Методические указания МУК 4.1.1388-03 "Определение остаточных количеств иодосульфурон-метил-натрия в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зеленой массе и зерне кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1388-03
"Определение остаточных количеств иодосульфурон-метил-натрия в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зеленой массе и зерне кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Дата введения: 30 июня 2003 г.
Введены впервые

2. Методика определения остаточных количеств иодосульфурон-метил-натрия в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зеленой массе и зерне кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на определении иодосульфурон-метил-натрия с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором после извлечения препарата из воды хлористым метиленом, из почвы и растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых культур и кукурузы.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица

Метрологические параметры метода

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	предел обнаружения, мг/дм3, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/дм3, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	относительное отклонение, %	доверительный интервал среднего, %
Вода	0,001	0,001 - 0,01	94,4	3,4	1,5	+- 3,1
Почва	0,01	0,01 - 0,1	83,0	4,2	1,9	+- 3,9
Зерно	0,01	0,01 - 0,1	83,2	4,1	1,8	+- 3,8
Солома	0,05	0,05 - 0,5	83,5	4,8	2,2	+- 4,5
Зерно кукурузы	0,02	0,02 - 0,16	79,5	4,0	1,8	+- 3,7
Зеленая масса	0,05	0,05 - 0,5	84,2	3,9	1,7	+- 3,6

2.2 Реактивы, растворы, материалы

Иодосульфурон-метил-натрий с содержанием д.в. 98,0% (АгрЭво, Германия)
Ацетон, чда	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил, ч	ТУ 6-09-3534-82
Вода бидистиллированная	ГОСТ 7602-72
Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Калия перманганат, хч	ГОСТ 20490-75
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-80
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Натрий фосфорно-кислый, двузамещенный, чда	ГОСТ 11773-76
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 11078-78
Натрия сульфат, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрия хлорид, хч	ГОСТ 4233-77
Спирт метиловый, хч	ГОСТ 6995-77
Фосфора пентоксид, ч	МРТУ 6-09-5759-69
Хлороформ, ч	ГОСТ 20015-74
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-метанол-0,005 М ортофосфорная кислота (38:2:60, по объему)
Силикагель для колоночной хроматографии марки Л (40 - 100 мкм) /Хемапол, Чехия/ или аналогичный
Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон (8:2, по объему)
Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон (7:3, по объему)
Стекловата
Хлопковая вата
Фильтры бумажные "синяя лента"	ТУ 6-09-1678-77

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный Хроматографическая колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-С8 Т или Диасфером 100-С18 (АО БиоХимМак, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы)
Шприц для ввода образцов в жидкостный хроматограф
Весы аналитические типа ВЛР-200	ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос	ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический	ТУ 64-1-1081-73
Иономер ЭВ-74 или аналогичный	ГОСТ 22261-76
Мельница электрическая лабораторная или аналогичная	ТУ 46-22-236-79
Ротационный испаритель, тип ИР-1М	ТУ 25-11-917-76
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Воронка Бюхнера	ГОСТ 9147-80Е
Воронки делительные, вместимостью 100, 250 мл	ГОСТ 25336-82Е
Воронки для фильтрования стеклянные	ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена	ГОСТ 5614-75
Колбы грушевидные, вместимостью 50 и 100 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 9737-70

ГАРАНТ:

Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г. взамен ГОСТ 9737-70 с 1 января 1995 г. принят ГОСТ 9737-93

Колбы конические с притертыми пробками, вместимостью 250 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1 000 мл	ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные, вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл	ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Стаканы химические, емкостью 500 и 1 000 мл	ГОСТ 25336-82Е
Цилиндры мерные, вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10696-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

Взамен ГОСТ 8613-75 и ГОСТ 10515-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4°С не более трех месяцев. Зеленую массу хранят при температуре 0 - 4°С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18°С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4°С в течение 2 дней, при температуре -18°С в течение месяца.

Пробы почвы высушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света до воздушно-сухого состояния и хранят в темном сосуде не более трех месяцев.

Перед анализом зерно и солому размалывают на мельнице, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а зеленую массу измельчают ножницами.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлороформ встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Хлороформ промывают водой, сушат над хлористым кальцием и перегоняют. Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO4 и 2 г К2СO3).

Силикагель встряхивают с двойным объемом ацетона и суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объема ацетона и затем высушивают при температуре 130°С в течение 2 ч.

2.5.2. Приготовление 2 М и 0,005 М растворов ортофосфорной кислоты

Для получения 2 М раствора Н3РO4 отмеряют 137 мл 85,6%-ной ортофосфорной кислоты, переносят в мерную колбу емкостью 1 000 мл, добавляют 500 - 600 мл бидистиллированной воды, перемешивают и доводят объем водой до метки.

Для получения 0,005 М раствора Н3РO4 отбирают 2,5 мл приготовленного 2 М раствора ортофосфорной кислоты, переносят в колбу емкостью 1 000 мл, добавляют бидистиллированную воду до метки и перемешивают.

2.5.3. Приготовление фосфатного буферного раствора (рН 10)

В химическом стакане в 400 мл воды растворяют 1,42 г безводного Na2HPO4 и 40 г NaCl и доводят рН раствора до 10 путем добавления по каплям 1 N раствора гидроксида натрия при перемешивании. Щелочность раствора контролируют с помощью иономера.

2.5.4. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

При подготовке подвижной фазы для анализа иодосульфурон-метил-натрия отмеряют 380 мл ацетонитрила и 20 мл метанола, переносят в колбу на 1 000 мл, добавляют 520 мл 0,005 М ортофосфорнон кислоты, перемешивают, фильтруют, дегазируют.

2.5.5. Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ 20 мл смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), а затем подвижной фазой в течение 30 мин при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5 - 15 мин).

2.5.6. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор иодосульфурон-метил-натрия с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 10,2 мг препарата, содержащего 98% д.в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12°С не более 10 дней.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,025; 0,05; 0,125 и 0,25 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора иодосульфурон-метил-натрия соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.4) непосредственно в день проведения анализа. Раствор хранят в холодильнике не более 3 дней.

При изучении полноты открывания иодосульфурон-метил-натрия в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

2.5.7. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 100 мкл рабочего стандартного раствора иодосульфурон-метил-натрия с концентрацией 0,025, 0,05, 0,125 и 0,25 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации препарата в растворе в мкг/мл.

2.5.8. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,0 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 30 мл элюента N 2 (смесь гексан-ацетон, 7:3) и затем 60 мл элюента N 1 (смесь гексан-ацетон, 8:2) со скоростью 1 - 2 капли в секунду.

2.5.9. Проверка хроматографического поведения иодосульфурон-метил-натрия на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора иодосульфурон-метил-натрия с концентрацией 100 мкг/мл, отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 2 - 3 мл элюента N 1 и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 30 мл элюента, а затем 60 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.4) и анализируют на содержание иодосульфурон-метил-натрия по п. 2.7.

Фракции, содержащие иодосульфурон-метил-натрий, объединяют и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания иодосульфурон-метил-натрия может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция

2.6.1.1. Вода. К образцу предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл добавляют 1,18 г Na2HPO4 x 2Н2O и перемешивают до растворения соли. Полученный раствор переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, промывают трижды хлороформом порциями по 20 мл, который отбрасывают. Водную фазу подкисляют 2 М ортофосфорной кислотой до рН 3 (контролируя его значения на ионометре), переносят в делительную воронку и иодосульфурон-метил-натрий экстрагируют хлороформом трижды (30 мл + 20 мл х 2). Объединенную органическую фазу пропускают через слой хлопковой ваты (1 см) и упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 40°С. Сухой остаток растворяют в 4 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.4) и анализируют на содержание иодосульфурон-метил-натрия по п. 2.7.

2.6.1.2. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл 90%-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 ч на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Почву еще раз экстрагируют 50 мл 90%-ного водного ацетона при встряхивании в течение 30 мин. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 70 мл), эквивалентную 10 г почвы. Дальнейшую очистку проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3. Зеленая масса, зерно, солома. Навеску (25 г) измельченной зеленой массы кукурузы переносят в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-вода (9:1, по объему) и перемешивают в течение 1 ч на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Растительный материал повторно экстрагируют 100 мл смеси ацетон-вода (9:1) при встряхивании в течение 30 мин. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 38 мл), эквивалентную 5 г растительной ткани. Дальнейшую очистку проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

Навеску размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл 90%-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 ч на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Растительный материал повторно экстрагируют 70 мл 90%-ного водного ацетона при встряхивании в течение 30 мин. Из объединенного экстракта муки или соломы отбирают аликвоту раствора (около 80 мл), эквивалентную соответственно 10 г зерна или 2,5 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Очистка экстрактов

Отобранные аликвоты растительного (из п. 2.6.1.3) и почвенного (из п. 2.6.1.2) экстрактов упаривают до объема 5 - 7 мл на роторном испарителе при температуре 40°С. К оставшемуся водному раствору добавляют 30 мл фосфатного буферного раствора с рН 10 (п. 2.5.3), при необходимости доводят рН раствора до 10 с помощью 1 N раствора гидроксида натрия. Колбу помещают в баню с ледяной водой (температура 5 - 7°С) на 20 мин. Охлажденный раствор быстро фильтруют через неплотный бумажный фильтр в делительную воронку вместимостью 200 мл и промывают его тремя порциями хлороформа по 20 мл. Органическую фазу отбрасывают. Водную фазу переносят в химический стакан, подкисляют 2 М ортофосфорной кислотой до рН 3, контролируя кислотность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку и иодосульфурон-метил-натрий экстрагируют хлороформом трижды (30 мл + 20 мл х 2). Объединенную органическую фазу пропускают через слой хлопковой ваты (1 см) и упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 40°С.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов зеленой массы, зерна, соломы и почвы, с помощью 3 мл элюента N 1 (смесь гексан-ацетон, 8:2) количественно переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.8). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и колонку промывают 30 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Иодосульфурон-метил-натрий элюируют 50 мл элюента N 2 (смесь гексан-ацетон, 7:3) в круглодонную колбу емкостью 100 мл и раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40°С. Сухой остаток экстрактов зерна и почвы растворяют в 4 мл, соломы в 5 мл, зеленой массы и зерна кукурузы соответственно в 10 и 8 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.4) и анализируют на содержание иодосульфурон-метил-натрия по п. 2.7.

Примечание: При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения иодосульфурон-метил-натрия на колонке с силикагелем.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США).

Хроматографическая колонка стальная (15 см х 4 мм), заполненная Диасорбом 130-С8 Т (7 мкм).

Подвижная фаза: ацетонитрил-метанол-0,005 М ортофосфорная кислота (38:2:60, по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Температура колонки: комнатная.

Рабочая длина волны: 233 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 100 мкл.

Время удерживания иодосульфурон-метил-натрия: 10,5 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2,5 - 25 нг.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасфер 100-С18 (6 мкм).

Время удерживания иодосульфурон-метил-натрия: около 12 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,25 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание иодосульфурон-метил-натрия рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                    H  A V

                     1

                X = ------, где

                     Н  m

                      0

Х  - содержание иодосульфурон-метил-натрия, мг/дм3, мг/кг;.

Н  - высота пика образца, мм;

 1

Н  - высота пика стандарта, мм;

 0

А  - концентрация  стандартного   раствора   иодосульфурон-метил-натрия,

     мкг/мл;

V  - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m  - масса или объем анализируемой  части  образца, г или мл (для воды -

     100 мл; для почвы и зерна - 10 г;  для  зеленой  массы -  5 г;  для

     соломы - 2,5 г).

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

5. Разработчики

Назарова Т.А., к. биол. н.; Микитюк О.Д., к. биол. н.; Дубовая Л.В.; Макеев А.М., к. биол. н. (ВНИИФ).

ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20

Калинин В.А., к. с-х. н; Довгилевич А. В., к. хим. н. (МСХА).

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений, тел. 976-02-20.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко