Межгосударственный стандарт РФ ГОСТ ISO 22160-2015 "Молоко и молочные напитки. Определение активности щелочной фосфатазы. Метод с применением фотоактивной ферментной системы (EPAS)" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 сентября 2016 г. N 1136-ст)

Milk and milk-based drinks. Determination of alkaline phosphatase activity. Enzymatic photo-activated system (EPAS) method

Дата введения - 1 июля 2017 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС)

2 Внесен Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по переписке (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ISO 3166) 004-97	Код страны по МК (ISO 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт
Украина	UA	Минэкономразвития Украины

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 сентября 2016 г. N 1136-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 22160-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 22160:2007 "Молоко и молочные напитки. Определение действия щелочной фосфатазы. Метод с применением энзиматических фотоактивированных систем" ("Milk and milk-based drinks - Determination of alkaline phosphatase activity - Enzymatic photo-activated system (ERAS) method", IDT)

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF) совместно с Международной ассоциацией химиков-аналитиков (АОАС International).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения активности щелочной фосфатазы в пастеризованном цельном молоке, частично обезжиренном молоке, обезжиренном молоке, сливках и ароматизированном молоке с применением хемилюминесцентного (EPAS) метода.

Метод применяется для молока и молочных напитков из коровьего молока, молока овец, буйволиц и коз.

Метод применяется для жидких проб, в которых после их подготовки (разбавления) активность щелочной фосфатазы составляет меньше 7000 миллиединиц на литр.

Примечание - Было проведено успешное совместное исследование с цельным коровьим молоком, молоком овец, буйволиц и коз, а также обезжиренным коровьим молоком (<0,5% жирности), 20%-ными сливками и 2%-ным молочно-шоколадным напитком).

2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 активность щелочной фосфатазы; ALP (alkaline phosphatase activity): Активность щелочной фосфатазы, содержащейся в продукте, определяемая в порядке, установленном в настоящем стандарте.

Примечание - Активность щелочной фосфатазы выражается в миллиединицах активности фермента на литр (мЕд/л) ([4], [5]).

2.2 единица активности щелочной фосфатазы (unit of alkaline phosphatase activity): Количество фермента щелочной фосфатазы, которое катализирует преобразование 1 мкмоль стабильного ароматического субстрата за минуту.

3 Сущность метода

Активность щелочной фосфатазы измеряют посредством фотоактивации гидролизованного продукта с последующим инструментальным измерением фотоактивации. В присутствии щелочной фосфатазы стабильный ароматический субстрат диоксетан-фосфата гидролизуют при температуре (351)°С для получения фотоактивированного (хемилюминесцентного) продукта. Фотоактивацию продукта усиливают с помощью макромолекулярного повышающего компонента. Реакцию гидролиза останавливают после определенного времени инкубации (3 мин). Количество образовавшегося хемилюминесцентного продукта измеряют и преобразуют в ферментные единицы с помощью люминометра. Градуировка люминометра основана на использовании таблеток с известной ферментной активностью.

4 Реактивы

В ходе анализа используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не установлены другие требования, и дистиллированную, деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.

4.1 Субстрат нехемилюминесцентного эфира диоксетана [0,2 моль/л 3-(-спироадамантанан)- 4-метокси-4-(-фосфат фенил-1,2 диоксетана динатриевой соли в DEAE-буфере с 1% флуорозина] имеется в продаже [например, жидкий реактив Charm АР *].

Рекомендуется хранить субстрат при температуре 0°С - 7°С. При хранении в пластиковых пробирках янтарного цвета и при температуре 4°С субстрат остается стабильным в течение 6 мес. При хранении при температуре 30°С субстрат сохраняет стабильность только в течение 24 ч.

При испытаниях используемый субстрат хранят при температуре 0°С - 7°С или во льду.

4.2 Останавливающий раствор

Останавливающий раствор подготавливают, смешивая одинаковое количество 0,15 моль/л 2-амино-2-метил-1-пропанола и 0,02% бензалкония хлорида с рН 10,7. До использования останавливающий раствор должен находиться при комнатной температуре 18°С - 24°С. Для проверки стабильности раствора, использованного при градуировке, если не используют термозонд, фиксируют и поддерживают температуру в пределах 0,5°С.

Примечание - Останавливающий раствор используют для остановки ферментного гидролиза субстрата эфира диоксетана (4.1).

Имеющийся в продаже останавливающий раствор имеет срок годности 1 год при хранении при температуре 4°С или 2 мес при хранении при комнатной температуре. При ежедневном использовании его рекомендуется хранить при комнатной температуре.

4.3 Рабочие градуировочные средства, например градуировочные таблетки (сухое пастеризованное молоко с измеренным содержанием фосфатазы в виде таблеток для регидратации в молоке) с активностью фосфатазы 87526 мкЕд/л. Таблетки регидратируют в трех различных объемах напитка на основе молока, не содержащего активной фосфатазы, или в отрицательной пробе для испытания (7.2) для создания стандартной градуировочной кривой.

Имеющиеся в продаже градуировочные таблетки хранят при температуре 4°С в течение 2 лет.

4.3.1 Градуировочные средства для жидких неокрашенных молочных продуктов

В каждой из трех пробирок (5.9) вместимостью 50 мл с отметками , и соответственно растворяют одну градуировочную таблетку в 100 мкл дистиллированной воды.

В пробирку добавляют 20 мл, в пробирку - 5 мл, в пробирку - 2,5 мл жидкого молочного продукта белого цвета (не содержащего активной фосфатазы) или отрицательную пробу для испытания (7.2). Получают градуировочные стандарты и с активностью фосфатазы = 44 мЕд/л, = 175 мЕд/л и = 350 мЕд/л соответственно. Пробирки закрывают колпачками и энергично встряхивают их содержимое. Для регидратации содержимого пробирки выдерживают ее в холодильнике в течение 10 мин. Тщательно перемешивают перед применением.

4.3.2 Градуировочные средства для сливок и ароматизированного молока

В каждой из трех пробирок (5.9) вместимостью 50 мл с отметками , и соответственно растворяют по одной градуировочной таблетке в 100 мкл дистиллированной воды.

В пробирку добавляют 10 мл, в пробирку - 5 мл, в пробирку - 2,5 мл сливок или ароматизированного молока (не содержащих активной фосфатазы) или отрицательную пробу для испытания (7.2). Получают градуировочные стандарты , и с активностью фосфатазы = 88 мЕд/л, =175 мЕд/л и = 350 мЕд/л соответственно. Пробирки закрывают колпачками и энергично встряхивают их содержимое. Для регидратации содержимого пробирки выдерживают ее в холодильнике в течение 10 мин. Тщательно перемешивают перед применением.

4.4 Положительная контрольная проба

В качестве положительной контрольной пробы используют лиофилизированную щелочную фосфатазу в колбе янтарного цвета вместимостью 15 мл. Положительную контрольную пробу регидратируют с 10 мл молочного напитка, не содержащего активной фосфатазы, или подготовленной для испытания отрицательной пробой (7.2). Регидратированная положительная контрольная проба содержит 450 мЕд/л фермента фосфатазы.

Контрольную пробу оставляют на 10 мин для регидратации. Энергично встряхивают перед использованием.

Регидратированная положительная проба стабильна при хранении при температуре 0°С - 7°С в течение 48 ч. Положительная контрольная проба, регидратированная с жидким молоком, стабильна в течение 2 мес в замороженном виде при температуре минус 15°С или ниже. Положительную контрольную пробу оттаивают в воде при комнатной температуре. Контрольную пробу энергично встряхивают, чтобы гомогенизировать перед использованием. Запрещается повторное замораживание положительной контрольной пробы.

5 Оборудование

Для проведения измерений используют стандартное лабораторное оборудование, а также оборудование, указанное ниже.

5.1 Люминометр, способный работать на длине волны 540 нм, с линейными выходными данными, преобразуемыми внутренним программным обеспечением в активность фермента [например, Charm Luminometer модели NovaLum, Luminator К или Т]. Необходимо для пробирки к моделям NovaLum и Lum-T. NovaLum и Lum-T использовать адаптер в поддерживающем положении. Датчик температуры, обеспечиваемый NovaLum, используют для измерения температуры останавливающего раствора (4.2).

Измерения должны быть оптимизированы в соответствии с рекомендациями изготовителя для используемого оборудования.

5.2 Мини-пробирки, одноразовые, сделанные из нелюминесцентного пластика, с колпачками, вместимостью 2 мл.

5.3 Пипетка с фиксированным объемом, вместимостью 100 мкл.

5.4 Дозатор с фиксированным объемом, способный дозировать 1,0 мл. Перед применением необходимо убедиться, что объем дозированной воды составляет (1,000,05) г.

5.5 Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 100 мл.

5.6 Аналитические весы, способные взвешивать с точностью до 1 мг.

5.7 Блок инкубатора или термостат для сушки, способные работать при температуре (351)°С и (630,2)°С с ячейками размером мини-пробирки.

5.8 Водяная баня, регулируемая, способная поддерживать температуру (630,2)°С и (952)°С.

5.9 Пробирки, вместимостью 50 мл, диаметром 13 мм и длиной 100 мм, с герметичными крышками.

5.10 Принтер с соединительными кабелями для распечатки результатов.

6 Отбор проб

В лабораторию должна быть доставлена представительная проба. Во время транспортирования и хранения не допускается какое-либо ее изменение или порча.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в ISO 707 | IDF 50.

7 Подготовка пробы для испытания

7.1 Пробы для испытания

7.1.1 Общие сведения

Перед использованием пробы для испытания тщательно перемешивают. Температура в помещении должна быть в пределах 18°С - 24°С.

Пробы, предназначенные для испытания, должны быть охлаждены при температуре 0°С - 7°С или законсервированы во льду.

7.1.2 Пастеризованные пробы

Используют пробы для испытания, полученные в необходимом количестве, по мере необходимости.

7.1.3 Сырое молоко

Пипеткой вносят 1 мл пробы для испытания в мерную колбу объемом 100 мл с одной меткой (5.5) (или соответствующее количество, чтобы активность после разбавления составляла менее 7000 мЕд/л). Доводят до метки молоком, не содержащим щелочной фосфатазы (7.2). Тщательно перемешивают.

7.1.4 Ароматизированные молочные и сливочные продукты

Используют пробы для испытания, полученные в необходимом количестве. Пробы для испытания вязких продуктов могут потребовать точного определения вносимого пипеткой объема с использованием массы (100 мкл = 100 мг). После внесения пробы протирают кончик пипетки. Возможно, для точного дозирования понадобятся пипетки с другой модификацией отверстия (с более широким отверстием).

7.2 Молоко без щелочной фосфатазы

Молоко в количестве 35 мл, не содержащее щелочной фосфатазы (отрицательная проба для испытания), или необходимый объем рабочей части пробы (7.1.2, 7.1.3 или 7.1.4) подготавливают путем нагревания в пробирке на водяной бане (5.8) при температуре 95°С. Рабочую часть пробы после нагревания до 95°С выдерживают при этой температуре в течение 1 мин. Затем быстро охлаждают.

Отрицательная проба используется в качестве 0 (нулевого) градуировочного раствора и должна иметь среднее значение менее 5 мЕд/л (или менее 15 мЕд/л с ароматизированными молочными продуктами и сливочными продуктами) в соответствующим образом отградуированном канале люминометра. При температуре 4°С отрицательные пробы можно хранить в течение 48 ч.

Жидкое молоко может храниться до 6 мес, если его хранят в замороженном виде при температуре минус 15°С или ниже. Оттаивают отрицательную пробу в воде при комнатной температуре. Пробу энергично встряхивают, чтобы сделать ее однородной перед использованием. Повторно не замораживают.

Следует отметить, что некоторые молочные продукты, такие, например, как овечье молоко, будут осаждаться и расслаиваться, если отрицательная проба для испытания была подготовлена при температуре 95°С в течение 1 мин. В этом случае требуется более низкая температура в течение длительного времени, например 63°С в течение 30 мин.

9 Расчет и представление результатов

9.1 Общие сведения

Результаты рассчитывают с использованием встроенного в люминометр (5.1) программного обеспечения. Расчеты с использованием показаний с других люминометров можно осуществлять вручную с помощью калькулятора.

Если результаты будут рассчитаны вручную, поступают согласно 9.2.

9.2 Расчет вручную

Записывают значение ОСЕ (относительных световых единиц) рабочих градуировочных растворов А, В и С (4.3) и отрицательной пробы (7.2) и средние полученные результаты (8.1.1-8.1.13).

Рассчитывают активность щелочной фосфатазы с использованием линейной регрессии относительных световых единиц отрицательной контрольной пробы и градуировочных растворов А, В и С, а также взаимодействующую заданную активность щелочной фосфатазы в миллиединицах на литр (например, отрицательная контрольная проба = 5 мЕд/л, = 44 мЕд/л или = 88 мЕд/л, и = 175 мЕд/л и и = 350 мЕд/л).

Среднее значение ОСЕ используют в качестве координаты у, а заданное значение в миллиединицах на литр - в качестве координаты х. Рассчитывают угловой коэффициент m и у-отсекаемый отрезок b из лучшего подбора прямой по формуле

,

(13)

где х - активность щелочной фосфатазы пробы, мЕд/л;

m - числовое значение углового коэффициента кривой регрессии;

у - числовое значение ОСЕ люминометра;

b - числовое значение отсекаемого отрезка для получения значения х.

С применением рассчитанных значений m и b определение единицы активности фермента рабочей части пробы можно выполнять, используя измеренные значения ОСЕ как значение у и рассчитывая х, мЕд/л, с помощью формулы

.

(14)

9.3 Выражение результатов

Результаты испытания выражают с точностью до целых чисел в миллиединицах на литр.

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторное испытание

Подробности межлабораторного испытания на прецизионность метода приведены в приложении В. Значения повторяемости и воспроизводимости выражены для 95%-ного уровня вероятности и не могут быть применимы к интервалам концентрации и матрицам, кроме приведенных.

Пределы повторяемости и воспроизводимости, указанные в 10.2 и 10.3, применяются при (средних) уровнях активности фермента фосфатазы приблизительно 50 мЕд/л и 100 мЕд/л в диапазоне от 350 мЕд/л до 2500 мЕд/л.

10.2 Повторяемость

Абсолютная разность между двумя отдельными единичными результатами испытаний, полученными с применением одного и того же метода на идентичном анализируемом материале в той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого промежутка времени, не должна превышать более чем в 5% случаев следующие значения:

- для уровней фермента 350 - 2500 мЕд/л - 21% от среднеарифметического значения;

- для уровней фермента примерно 100 мЕд/л - 30 мЕд/л;

- для уровней фермента примерно 50 мЕд/л - 18 мЕд/л;

- для уровней фермента из отрицательных проб - 6 мЕд/л.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютная разность между двумя единичными результатами испытаний, полученными с применением одного и того же метода на идентичном анализируемом материале в разных лабораториях с различными операторами, использующими различное оборудование, не должна превышать более чем в 5% случаев следующие значения:

- для уровней фермента 350 - 2500 мЕд/л - 41% от среднеарифметического значения;

- для уровней фермента примерно 100 мЕд/л - 50 мЕд/л;

- для уровней фермента примерно 50 мЕд/л - 34 мЕд/л;

- для уровней фермента из отрицательных проб - 14 мЕд/л.

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующие данные:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) метод отбора проб, если он известен;

c) применяемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) любые особенности, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как дополнительные, а также сведения о любых происшествиях, которые могли повлиять на результат(ы) испытаний;

e) результат(ы) испытаний или, если проводилась проверка повторяемости, то окончательный полученный результат.

_____________________________

* Реактивы, указанные в разделе 4, и оборудование, указанное в 5.1, доступны у I Charm Sciences Inc., 659 Andover St., Lawrence, MA 01843, USA (США). Они являются примерами подходящих продуктов, доступных в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанных продуктов со стороны ISO или IDF. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если они обеспечивают получение аналогичных результатов.

Библиография

[1]	ISO 707:2008*	Milk and milk products - Guidance on sampling (Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб)
[2]	ISO 5725-1:1994	Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Patr 1: General principles and definitions (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения)
[3]	ISO 5725-2:1994	Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Parts 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений)
[4]	ISO 11816-2:2003 IDF 155-2:2003	Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Patr 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks (Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 2. Флуориметрический метод для сыра)
[5]	International Union of Biochemistry Nomenclature. J. Am. Med. Assoc., 260, 1988, р. 79 (Еженедельный американский международный медицинский журнал)
[6]	J. AOAC International, 89, 2006, р. 1061 (Журнал AOAC International)

_____________________________

* Аналог IDF 50:2008.