Государственный стандарт РФ ГОСТ Р 51435-99 (ИСО 8128-1-93) "Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Метод определения содержания патулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. N 590-ст)

Apple juice, apple juice concentrates and drinks containing apple juice. Method for determination of patulin content using high performance liquid chromatography

Дата введения - 1 января 2001 г.

Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания патулина в яблочном соке, концентрированных яблочных соках и напитках, содержащих яблочный сок, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предел обнаружения патулина настоящим методом составляет 10  при условии, что взятый для анализа объем пробы готового к употреблению сока составляет 5 .

2 Сущность метода

Метод основан на экстракции патулина из исследуемой пробы этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в водный раствор карбоната натрия и количественном и качественном анализе экстракта с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием спектрофотометрического детектора в ультрафиолетовой области.

3 Реактивы

Используют реактивы аналитической чистоты и воду квалификации "для ВЭЖХ".

3.1 Растворитель: этилацетат.

3.2 Подвижная фаза - раствор ацетонитрила в воде объемной концентрации 10%.

3.3 Экстрагирующий раствор - водный раствор безводного карбоната натрия концентрации 14 .

3.4 Ацетатный буфер, рН 4.

Смешивают 16,4  уксусной кислоты [с () = 0,2 ] с 3,6  раствора ацетата натрия [с () = 0,2 ].

3.5 Уксусная кислота, ледяная.

3.6 Стандартный раствор патулина ().

3.6.1 Приготовление стандартного раствора

Навеску патулина массой 10,0 мг, взятую с точностью до 0,1 мг, растворяют в мерной колбе с одной отметкой вместимостью 100  в ацетатном буфере (3.4). Объем содержимого в колбе доводят до метки ацетатным буфером.

Пипеткой переносят 10,0  приготовленного раствора в другую мерную колбу с одной отметкой вместимостью 100 , объем содержимого в колбе доводят до метки ацетатным буфером. Массовая концентрация патулина в приготовленном стандартном растворе составляет около 10 .

Измеряют оптическую плотность стандартного раствора при длине волны 276 нм на подходящем спектрофотометре с использованием кварцевых кювет рабочей длиной 10 мм.

3.6.2 Расчет концентрации стандартного раствора патулина

Концентрацию стандартного раствора патулина (3.6.1) , , вычисляют по формуле

,

(1)

где А - оптическая плотность стандартного раствора патулина;

- молярный показатель поглощения раствора патулина при длине волны 276 нм, ( = 14600);

М - молярная масса патулина, г/моль;

С - постоянная прибора (обычно С = 1).

4 Приборы и лабораторное оборудование

Перед использованием лабораторное оборудование промывают раствором гипохлорита натрия концентрации 10 .

Обычное лабораторное оборудование, в частности следующее:

4.1 Жидкостный хроматограф, снабженный спектрофотометрическим детектором в ультрафиолетовой области (пригодным для работы при длине волны 276 нм) и самописцем или интегратором.

4.2 Обращенно-фазовая колонка ODS* или другая аналогичная колонка со следующими параметрами:

- эффективность не менее 35000 теоретических тарелок на метр;

- длина 250 мм;

- внутренний диаметр 4,6 мм;

- неподвижная фаза размером частиц 5 мкм.

5 Отбор проб

Проба, поступающая в лабораторию, должна быть представительной и без следов порчи или изменения свойств продукта при транспортировании и хранении.

6 Проведение испытаний

6.1 Приготовление испытуемого раствора

При испытаниях концентрированных яблочных соков их разводят водой 1:5 по объему. Дальнейшую процедуру проводят для всех продуктов одинаково, как описано ниже.

6.1.1 Пробу объемом 5,0  экстрагируют порцией этилацетата объемом 5,0  (3.1) в течение не менее 1 мин. Экстракцию повторяют еще два раза новыми порциями этилацетата объемом по 5,0 . Этилацетатные фазы объединяют и экстрагируют раствором карбоната натрия (3.3) объемом 2,0 .

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Экстракцию раствором карбоната натрия проводят как можно быстрее, например в течение 1 - 2 мин, из-за нестабильности патулина в щелочной среде.

6.1.2 Карбонатную фазу (6.1.1) экстрагируют свежей порцией этилацетата объемом 5,0 , экстракт объединяют с предыдущими порциями. Карбонатную фазу отбрасывают. К экстракту добавляют 5 капель уксусной кислоты (3.5), смесь перемешивают и упаривают на ротационном испарителе до объема 1 - 2 .

6.1.3 Полученный таким образом раствор количественно переносят во флакон вместимостью около 5  с помощью нескольких порций этилацетата объемом около 1  каждая. Раствор упаривают досуха в токе азота при температуре 40°С. Остаток растворяют в 0,5  подвижной фазы (3.2) или ацетатного буфера (3.4).

6.2 Построение градуировочного графика

Порции стандартного раствора патулина (3.6.1) объемом 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 и 7,5  переносят пипеткой в пять мерных колб с одной отметкой вместимостью 10 , объем содержимого в колбах доводят до метки ацетатным буфером (3.4); получают градуировочные растворы.

Устанавливают скорость потока подвижной фазы через колонку жидкостного хроматографа около 1 . Чувствительность детектора хроматографа устанавливают таким образом, чтобы оптической плотности 0,01 соответствовал сигнал величиной на полную шкалу регистрирующего устройства.

В хроматограф (4.1) вводят от 0,010 до 0,030  каждого градуировочного раствора.

Градуировочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию патулина в микрограммах на кубический сантиметр, по оси ординат - соответствующие величины высоты или площади пиков.

6.3 Проведение определения

В хроматограф вводят от 0,010  до 0,030  испытуемого раствора (6.1.3) при тех же условиях, что и при построении градуировочного графика.

Идентификацию пика патулина в испытуемом растворе проводят сравнением с пиками патулина в градуировочных растворах. Следует отличать пик патулина от пика оксиметилфурфурола (ОМФ).

7 Обработка результатов

Концентрацию патулина в испытуемом растворе определяют непосредственно по градуировочному графику (6.2). Содержание патулина в продукте , , вычисляют по формуле

,

(2)

где - концентрация патулина в испытуемом растворе, определенная по градуировочному графику, .

- объем, до которого сконцентрирован этилацетатный экстракт, ;

- объем пробы продукта, взятый для экстракции, .

8 Точность метода

8.1 Сходимость результатов

r = 41,9 ; = 14,9 ,

где r - предел сходимости;

- среднеквадратическое отклонение сходимости.

8.2 Воспроизводимость результатов

R = 47,5 ; = 22,6 ,

где R - предел воспроизводимости;

- среднеквадратическое отклонение воспроизводимости.

9 Протокол испытаний

В протоколе испытаний указывают:

- метод испытаний;

- результат испытаний;

- окончательный результат с оценкой сходимости, если была проверена сходимость результатов.

Также следует отметить особенности проведения испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные, с побочными обстоятельствами, способными повлиять на результат испытаний.

Протокол испытаний должен содержать информацию, необходимую для полной идентификации образца.

________________

* ODS - октадецилсилан.