Методические указания МУК 4.1.1215-03 "Определение остаточных количеств Амидосульфурона в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зерне и зеленой массе кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 16 марта 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1215-03
"Определение остаточных количеств Амидосульфурона в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зерне и зеленой массе кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 16 марта 2003 г.)

Дата введения 1 июля 2003 г.
Введены впервые

2. Методика определения остаточных количеств Амидосульфурона в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зерне и зеленой массе кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии методом высокоэффективной жидкостной хроматографии#

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип методики

Методика основана на определении амидосульфурона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором после экстракции водным ацетоном (из почвы - ацетонитрилом, воды - хлороформом), перераспределения в водный щелочной раствор, его промывки и переэкстракции после подкисления в органическую фазу и очистки на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии при выращивании зерновых культур (хлор- и фосфорорганические пестициды, симмтриазины, фенилмочевины, тио- и дитиокарбаматы).

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

Метрологические параметры метода

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95; n = 24
	предел обнаружения,* мг/кг (л)	диапазон определяемых концентраций, мк/кг (л)	среднее значение определения, %	стандартное отклонение S,%	доверительный интервал среднего результата, %
Вода	0,001	0,001 - 0,008	86,0	1,89	+- 1,33
Почва	0,01	0,01 - 0,08	85,2	2,00	+- 1,42
Зерно	0,02	0,02 - 0,16	74,9	2,93	+- 2,37
Зеленая масса кукурузы и солома	0,05	0,05 - 0,4	80,8	3,66	+- 2,75
Зерно кукурузы	0.02	0,02 - 0,16	80,1	4,60	+- 4,30
* Предел обнаружения в хроматографируемом объме - 2,5 нг.

Таблица 2

Полнота определения амидосульфурона в воде, почве, зерне и соломе пшеницы (6 повторностей для каждой концентрации)

Среда	Внесено Амидосульфурона, мг/кг	Обнаружено Амидосульфурона, мг/кг	Полнота определения, %
Вода	0,001	0,00086 +- 0,00004	86,2
	0,002	0,00170 +- 0,00008	84,9
	0,004	0,00344 +- 0,00028	85,9
	0,008	0,00696 +- 0,00028	87,0
Почва	0,01	0,0084 +- 0,0008	84,3
	0,02	0,0168 +- 0,0008	84,7
	0,04	0,0344 +- 0,0012	85,6
	0,08	0,0742 +- 0,0040	86,1
Зеленая масса кукурузы и солома	0,05	0,0389 +- 0,0038	77,9
	0,10	0,0798 +- 0,0062	79,8
	0,20	0,1692 +- 0,0194	84,6
	0,40	0,3239 +- 0,020	81,1
Зерно	0,02	0,0154 +- 0,0012	76,9
	0,04	0,0296 +- 0,0038	74,1
	0,08	0,0590 +- 0,0060	73,8
	0,16	0,1196 +- 0,0088	74,8
Зерно кукурузы	0,02	0,0151 +- 0,0006	75,6
	0,04	0,0319 +- 0,0011	79,8
	0,08	0,0653 +- 0,0020	81,6
	0,16	0,133 +- 0,0045	83,2

2.2. Реактивы, растворы и материалы

Амидосульфурон с содержанием д.в. 98,5%
Ацетон, чда	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил для хроматографии, хч,	ТУ 6-09-4326-76
Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМnО4
Спирт метиловый	ГОСТ 6995-77
н-Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Хлороформ (Фармакопея СССР)
Кислота ортофосфорная, хч, 1 М и 0,005 М водные растворы	ГОСТ 6552-80
Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон, 90:10, по объему
Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон, 85:15, по объему
Силикагель для колоночной хроматографии, L 100-160 меш, Хемапол (Чехия) или аналогичный
Натрия гидроксид, хч, 1 N раствор	ГОСТ 11078-78
Натрий серно-кислый, безводный, хч, предварительно прокаленный в муфельной печи при 600°С в течение 4 ч	ГОСТ 4166-76
Калий фосфорно-кислый двузамещенный, 3 водный, чда	ГОСТ 2493-75
Натрий фосфорно-кислый, двузамещенный, чда	ГОСТ 11773-76
Бумажные фильтры "белая лента", обеззоленные	ТУ 6-09-2678-77
Универсальная индикаторная бумага
Стекловата
Лед

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны Shimadzu (Япония) или аналогичный
Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Hipersil ODS или Lichrosorb RP-8 (альтернативная фаза), зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или аналогичный	ТУ 25-11-917-74
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные	ГОСТ 34104-80Е
Насос водоструйный	ГОСТ 10696-75
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +- 0,038 г	ГОСТ 19491-74
Мельница электрическая лабораторная, или аналогичная	ТУ 46-22-236-79
Аппарат для встряхивания или аналогичный	ТУ 64-1-1081-73
Гомогенизатор или аналогичный	МРТУ 42-1505-63
Иономер ЭВ-74, или аналогичный	ГОСТ 22261-76
Мешалка магнитная ММ-5 или аналогичная	ТУ 25-11.834-80
Печь муфельная
Воронки делительные на 100, 250, 500 и 1 000 мл	ГОСТ 25336-82Е
Воронки химические, конусные, диаметром 34 - 40 мм и 100 - 120 мм	ГОСТ 25336-82Е
Воронка Бюхнера	ГОСТ 9147-80Е
Колба Бунзена	ГОСТ 25336-82Е
Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл	ГОСТ 9737-70

ГАРАНТ:

Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г. взамен ГОСТ 9737-70 с 1 января 1995 г. принят ГОСТ 9737-93

Цилиндры мерные на 25, 50, 100, 250, 500 и 1 000 мл	ГОСТ 1770-74Е
Колбы мерные на 100 и 1 000 мл	ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные на 0,1; 1,0; 2,0; 5,0 и 10 мл	ГОСТ 20292-74
Колбы круглодонные на шлифе на 10,100 и 250 мл	ГОСТ 9737-70
Колонка стеклянная, длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм
Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл	ГОСТ 25336-82Е
Сито с диаметром отверстий 0,5 - 1 мм
Скальпель или ножницы

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10696-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные образцы зерна и соломы можно хранить в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4°С в течение месяца. Пробы воды хранятся при температуре не выше 4°С в течение 3 дней, при температуре -20°С в течение месяца.

Пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы можно хранить в течение года.

Перед анализом зерно измельчают на мельнице, солому режут ножом на кусочки не более 0,5 см, воду (при наличии взвеси) фильтруют через неплотный бумажный фильтр, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 0,5 - 1 мм.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 300 мл ацетонитрила, прозрачного при 238 нм, переносят в колбу на 1 000 мл, добавляют 100 мл метанола и 600 мл 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты, фильтруют, дегазируют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ системой ацетонитрил-метанол-0,005 М ортофосфорная кислота (300-100-600, по объему) в течение 30 мин при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизацию базовой линии (5 - 15 мин).

2.5.3. Приготовление фосфатного буферного раствора N 1 (рН 10)

1,42 г безводного Na2НРO4 и 40 г NaCl растворяют в химическом стакане в 400 мл воды, доводят рН до 10 путем добавления по каплям 1 N NaOH при перемешивании и фиксируют рН раствора с помощью иономера.

2.5.4. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия

1,14 г К2НРO4 x 3 Н2O переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 60 - 70 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения осадка, доводят водой до метки, контролируют рН полученного раствора с помощью иономера, доводя его значение до 10 с помощью 1 N раствора едкого натра.

2.5.5. Приготовление стандартных растворов

Стандартный раствор амидосульфурона с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,01 г вещества в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранится в холодильнике не более 10 дней.

Рабочие стандартные растворы с концентрацией 0,125; 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят из раствора, содержащего 100 мкг/мл амидосульфурона, соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.1). Растворы немедленно после приготовления помещаются в холодильник, где хранятся не более суток.

2.5.6. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 20 мкл рабочего стандартного раствора амидосульфурона с концентрацией 0,125; 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл.

Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят градуировочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации амидосульфурона в растворе в мкг/мл.

2.5.7. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 - 40 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 мл элюента N 2 состава (по объему) гексан-ацетон, 85:15, затем 20 мл гексана со скоростью 1 - 2 кап./с. После этого колонка готова к работе.

2.5.8. Проверка хроматографического поведения амидосульфурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу на 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора амидосульфурона с концентрацией 100 мкг/мл, отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 2-3 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Промывают колонку 20 мл элюента N 1, затем 60 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 кап./с. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.1) и анализируют на содержание амидосульфурона по п. 2.7.

Фракции, содержащие амидосульфурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 10 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания может измениться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1. Вода

2.6.1.1. Экстракция.

Из средней пробы воды отбирают 250 мл, подкисляют 1 М ортофосфорной кислотой до рН 2,0 (контролируя его значение на иономере) и помещают в делительную воронку вместимостью 500 мл.

Добавляют 75 мл хлороформа и встряхивают 3 минуты. Нижний органический слой отделяют, собирая в коническую колбу на 250 мл. Водный слой экстрагируют хлороформом еще дважды порциями по 50 мл.

2.6.1.2. Очистка экстракта.

Объединенную органическую фазу переносят в делительную воронку на 250 - 500 мл, добавляют 30 мл 0,05 М К2НРО4 (по п. 2.5.4), встряхивают 3 минуты. Верхний водный слой отделяют, собирая его в химический стакан вместимостью 150 - 200 мл. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 30 мл 0,05 М раствора К2НРО4. Объединенную водную фазу подкисляют 1 М Н3РО4 до рН 2,0 (контролируя его значение на иономере). Амидосульфурон экстрагируют из подкисленного водного раствора хлороформом трижды порциями по 20 мл. Органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 - 15 мл хлороформа. Объединенные экстракт и промывку упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С почти досуха, оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха.

Остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.1) и анализируют на содержание амидосульфурона по п. 2.7.

2.6.2. Почва

2.6.2.1.Экстракция.

Навеску 25 г воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 100 мл смеси ацетонитрил-вода, 9:1, по объему и перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 30 мин. Экстракт фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Фильтр с осадком промывают 4 раза по 15 - 20 мл ацетонитрила (каждый раз просасывая фильтр досуха). Объединенный ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу на 250 мл и концентрируют на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°С до водного остатка (объема около 10 мл).

2.6.2.2. Очистка экстракта.

К оставшемуся водному раствору добавляют 30 мл 0,05 М К2НРО4, при необходимости доводят рН раствора до 10 с помощью 1 N NaOH. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 - 150 мл, промывают дважды хлороформом порциями по 20 мл, который отбрасывают. Водный раствор подкисляют 1 М Н3РО4 до рН 2,0 (контролируя его значение на иономере). Амидосульфурон экстрагируют хлороформом трижды порциями по 20 мл.

Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 - 15 мл хлороформа. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°С почти досуха, оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха.

Остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.1) и анализируют на содержание амидосульфурона по п. 2.7.

2.6.3. Зерно и солома

2.6.3.1. Экстракция

Навеску 25 г измельченного зерна (10 г соломы) помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 100 мл смеси ацетон-вода, 9:1, по объему, для зерна (150 мл для соломы) и гомогенизируют 5 мин при 1000 об./мин. Отстоявшийся раствор сливают через бумажный фильтр в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 250 мл. Процедуру экстракции повторяют, используя по 100 мл смеси ацетон-вода, 9:1, по объему, для зерна и соломы. Измеряют общий объем экстракта, отбирают его половину, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 мл и концентрируют на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (10 - 15 мл).

2.6.3.2. Очистка экстракта

К оставшемуся водному раствору добавляют 30 мл фосфатного буфера N 1 с рН 10 (по п. 2.5.3). Колбу помещают в баню с ледяной водой (температура 5 - 7°С С) на 20 мин. Охлажденный раствор быстро фильтруют через неплотный бумажный фильтр в делительную воронку вместимостью 100 мл и промывают его тремя порциями хлороформа по 30 мл. Органическую фазу отбрасывают. Водную фазу переносят в химический стакан, подкисляют 1 М Н3РО4 до рН 2,0 (фиксируя его значение на иономере). Переносят раствор вновь в делительную воронку, обмывая стакан хлороформом, и подвергают экстракции хлороформом трижды порциями по 30 мл.

Далее очистку экстракта продолжают в соответствии с процедурой п. 2.6.1.2, описанной для воды. После этого экстракты зерна и соломы подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 2.6.3.3.

2.6.3.3. Очистка на колонке с силикагелем.

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1.2 экстрактов зерна и соломы, с помощью 3 - 5 мл элюента N 1 количественно переносят пипеткой в колонку с силикагелем, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Промывают колонку 30 мл гексана, 20 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Амидосульфурон элюируют с колонки 50 мл основного элюента N 2 в круглодонную колбу на 100 мл и упаривают досуха при температуре бани не выше 40°С, остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл, соломы - в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.1) и анализируют по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Shimadzu (Япония).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,6 мм

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-метанол 0,005 М ортофосфорная кислота (300:100:600, по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны: 238 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

2.7.1. Неподвижная фаза: Hipersil ODS, зернением 5 мкм

Время выхода амидосульфурона: около 12 мин.

2.7.2. Альтернативная неподвижная фаза: Lichrosorb RP-8, зернением 5 мкм

Время выхода Амидосульфурона: около 16 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2,5 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание Амидосульфурона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                                 С х V

                             X = -----, где

                                 m x K

    Х - содержание амидосульфурона в пробе, мг/кг (мг/л);

    С - концентрация  амидосульфурона   в  хроматографируемом  растворе,

        найденная по градуировочному графику, мкг/мл;

    V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

    m - масса (объем) анализируемого образца, г (мл);

    К - коэффициент,  учитывающий   взятую   для  анализа  часть  объема

        экстракта. К = 1 для воды и почвы, К = 0,5 для зерна и соломы.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами, сжатыми газами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

5. Разработчики

Калинин В.А., профессор, к. с-х. н.; Довгилевич Е.В., к. б. н.: Калинина Т.С, к. с-х. н.; Довгилевич А.В., к. х. н.; Устименко Н.В., к. б. н.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1, УНКЦ "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". Телефон/факс: 976-43-26.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко