5,92
4	3,25	23	4,26	43	4,82	63	5,33	83	5,95
5	3,35	24	4,29	44	4,84	64	5,36	84	5,99
6	3,45	25	4,33	45	4,87	65	5,39	85	6,04
7	3,52	26	4,36	46	4,90	66	5,41	86	6,08
3	3,59	27	4,39	47	4,92	67	5,44	87	6,13
9	3,66	28	4,42	48	4,95	68	5,47	88	6,18
10	3,72	29	4,45	49	4,97	69	5,50	89	6,23
11	3,77	30	4,48	50	5,00	70	5,52	90	6,28
12	3,83	31	4,50	51	5,03	71	5,55	91	6,34
13	3,87	32	4,53	52	5,05	72	5,58	92	6,41
14	3,92	33	4,56	53	5,08	72	5,61	93	6,48
15	3,96	34	4,59	54	5,10	74	5,64	94	6,55
16	4,01	35	4,61	55	5,13	75	5,67	95	6,64
17	4,05	36	4,64	56	5,15	76	5,71	96	6,75
18	4,08	37	4,67	57	5,18	77	5,74	97	6,88
19	4,12	38	4,69	58	5,20	78	5,77	98	7,05
		39	4,72	59	5,23	79	5,81	99	7,32

На оси абсцисс откладывают логарифмы концентраций кратности разбавлений сточной воды (концентраций вещества), на оси ординат величины тест-параметра в пробитах. Полученные точки соединяют прямой. Из точки на оси ординат, соответствующей 50% гибели тест-объекта, проводят линию, параллельную оси абсцисс до пересечения с линией графика. Из точки их пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс и находят логарифмы ЛКР50 - 1 ч. Величину найденного логарифма переводят в величину кратности разбавления (концентрацию, выраженную в мг/л вещества).

Результаты биотестирования представляют в виде протокола.

Протокол N ___
определения острой летальной токсичности сточной воды на инфузориях

Дата отбора пробы:

Место отбора проб:

1. ________________________________________________________________

2. ________________________________________________________________

3. ________________________________________________________________

Дата проведения биотестирования

Диапазон реагирования тест-объекта

Дата	N пробы	Количество инфузорий в тестируемой воде, экз.				Тест- параметр
		исходное		через 1 ч
		повторность 1 2 3	среднее ари- фметическое	повторность 1 2 3	среднее ари- фметическое
	1 2 3 4

Оценка токсичности пробы сточной воды: оказывает (не оказывает) острое летальное действие.

________________                           ______________________________

    подпись                                     Должность, Фамилия

После проведения биотестирования микроаквариумы промывают водой (температура не выше 40°С), протирают ваткой, смоченной в спирте, промывают дистиллированной водой.

4.8. Метрологические характеристики

К2Cr2O7

Порог чувствительности методики - 0,2 г/л.

Диапазон реагирования тест-объекта: 0,2-0,9 г/л.

Сходимость методики

Концентрация токсиканта К2Сr2О7, г/л	Сходимость, %
0,30	43
0,35	21
0,40	29
0,50	23
0,75	13

Воспроизводимость методики

Концентрация токсиканта K2Cr2O7, г/л	Воспроизводимость методики, %
0,20	37
0,35	26

CuSO4 х 5H2O

Порог чувствительности методики - 0,1 г/л.

Диапазон реагирования тест-объекта: 0,14-0,4 г/л.

Основные термины, применяемые в методических указаниях,
и пояснения к ним

Термин	Пояснение
Биологическое тестиро- вание воды	Оценка качества воды по ответным реакциям орга- низмов, являющихся тест-объектами
Диапазон реагирования тест-объекта	Интервал концентраций токсического вещества, на которые тест-объект реагирует за заданное время
Концентрация средняя летальная (ЛК50)	Концентрация токсиканта, вызывающая гибель 50% тест-объектов за определенный период времени
Критерий токсичности	Значение тест-параметра или правило, на основа- нии которого судят о токсичности воды
Порог чувствительности методики биотестирова- ния	Минимальная концентрация токсического вещества (веществ), обнаруживаемая методикой
Результат биотестиро- вания	Конечный вывод (оценка) о токсичности воды, ус- тановленный при выполнении следующих процедур: 1. получение прямых результатов наблюдений; 2. определение тест-параметра; 3. оценка тест-пара- метра по принятому в методике биотестирования критерию
Тест-объект	Организм, используемый в биотестировании
Тест-параметр	Количественное выражение тест-реакции
Тест-реакция	Изменение какой-либо характеристики тест-объекта под воздействием токсических веществ, содержа- щихся в воде, которое используется для определе- ния ее токсичности

Литература

1. Г.С.Фомин, А.Б.Ческис. Вода. Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам. Справочник /Под ред. С.А.Подлепы. - М.:"Геликон", 1992. - 392 с.

2. Методическое руководство по биотестированию воды. РД-118-02-90. - М.: 1991, 48 с.

3. Микулин А.Е. Живые корма. - М.: "Дельфин", 1994. - 104 с.

4. Исакова Е.Ф., Колосова Л.В. Проведение токсикологических исследований на дафниях. - В кн.: Методы биотестирования качества водной среды/Под ред. О.Ф.Филенко. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - С.51-62.

5. Филенко О.Ф. Водная токсикология. - М.: Изд-во МГУ, 1988. 138 с.

6. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: 1963. - 152 с.

7. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть 3, том 2, доп. к 4-му изданию, СЭВ. - М: 1990. - 83 с.

8. Хоботьев В.Г. Стандартизация условий при экспериментальном изучении действия токсических веществ на водоросли//Тез. симп. по водной токсикологии. - Л., 1969. - С.111-112.

9. Дмитриева А.Г., Веселова Т.В., Веселовский В.А. Биотестирование сточных вод и их компонентов и биоиндикация природных вод с использованием люминисцентных методов. - В кн.: Методы биотестирования качества водной среды/Под ред. О.Ф.Филенко. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - С.21-34.

10. Богдановский Г.А. Химическая экология: Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1994. - 237 с.

11. Руководство по биотестированию. РССОП РТ 002.1.005-96. Казань: 1996.

12. ГОСТ 13496.7-92. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности.

13. НВН 33-5.3.01-85. Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод.

14. А.с.СССР 1265152, МКИ С02 F 3/34. Способ подготовки сточных вод для биологической очистки активным илом./О.И.Якушева, А.М.Петров, А.П.Маслов, И.М.Гиниатуллин, В.П.Кичигин, Г.З.Скрипник, А.М.Багамаов, Р.П.Наумова. - Опубл. 22.06.86., Бюл.39.

15. Маслов А.П., Асадуллин А.З., Пеньковцева И.М., Наумова Р.П. Использование экспресс-теста на токсичность при очистке сточных вод производства органического синтеза//Химия и технология воды - 1997. - Т.9, N 3. - С.263-265.

16. Маслов А.П., Петров А.М., Гиниатуллин И.М., Наумова Р.П. Метод биотестирования сточных вод, поступающих на биологическую очистку/В сб. "Методы биотестирования вод" - Черноголовка, 1988, С.97-99.

17. Селивановская С.Ю., Маслов А.П., Наумова Р.П. Токсикологическое тестирование сточных вод, подлежащих биологической очистке, с помощью ресничных инфузорий Euplotes patella и Paramrcium# caudatum//Химия и технология воды. - 1993. - Т.15, N 9-10. - С.686-690.