Методические указания МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.) (утратили силу)

1.3. Эпидемиология

Методические указания МУ 1.3.1888-04
"Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.)

ГАРАНТ:

Настоящие методические указания признаны утратившими силу в связи с введением Методических указаний МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности", утвержденных Роспотребнадзором, Главным государственным санитарным врачом РФ 22 декабря 2009 г.

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают требования к помещениям лабораторий и порядку проведения в них работ с патогенными биологическими агентами (ПБА) III - IV групп патогенности с использованием методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2. Методические указания регламентируют выполнение исследований методом ПЦР с применением оборудования и тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

1.3. Методические указания определяют принципы организации работы лабораторий, использующих метод полимеразной цепной реакции, на этапах выполнения ПЦР-анализа.

2. Нормативные ссылки

2.1. СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Минздрав России, 1999.

2.2. СП 1.2.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами". Минздрав России, 2003.

2.3. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности". Госкомсанэпиднадзор России, 1995.

2.4. МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности". Минздрав России, 2003.

2.5. МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности при работе методом ПЦР". Минздрав России, 2001.

2.6. "Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях" N 11-16/03-06 от 28.02.95. Минздравмедпром России, 1995.

3. Общие положения

3.1. Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс многократного увеличения числа копий (амплификация) фрагмента ДНК-мишени (кДНК), катализируемый in vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и позволяет обнаружить специфичный участок генома биологического агента.

3.2. ПЦР обладает высокой чувствительностью, специфичностью, обеспечивает возможность работы практически с любым видом биологического материала и объектами окружающей среды, позволяет выполнять анализ в течение 4 - 8 ч. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1 х 10(2) - 1 х 10(4) м.к. (геномэквивалент/мл), специфичность - 85 - 100%.

3.3. По результатам анализа выдают предварительный ответ о наличии в пробе специфических участков (фрагментов) ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя того или иного инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.

3.4. Проведение исследований методом ПЦР сопряжено с необходимостью обеспечения соблюдения правил биологической безопасности, а также определенных требований к организации и проведению анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

4. Требования к организации работы с ПБА III - IV групп патогенности методом ПЦР

4.1. Общие требования

4.1.1. Работу с ПБА III - IV групп патогенности методом ПЦР проводят только при наличии в организации лицензии на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний человека, и санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения соответствующих работ в лаборатории, выданных в установленном порядке.

4.1.2. Организацию работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Работу на остальных этапах ПЦР-анализа проводят, как с обеззараженным материалом.

4.1.3. В лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности, допускается проведение исследований методом ПЦР (без предварительного накопления возбудителя) с целью диагностики бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, возбудители которых относятся ко II группе патогенности.

4.2. Требования к помещениям ПЦР-лаборатории

4.2.1. Помещения ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III - IV групп патогенности, должны соответствовать требованиям СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

4.2.2. Проведение исследований методом ПЦР с ПБА III - IV группы патогенности допускается на базе действующих микробиологических (бактериологических, вирусологических, иммунологических и др.) лабораторий при условии соблюдения требований СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами" и организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.

4.2.3. ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:

- приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;

- выделения НК;

- приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;

- детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.

4.2.4. В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: комнаты ведения учетных документов или ординаторской (комнаты персонала)*; кабинета заведующего лабораторией*; раздевалки для сотрудников**; комнаты приема пищи**; туалета**; подсобных (складских) помещений**.

4.2.5. Необходимо наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.

4.2.6. Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами).

4.2.7. В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием ПБА, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и др.), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.

4.2.8. Зону выделения нуклеиновых кислот размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей микробиологической лаборатории допускается выделение НК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ и работ по накоплению ПБА. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения нуклеиновых кислот (НК), в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе (или боксе биологической безопасности) для выделения НК не допускается проведение других работ.

4.2.9. В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.

4.2.10. При необходимости этап выделения НК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической безопасности) - для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения НК.

4.2.11. Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом.

4.2.12. При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.

4.2.13. Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.

4.2.14. Лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением в соответствии с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Все помещения лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.

4.2.15. При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице.

Наименование помещения	Кратность воздухообмена (м3/ч)
	приток	вытяжка
Зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала	5	6
Зона выделения нуклеиновых кислот (НК)	5	6
Зона приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР	5	5
Зона детекции продуктов амплификации	5	7

4.2.16. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры в соответствии с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

4.2.17. Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими.

4.2.18. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов.

4.2.19. Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами в соответствии с "Методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях" N 11-16/03-06 от 28.02.95. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/м3.

4.2.20. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.

4.2.21. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения.

4.3. Требования к лабораторному оборудованию

4.3.1. Комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых наборов реагентов для выделения НК, амплификации и детекции результатов исследований. Помещение для каждого этапа проведения ПЦР обеспечивают своим набором лабораторного оборудования (прилож. 2).

4.3.2. Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Средства измерения регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости.

4.3.3. Для проведения исследования используют приборы и расходные материалы (пробирки, наконечники к микродозаторам), исключающие возможность перекрест ной контаминации исходного материала, выделенных НК и продуктов ПЦР. Для этого используют:

- термостаты с твердотельным термоблоком;

- пробирки с плотно закрывающимися крышками;

- одноразовые пробирки и наконечники к микродозаторам;

- наконечники, строго соответствующие автоматическим пипеткам, а пробирки для амплификации - термоциклерам (в соответствии с инструкцией фирмы - производителя прибора), смена наконечников после завершения каждой манипуляции является обязательной;

- специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах.

4.3.4. Микродозаторы, рабочая поверхность и наружная поверхность корпуса приборов должны быть устойчивы к действию моющих и дезинфицирующих средств и ультрафиолетового излучения.

4.3.5. Для каждого этапа проведения ПЦР-исследований необходимо предусмотреть наличие холодильников (прилож. 2):

- в комнате приема материала от 4 до 8°С, минус 20°С (для хранения исследуемых проб);

- в комнате выделения НК от 4 до 8°С и минус 20°С для хранения набора выделения НК; от 4 до 8°С - для хранения препаратов НК; не допускается хранение препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;

- в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8°С и минус 20°С - для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;

- в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8°С - для хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.

5. Требования к проведению работ

5.1. Не допускается проведение исследований методом ПЦР в помещениях, где осуществляют работы по накоплению ПБА и генно-инженерные работы.

5.2. Работу с ПБА методом ПЦР выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием, прошедшие подготовку на лицензированных курсах специализации (повышения квалификации) по молекулярно-генетическим (ПЦР) методам диагностики.

5.3. Персонал допускают к работе с ПБА только после проведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности.

5.4. В ПЦР-лаборатории, выполняющей работы с ПБА, используют дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в установленном порядке.

5.5. Каждое помещение для проведения исследований методом ПЦР оснащают индивидуальным набором соответствующего лабораторного оборудования, расходных материалов и одежды, используемых только в данном помещении.

5.6. При проведении исследований методом ПЦР неукоснительно соблюдают следующие правила последовательной обработки материала.

5.6.1. Весь поступающий материал направляют в комнату приема материала.

5.6.2. Поступивший материал маркируют и регистрируют в специальном журнале.

5.6.3. Первичную обработку материала (взятие, маркировка и центрифугирование проб и др.) проводят только в комнате приема биологического материала.

5.6.4. В помещение выделения НК материал доставляют только в закрытых одноразовых пробирках в виде маркированных аликвот.

5.6.5. Передачу и доставку аликвот проб обработанного и обеззараженного материала, а также пробирок с продуктами ПЦР из одного помещения в другое осуществляют в закрывающихся металлических или пластмассовых контейнерах.

5.6.6. После проведения детекции и учета результатов исследования пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к микродозаторам подвергают первичной обработке дезинфицирующими растворами, вызывающими деградацию ДНК (например: 0,2%-ный раствор ДП-2Т или другие, аналогичные ему, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке). Процедуру проводят непосредственно в комнате учета результатов амплификации.

5.6.7. Окончательную дезактивацию использованных расходных материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной комнате.

5.6.8. Соблюдают поточность продвижения исследуемого материала и его производных (пробы ДНК или РНК, продукты ПЦР).

5.7. Строго соблюдают условия хранения всех реагентов и образцов ДНК согласно инструкции к набору реагентов. Образцы ДНК хранят отдельно от реагентов. Не допускается использование реагентов с истекшим сроком годности или хранившихся в условиях, не соответствующих требованиям, изложенным в инструкциях.

5.8. По окончании работы все объекты, содержащие ПБА, убирают в хранилища (холодильники, шкафы и т.д.), после чего рабочие поверхности в обязательном порядке подвергаются дезинфекции.

5.9. Остатки ПБА и посуду, использованную на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР, собирают в закрывающиеся емкости и передают в автоклавную. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть не допускается.

5.10. Перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания осуществляют в закрывающихся емкостях, исключающих инфицирование во время транспортирования.

5.11. Во всех помещениях лаборатории регулярно проводят влажную уборку. Каждую рабочую зону ПЦР-анализа обеспечивают индивидуальным промаркированным набором уборочного инвентаря. Не допускается использовать уборочный инвентарь для уборки других помещений.

5.12. Сотрудников каждой рабочей зоны обеспечивают спецодеждой: медицинским халатом, шапочкой, перчатками и сменной обувью. При работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать бахилы. Перемещение одежды из зоны в зону категорически не допускается. Рекомендуется использование одноразовой одежды. Обработку рабочей одежды из зоны детекции продуктов амплификации проводят отдельно от одежды из других зон. Обеззараживание рабочей одежды проводят в соответствии с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

5.13. Лабораторию обеспечивают аптечкой стандартной комплектации для оказания первой медицинской помощи.

6. Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала

6.1. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". В комнатах, в которых проводят работу с выделенными НК, рабочие поверхности, штативы, оборудование следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами. Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и штативов 1 N соляной кислотой.

6.2. Обеззараживание проб проводят в соответствии с МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР".

7. Действия при возникновении контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами

7.1. При возникновении контаминации лаборатории проводят следующие мероприятия (прилож. 3):

- утилизацию всех находящихся в "контаминированной" зоне реактивов;

- утилизацию исследуемых материалов на всех промежуточных стадиях обработки (кроме исходной);

- генеральную уборку, химическую и ультрафиолетовую дезинфекцию всех поверхностей лабораторных помещений;

- дезинфекцию мебели, рабочих поверхностей, а также поверхностей корпусов приборов и оборудования химическим методом и ультрафиолетовым излучением;

- обработку паром под давлением всей спецодежды "контаминированной" зоны.

7.2. Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля.

7.3. Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.

8. Оценка и контроль качества работы ПЦР-лаборатории

8.1. В ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III - IV групп патогенности, проводят внутрилабораторный контроль качества дезинфекции, исследование смывов с рабочих поверхностей и воздушной среды боксов.

8.2. В ПЦР-лаборатории проводят внутрилабораторный контроль качества ПЦР-исследований. ПЦР-лаборатория принимает участие во внешнелабораторном контроле качества деятельности генодиагностических лабораторий.

8.3. Внутрилабораторный контроль проводят с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.

8.4. Контроль осуществляют путем исследования шифрованных аттестованных контрольных панелей, содержащих "положительные" и "отрицательные" пробы.

8.5. Количество проб зависит от объема проводимых исследований и должно быть достаточным для оценки работы сотрудников и выявления контаминированных участков лаборатории.

8.6. Для выявления возможной контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами контроль проводят путем взятия смывов с поверхностей. Смывы с поверхностей берут стерильными ватными тампонами (зондами). Перед взятием смывов тампоны (зонды) смачивают стерильным физиологическим раствором или ТЕ-буфером (10 mM Tris, 1 mM ЭДТА), после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности. После взятия смыва зонды помещают в микропробирки типа "эппендорф" с 300 - 400 мкл ТЕ-буфера, вращают в течение 10 - 15 с, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.

Полученные суспензии центрифугируют при 8 000 g (12 000 об./мин) в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения НК используют 0,1 - 0,2 мл надосадочной фракции.

8.7. В качестве критериев оценки качества исследований методом полимеразной цепной реакции в лаборатории учитывают результаты внутреннего и внешнего лабораторного контроля, а также отсутствие случаев лабораторной контаминации нуклеиновыми кислотами.

______________________________

* Помещения могут быть объединены.

** Помещения могут быть общими с другими подразделениями учреждения.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко