Купить систему ГАРАНТ Получить демо-доступ Узнать стоимость Информационный банк Подобрать комплект Семинары

Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства МУ 3049-84 (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР от 29 июня 1984 г.)

1. Аппаратура

 

1. Автоклав (стерилизатор паровой), ГОСТ 19569-74.

2. Бумага масштабно-координатная марки ПЛН ГОСТ 334-73 (полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков).

3. Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г ТУ 25.06.1131-75.

4. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания - 0,2 кг по ГОСТу 24104-80.

5. Водяная баня лабораторная (аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42.1091-63).

6. Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090-74.

7. Ионометр универсальный (pH-метр) ЭВ-74.

8. Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000  по ГОСТу 10394-72.

9. Линейка по ГОСТу 17435-72.

10. Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 .

11. Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 по ГОСТу 23932-79.

12. Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284-78.

13. Микроразмельчитель тканей типа РТ-2, МРТУ 04.1.1505-63 (или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147-73 и кварцевый песок).

14. Ножницы по ГОСТу 21239-77, скальпель ГОСТ 21240-77, пинцеты по ГОСТу 31241-77.

15. Палочки стеклянные.

16. Петля бактериологическая.

17. Пробочное сверло 9 мм.

18. Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0  по ГОСТу 20292-74.

19. Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932-79.

20. Пробирки центрифужные емкостью 10 .

21. Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.

22. Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.

23. Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878-60.

24. Трафарет для вырезания лунок.

25. Уровень для установления горизонтальной поверхности.

26. Холодильник бытовой по ГОСТу 16317-70.

27. Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107-71; центрифуга настольная ЦЛН-2, МРТУ 421742-63.

28. Цилиндры мерные на 50, 100, 250, 1000 по ГОСТу 1770-74.

29. Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932-79, а также чашки из полимерных материалов.

30. Штативы для пробирок на 20 - 40 гнезд по ТУ 64-1-2669-78.

2. Компоненты питательных сред

 

1. Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206-71.

2. Мясо-пептонный бульон по ГОСТу 20730-75.

3. Дрожжевой экстракт (экстракт кормовых дрожжей сухой, производство МНИИВС).

4. Мясная вода по ГОСТу 20729-75.

5. Панкреатический гидролизат казеина.

6. Пепоин медицинский.

7. Пептон сухой ферментативный, ГОСТ 13805-76.

8. Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130 - 140 мг% по ГОСТу 10444.1-75.

3. Реактивы

 

1. Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975-75.

2. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

3. Натрия гидрат окиси (натр едкий), ГОСТ 4328-66, 10% р-р.

4. Натрий лимоннокислый, х.ч., ГОСТ 22280-76.

5. Калия фосфат однозамещенный, х.ч., ГОСТ 4198-65.

6. Калия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 2493-65.

7. Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 11773-66.

8. Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67.

9. Кислота соляная, х.ч., уд. вес 1,18 - 1,19.

10. Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233-77.

11. Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

4. Питательные среды

 

Среда N 1

Дистиллированная вода

-

10,0 мл

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Агар-агар

-

6,0 г 0,1

pH среды

-

8,0

 

Среда N 2

Пептон

-

10,0 г

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Хлористый натрий

-

5,0 г

Агар-агар

-

20,0 г

Мясная вода 1:2

-

до 1000 мл

pH среды

-

7,00,1

 

Среда N 3

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 100 мг%

-

1000 мл

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Агар-агар

-

20,00,1

Глюкоза (добавляют в расплавленный агар 40% глюкозу в количестве 2,5 мл на 100 мл среды)

 

 

pH среды после стерилизации

-

6,40,1

 

Среда N 4

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%

-

1000 мл

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Агар-агар

-

25,00,1 г

pH среды

-

6,1 0,1

 

Среда N 5

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%

-

1000 мл

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Агар-агар

-

20,00,1 г

-

2,50,05 г

pH среды

-

7,90,1

 

Среда N 6

Пептон

-

10,00,1 г

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Натрий хлористый

-

5,00,05 г

Агар-агар

-

20,00,1 г

Мясная вода 1:2

-

до 1000 мл

pH среды

-

6,50,1

 

Среда N 7

Пептон

-

6,00,1 г

Стерилизация автоклавированием при 115°C 3°C 20 мин. 3 мин.

Панкреатический гидролизат казеина, сухой

-

4,00,05 г
(или 40,01 мл жидкого)

Дрожжевой экстракт, сухой

-

3,00,05 г
(или 30,01 мл жидкого)

Мясной экстракт, сухой

-

1,50,01 г
(или 15,00,5 мл мясной воды)

Глюкоза

-

1,00,01 г

Агар-агар

-

20,00,1 г

Вода дистиллированная

-

до 1000 мл

pH среды

-

6,50,1

 

Среда N 8

Мясная вода 1:2

-

5001 мл

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

Пептон

-

5,00,05 г

Хлористый натрий

-

2,5 г

Фосфат калия двухзамещенный

-

3,0 г

Агар-агар

-

6,0

Вода дистиллированная

-

до 1000 мл

pH среды

-

7,8 - 8,0

5. Буферные растворы для экстракции антибиотиков из исследуемого материала

 

1.

Физиологический раствор

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°С 20 мин. 3 мин.

NaCl - 8,5 г

- до 1 л

2.

Цитратно-солянокислый, pH 5,10,1

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

лимоннокислый натрий - 20,6 г

HCl, уд. вес 1,19 - 1,81 мл

- до 1 мл

3.

2% раствор пепсина на цитратно-солянокислом буфере с pH 5,10,1

пепсин медицинский - 2 г

(Асептично взвешенную навеску пепсина вносят в стерильный буфер перед проведением анализа)

буфер - 100 мл

4.

Фосфатный буфер pH 6,0

Стерилизация автоклавированием при 121 град C 1°C 20 мин. 3 мин.

- 7,72 г или

- 2 г

- 1,78 г

- 8 г

- до 1 л

- до 1 л

5.

2% раствор пепсина на фосфатном буфере с pH 6,0

пепсин медицинский - 2 г

(Асептично взвешенную навеску пепсина вносят в стерильный буфер перед проведением анализа)

буфер - 100 мл

6.

Фосфатный буфер pH 7,90,1

Стерилизация автоклавированием при 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

- 16,73 г

- 0,523 г

- до 1 л

7.

Цитратно-солянокислый, pH 3,10,1

I раствор - 22,6 г лимоннокислого натрия растворяют в 1 л воды;

II раствор - 8,2 мл конц. HCl с уд. весом 1,19 растворяют в 1 л дистиллированной воды

Буфер готовят при смешивании двух растворов;

62 мл I раствора + 100 мл II раствора, pH буфера 3,00,1

Стерилизация - 121°C 1°C 20 мин. 3 мин.

6. Выращивание тест-культур и приготовление рабочих концентраций

 

Тест-культурами служат специально отобранные, образующие и необразующие споры, непатогенные или условно патогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотиков в агар.

 

6.1. Приготовление спор Bac. cereus ATCC 11778

 

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 7,10,1) и выращивают при 29,01,0°C в течение 20,02,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 8,02,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 2001,0 мл 2% МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30°C. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80 - 90% спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной воды. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65 - 70°C в течение 30,01,0 мин., трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин., каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до получения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,01,0 мин. при 65 - 70°C. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4°C и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.

6.2. Приготовление рабочей концентрации Bac. cereus АТСС 11778

 

Небольшое количество (0,2 мл) споровой взвеси Bac. cereus вносят в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед. полученную взвесь доводят до концентрации микробных тел в 1 мл. Затем 0,2 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60°C питательной среды. В итоге нагрузка тест-культуры в питательной среде составляет спор в 1 мл.

6.3. Выращивание спор Bac. mycoidis 537

 

Культуру пересевают на скошенный агар (2% МПА, среда N 2, pH 7,90,1) и выращивают при 37°C в течение 202,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 72,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,10,1 (среда N 4). Засеянные матрацы выдерживают при 37°C в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 855,0% спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при 65 - 70°C в течение 30 мин., а затем поступают так же, как и при получении спор Bac. cereus АТСС 11778, п. 6.1.

 

Таблица 1

 

Тест-культуры, питательные среды, буферные растворы, рабочие концентрации стандартов антибиотиков, применяемые для определения антибиотиков в пищевых продуктах

 

Антибиотик

Текст-микроб

Ориентировочная посевная доза на 1 мл среды

Питательные среды

Буферные растворы

Кол-во среды на чашку

Рабочая концентрация стандарта антибиотика в мкг/мл

Тетрациклины

Bac. cereus ATCC 11778

1 млн. спор

N 2, N 3

N 2, N 3

10 мл

0,05

Стрептомицин

Bac. mycoidis 537

20 млн. спор

N 2, N 4

N 4, N 6

10 мл

2,0

Пенициллин

Sur. lutea ATCC 9341

15 млн. микробных тел

N 7

N 4, N 5

10 мл

0,05

Гризин

Bac. cubtilis ATCC 6633

5 млн. спор

N 5, N 6, N 8

N 1, N 7

10

0,4

Цинкбацитрацин

M. flavus ATCC 10240

10 млн. микробных тел

N 6

 

10

0,1

6.4. Приготовление рабочей концентрации Bac. mycoidis 537

 

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1 - 0,2 мл взвеси спор Bac. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед. разводят споры до 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60°C питательную среду из расчета 20 млн. спор в 1 мл среды, т.е. 2 мл 1 млрд. взвеси в 100 мл среды.

6.5. Выращивание S. lutea АТСС 9341 и приготовление микробной взвеси

 

Культуру выращивают в течение 202,0 час. в пробирках со средой N 7, после чего ее смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4°C. Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд. микробных тел так же, как и Bac. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50°C питательную среду N 7 из расчета 30 млн. микробных тел на 1 мл среды, т.е. 3 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.

6.6. Выращивание спор Bac. cubtilis АТСС 6633

 

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 6,50,1) и выращивают при 37°C в течение 18 - 20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 72,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,90,1 (среда N 5). Выращивают при 37°C в течение 7 суток, а затем поступают так же, как при получении спор Bac. cereus АТСС 11778.

6.7. Приготовление взвеси спор Bac. cubtilis АТСС 6633

 

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют небольшое количество (0,1 - 0,2 мл) споровой взвеси Bac. cubtilis АТСС 6633 и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед. полученную взвесь доводят до концентрации спор в 1 мл. Затем 1  мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60°C1°C питательной среды.

6.8. Выращивание M. flavus АТСС 10240

 

Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6,50,1 (среда N 6). Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,50,1 при 37°C в течение 191,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд. микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50°C питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.

7. Приготовление контрольных (рабочих) концентраций стандартных антибиотиков

 

При определении остаточных количеств антибиотиков для приготовления контрольных концентраций используют стандарты антибиотиков, т.е. очищенные образцы препарата, содержащие строго определенное количество единиц действия в 1 мг.

 

7.1. Приготовление рабочей концентрации хлортетрациклина (ХТЦ)

 

Произвольную навеску хлортетрациклина (5 - 15 мг) растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл кислоты) и получают основной раствор. Далее по схеме N 1 на буфере N 2 готовят контрольное разведение антибиотика. Пример. Стандарт ХТЦ содержит 930 ед./мг. Навеску в 100,0001 мг растворяют в 100,0001 мл 0,1 н HCl. Основной раствор содержит 930 ед./мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед./мл.

 

Схема N 1

 

NN

Соотношение растворов

Концентрация антибиотиков ед./мл

1.

1 мл основного раствора

+ 8,3

буфера

pH 5,2

100

2.

1 мл раствора N 1

+ 9 мл

буфера

pH 5,2

10

3.

0,1 мл р-ра N 2

+ 9,9 мл

-"-

-"

0,1

4.

5 мл раствора N 3

+ 5 мл

-"-

-"-

0,05

 

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

7.2. Приготовление контрольной концентрации стрептомицина

 

Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (N 4) в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера). Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,90,1 (буф. N 6) готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед./мл.

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

 

Схема N 2

 

NN
раствора

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед./мл

1.

1 мл основного раствора

+ 9 мл

буфера

pH 7,80,10

76

2.

1 мл 1 раствора

+ 9 мл

-"-

7,6

3.

1 мл 2 раствора

+ 3,8 мл

-"-

2,0

7.3. Приготовление контрольной концентрации пенициллина

 

Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (буф. N 4) в соотношении 1:1, т.е. 1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина - 0,05 ед./мл.

 

Схема N 3

 

Примерная схема приготовления растворов пенициллина из стандартного активностью 1586 ед./мл

 

NN
растворов

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед./мл

1.

0,6 мл стандартного раствора

+ 0,4 мл

буфера

pH 6,0

1000

2.

0,1 мл раствора

+ 9,9 мл

буфера

pH 6,0

10

3.

1 мл 2 раствора

+ 9 мл

-"-

-"-

1

4.

1 мл 3 раствора

+ 9 мл

-"-

-"-

0,1

5.

1 мл 4 раствора

+ 1 мл

-"-

-"-

0,05

7.4. Приготовление контрольной концентрации гризина

 

Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина (5 - 15 мг) и растворяют ее в 0,01 н HCl из расчета 1 мг или 1000 ед./мг.

Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на буфере N 7 (pH 3,2) по схеме N 4.

 

Схема N 4

 

NN
растворов

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед./мл

1.

1 мл основного раствора

+ 9 мл

буфера

100

2.

1 мл раствора N 1

+ 9 мл

-"-

10

3.

4 мл раствора N 2

+ 6 мл

-"-

4

7.5. Приготовление контрольной концентрации бацитрацина

 

Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина (10 - 20 мг) и растворяют ее в фосфатном буфере pH 6,0 (буфер N 4) до получения концентрации 100 ед./мл.

Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят (рабочее) контрольное разведение, равное 0,2 ед./мл по схеме N 5.

 

Схема N 5

 

NN
растворов

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед./мл

1.

1 мл основного раствора

+ 9 мл

буфера

10

2.

2 мл раствора N 1

+ 8 мл

-"-

2

3.

1 мл раствора N 2

+ 9 мл

-"-

0,2

8. Подготовка чашек Петри

 

Колбы с агаром помещают в кипящую водяную баню. Для определения тетрациклинов используется среда N 3, стрептомицина - N 4, пенициллина - N 7, гризина - N 8, цинкбацитрацина - N 6. Расплавленный агар охлаждают до определенной температуры и вносят в него необходимое количество взвеси тест-культуры: аспорогенные культуры (Sar lutea, M. flavus) засевают при температуре среды не выше 48°C2°C, а споровые (Bac. cereus, Bac. cubtilis, Bac. mycoidis) при 58°С2,0°C. Среду перемешивают круговыми движениями и разливают в чашки Петри по 10,00,1 мл, установленные строго на горизонтальном столе.

После застывания сред под дно чашек подкладывают трафарет (рис. 1) и пробочным сверлом N 3 (9 мм) вырезают 6 лунок, вырезанные блоки вынимают скальпелем.

9. Ход определения

 

9.1. Исследование молока, молочных продуктов, яиц

 

Пробы молока и жидких молочных продуктов по 10,00,1 мл, творога по 10,00,1 г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,00,1 мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3; для стрептомицина - буфер N 6; пенициллина - буфер N 5 (см. раздел 5. Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков). Таким образом, получается разведение 1:2.

Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,05,0°C в течение 100,1 мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,00,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,00,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3, стрептомицина - буфер N 6.

Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,01 мин. при 37°C0,1°C, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,01,0°C в течение 20,00,1 мин.

Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000100  об./мин. в течение 10,00,1 мин. Надосадочная жидкость является первым разведением (1:2) и готова для внесения в лунки. Второе разведение (1:4) готовят в химических пробирках: 1,00,1 мл надосадочной жидкости приливают к 1,00,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).

В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,050,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2 - 4 чашки Петри, т.е. на каждое разведение по 1 - 2 чашки.

После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 202 часа при температуре 291,0°C (при определении тетрациклинов и пенициллина) или при 371,0°C (при определении стрептомицина).

На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах (п. 10.1).

9.2. Исследование мяса и мясных продуктов

 

Навески по 10,00,1 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком (предварительно простерилизованным), приливая 20,00,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3, цинкбацитрацина - N 4, гризина - физиологический раствор (0,85% NaCl). При наличии микроразмельчителя тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,00,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмельчителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.

Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,50,5 час.

При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 655°C 30 мин. для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.

Центрифугируют пробы при 3000  об./мин. в течение 201 мин.

Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем п. 9.1 (когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из нее разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее по тексту п. 9.1), либо следующим образом:

Надосадочную жидкость в количестве 0,050,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2 - 3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при +4°C для преддиффузии.

Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 180,5 час. при 291°C (определение тетрациклинов) либо при 370,1°C (определение гризина и цинкбацитрацина), после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах (п.п. 10.1, 10.2).

10. Учет результатов

 

Измеряют зоны задержки роста тест-культур и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах либо по таблицам, составленным В.С. Дмитриевой и С.М. Семеновым (Дмитриева В.С., Семенов С.М. "Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов", М., 1965), (п. 10.1) или по стандартным кривым (п. 10.2).

 

10.1. Форма записи измерения зон задержки роста тест-микробов при расчете активности антибиотиков, содержащихся в виде остаточных количеств в пищевых продуктах, по таблицам Дмитриевой В.С.

 

(Примерный образец)

 

N
чашки

Диаметры зон задержки роста тест-микробов в мм

испытуемое разведение (1:3)

стандартное разведение 0,05 ед./мл (контроль)

испытуемое разведение (1:6)

стандартное разведение 0,05 ед./мл (контроль)

1

20

20

19,5

16,5

16,5

16,5

16

16

16,5

16

16

16

среднее

19,8

16,5

16,1

16

2

19

19

19,5

16

16

16

17,5

17,0

16,5

16,5

16,5

16,5

среднее

19,1

16

17

16,5

 

В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед./мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.

 

Разведение

Зоны в мм

Поправки

Зоны после поправки

Среднее 2-х чашек

1:3

19,8
19,1

+0,5
+1,0

20,3
20,1

20,2

1:6

16,1
17,0

+1,0
+0,5

17,1
17,5

17,3

 

Определяют разность диаметров зон подавления роста при двух разведениях испытуемого препарата:

 

20,2 - 17,3 = 2,9 мм.

 

По таблице, соответствующей этой разности диаметров зон, находят значение активностей соответствующих диаметров зон подавления роста после поправки. В вертикальном столбце находят целые числа, в горизонтальном - десятые доли. Полученные значения умножают на соответствующие показатели разведения (2 и 4; 3 и 6).

 

2,15 ед./мл x 3 = 6,45 ед./мл (зона 20,2)
1,08 ед./мл x 6 = 6,48 ед./мл (зона 17,3)
________________________________
среднее 12,93 : 2 = 6,465 ед./мл

 

Пример расчета. Если контрольная концентрация больше или меньше 1 ед./мл, то надо соответственно умножить или разделить на кратность этого числа 1 (К = 0,05 ед./мл, кратность = 20).

 

6,465 : 20 = 0,323, соответствует 6,465 x 0,05;

К = 2 ед./мл - 6,465 x 2 = 12,93 ед./мл.

 

10.2. Построение стандартных кривых и расчет концентрации антибиотиков

 

10.2.1. Построение стандартной кривой при определении концентрации хлортетрациклина

 

Для построения стандартной кривой используются рабочие растворы с концентрациями: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл приготовленные по схеме N 6.

 

Схема N 6

 

N
р-ра

Содержание растворов

Концентрация в ед./мл

1.

1 мл основного р-ра

+ 8,3

буфера pH 5,10,1 (буфер N 2)

100

2.

1 мл р-ра N 1

+ 9 мл

буфера pH 5,10,1 (буфер N 2)

10

3.

2 мл р-ра N 2

+ 5 мл

-"-

4

4.

1 мл р-ра N 3

+ 9 мл

-"-

0,4

5.

5 мл р-ра N 4

+ 5 мл

-"-

0,2

6.

5 мл р-ра N 5

+ 5 мл

-"-

0,1

7.

5 мл р-ра N 6

+ 5 мл

-"-

0,05

8.

5 мл р-ра N 7

+ 5 мл

-"-

0,025

9.

2 мл р-ра N 7

+ 8 мл

-"-

0,01

 

В несколько проб (по 5 г) измельченной мышечной ткани или субпродуктов, не обработанных антибиотиками, вносят раствор антибиотика с вышеперечисленными концентрациями в количестве 5 мл. Перемешивают и оставляют на 181 час. при температуре +4°C. Затем центрифугируют при 3500500  об./мин в течении 25 минут. Надосадочная жидкость служит стандартом определенной концентрации антибиотика при построении кривой на полулогарифмической сетке (рис. 2). Надосадочную жидкость соответственно 5 - 6 рабочим концентрациям стандартного антибиотика вносят в количестве 0,050,001 мл в 2 - 3 лунки на 2 параллельных чашках Петри с засеянной тест-микробом средой. Инкубируют чашки, как указано в п. 9.2.

Рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микробов для каждой концентрации рабочего раствора стандарта из двух параллельных чашек и наносят их в виде точек на оси абсцисс. Из этих точек, а также из точек на оси ординат, соответствующих концентрациям рабочих растворов 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,01 ед./мл, проводят вертикальные и горизонтальные прямые. Линия, соединяющая точки пересечения указанных прямых, - стандартная кривая*. Стандартную кривую строят для каждой партии питательной среды.

10.2.2. Построение стандартной кривой для определения концентрации гризина

 

Для построения стандартной кривой при определении гризина используются растворы с концентрациями: 1,6; 1,2; 0,8; 0,6; 0,4; 0,3; 0,2, после их контакта с мышечной тканью или субпродуктами. Указанные концентрации гризина делаются на физрастворе (0,85% NaCl) по схеме N 7.

 

Схема N 7

 

N р-ра Соотношение растворов Концентрация
в ед./мл
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
р-р 1 мл основного р-ра + 9 мл физ. р-ра
-"- 8 мл 1 р-ра + 2 мл физраствора
-"- 6 мл 1 р-ра + 4 мл -"-
-"- 2 мл 2 р-ра + 8 мл -"-
-"- 1 мл 3 р-ра + 9 мл -"-
-"- 1 мл 4 р-ра + 9 мл -"-
-"- 1 мл 5 р-ра + 4 мл -"-
-"- 4 мл 7 р-ра + 2 мл -"-
-"- 6 мл 8 р-ра + 2 мл -"-
-"- 3 мл 8 р-ра + 3 мл -"-
-"- 3 мл 9 р-ра + 3 мл -"-
-"- 4 мл 11 р-ра + 2 мл -"-
100
80
60
16
6,0
1,6
1,2
0,8
0,6
0,4
0,3
0,2

 

Далее поступают согласно методу, описанному в п. 10.2.1 настоящего раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значение концентраций контрольных растворов гризина, указанных выше.

10.2.3. Построение стандартной кривой при определении концентрации цинкбацитрацина

 

Для построения стандартной кривой при определении цинкбацитрацина из основного раствора по схеме N 8 с использованием буфера N 4 готовят рабочие растворы с концентрациями: 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,06; 0,03; 0,02 ед./мл.

 

Схема N 8

 

N р-ра Соотношение растворов Концентрация,
 ед./мл
1 2 3
1 раствор

2 раствор
3 -"-
4 -"-
5 -"-
6 -"-
7 -"-
8 -"-
9 -"-
1 мл основного р-ра + 9 мл фосфатного
буфера
1 мл 1 р-ра + 9 мл фосфатного буфера
4 мл 2 р-ра + 1 мл -"-
1 мл 3 р-ра + 1 мл -"-
1 мл 4 р-ра + 1 мл -"-
1 мл 5 р-ра + 1 мл -"-
6 мл 6 р-ра + 4 мл -"-
1 мл 7 р-ра + 1 мл -"-
2 мл 8 р-ра + 1 мл -"-

10
1
0,8
0,4
0,2
0,1
0,06
0,03
0,02

 

Приготовление рабочих концентраций антибиотика и построение стандартной кривой производят согласно методу, описанному в п. 10.2.1 данного раздела, с учетом того, что на оси ординат откладывают значения концентраций контрольных растворов цинкбацитрацина, указанных выше.

10.2.4. Расчет активности по стандартной кривой

 

Для экстракта (или его значения) исследуемой пробы рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микроба двух параллельных чашек и наносят его в виде точки на оси абсцисс полулогарифмической сетки. Из этой точки восстанавливают перпендикуляр и проводят его до пересечения со стандартной кривой. Через точку пересечения перпендикуляра со стандартной, параллельно оси абсцисс, проводят прямую до пересечения с осью ординат. Точка пересечения параллельной прямой с осью ординат указывает на активность антибиотика в экстракте исследуемой пробы - "С". Если исследовалось разведение экстракта, то полученный показатель его активности умножают на показатель разведения экстракта.

Расчет содержания остаточных количеств антибиотиков в 1 г исследованного продукта (в том случае, когда стандартная кривая построена с использованием стандартных растворов, внесенных в гомогенаты мышечной ткани или субпродуктов) ведется по формуле:

 

X = C x 1,5,

 

где: X - активность антибиотика в 1 г продукта;

C - активность антибиотика в 1 мл экстракта исследуемой пробы;

1,5 - степень разведения пробы буфером, отличная от разведения стандартного гомогената.

В случае, когда для построения стандартной кривой использовались чистые растворы стандартного антибиотика, расчет ведут по той же формуле, изменив лишь степень разведения пробы буфером на 3, а именно: X = C x 3. В данном случае в ответе указывают, что стандартная кривая построена с использованием чистых растворов антибиотиков.

 

Полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков

 

 

Примерная форма представления результатов определения остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах (отдельно по видам антибиотиков)

 

Вид исследуемых продуктов

Общее число проб

Положительные результаты

кол-во проб

в % к общему кол-ву проб

в том числе в ед./мкг/мл/г

0,01 - 0,05

0,051 - 0,1

0,11 - 1,0

1,1 и более

 

 

 

 

 

 

 

 

Мясо

 

 

 

 

 

 

 

Мясопродукты

Молоко

Творог

Сметана

Яйца

ВСЕГО:

 

 

 

 

 

 

 

Примечания

 

1. Для каждой новой партии питательной среды необходимо проверять зоны контрольного разведения стандартного раствора антибиотика.

2. Для внесения в лунки берется то рабочее (контрольное) разведение антибиотика, которое дает диаметр задержки роста тест-культуры, приблизительно 17 мм (16 - 18 мм).

3. Для внесения в лунки испытуемых разведений одной пробы можно пользоваться одной пипеткой, при этом надо начинать с большего разведения (1:4 или 1:6).

4. Каждая партия стандарта пенициллина и стрептомицина отличается своей активностью и поэтому дается примерная схема приготовления рабочего разведения.

5. Стандарты антибиотиков и стандарты мутности можно выписать по следующим адресам:

а) г. Москва, 121002,

Сивцев Вражек, д. 41,

Государственный Институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича;

б) г. Москва,

Звенигородское шоссе, д. 5,

Гос. научно-контрольный институт ветпрепаратов.

 

Заместитель
Главного государственного
санитарного врача СССР

А.И. Заиченко

 

_____________________________

* При отсутствии образцов мышечной ткани и субпродуктов, не обработанных антибиотиками, для построения стандартной кривой можно пользоваться рабочими растворами стандартного хлортетрациклина, приготовленными на буфере N 2 (р-ры 5, 6, 7, 8, 9), непосредственно внося их в лунки на чашке Петри.

 

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Получить доступ к системе ГАРАНТ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.


Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства МУ 3049-84 (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР от 29 июня 1984 г.)


Текст методических указаний официально опубликован не был