Методические указания МУК 4.1.1390-03 "Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1390-03
"Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Дата введения: 30 июня 2003 г.
Введены впервые

2. Методика определения остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на определении имидаклоприда методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения препарата из воды дихлорметаном, из почвы и растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании сахарной свеклы, картофеля, а также огурцов, томатов, перца и баклажанов открытого и защищенного грунта.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица

Метрологическая характеристика метода

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	предел обнаружения, мг/дм3, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/дм3, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	относительное стандарт. отклонение DS, %	доверительный интервал среднего, %
Вода	0,0004	0,0004 - 0,004	84,9	3,7	1,7	+- 3,5
Почва	0,02	0,02 - 0,2	75,6	3,8	1,7	+- 3,5
Огурцы	0,02	0,02 - 0,2	86,0	6,7	3,0	+- 6,3
Томаты	0,02	0,02 - 0,2	82,1	4,8	2,2	+- 4,5
Свекла сахарная	0,02	0,02 - 0,2	81,5	3,8	1,7	+- 3,5
Картофель	0,02	0,02 - 0,2	88,3	5,4	2,4	+- 5,0
Перец	0,02	0,02 - 0,2	81,9	3,7	1,6	+- 3,7
Баклажаны	0,02	0,02 - 0,2	83,2	4,0	1,8	+- 4,0

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Имидаклоприд с содержанием д.в. 99,6% (Байер", Германия)
Ацетон	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил, ч	ТУ 6-09-3534-82
Вода бидистиллированная	ГОСТ 7602-72
Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Калия перманганат	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Натрий двууглекислый	ГОСТ 83-79
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77
Натрия сульфат безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Фосфора пентоксид, ч	МРТУ 6-09-5759-69
Этилацетат	ГОСТ 22300-76
Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (4:6, по объему)
Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (2:8, по объему)
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-вода (25:75, по объему)
Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60 - 100 меш)
Стекловата
Целит 535 (2 - 15 мкм) /Серва, Германия/ или аналогичный
Фильтры бумажные "синяя лента"	ТУ 6-09-1678-77

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный
Хроматографическая колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-C10CN или Диасорбом 130-С16 Т (ЗАО БиоХимМак, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы)
Шприц для ввода образцов в жидкостный хроматограф
Весы аналитические типа ВЛР-200	ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос	ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический	ТУ 64-1-1081-73
Гомогенизатор	МРТУ 42-1505-63
Ротационный испаритель тип ИР-1М	ТУ 25-11-917-76
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Баня водяная	ТУ 46-22-603-75
Воронка Бюхнера	ГОСТ 0147-73#
Воронки делительные, вместимостью 100, 250 мл	ГОСТ 25336-82
Воронки для фильтрования стеклянные	ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена	ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100 и 250 мл	ГОСТ 9737-70

ГАРАНТ:

Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г. взамен ГОСТ 9737-70 с 1 января 1995 г. принят ГОСТ 9737-93

Колбы конические с притертыми пробками, вместимостью 250 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1 000 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы грушевидные, вместимостью 100 и 250 мл	ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные, вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл	ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Цилиндры мерные, вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10696-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

Взамен ГОСТ 8613-75 и ГОСТ 10515-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы, сахарной свеклы, огурцов, картофеля, томатов, перца и баклажанов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы растительного материала хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18°С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4°С в течение 3 дней, при температуре -18°С - в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а растительный материал измельчают.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO4 и 2 г К2СO3).

Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 250 мл ацетонитрила, переносят в колбу на 1 000 мл, добавляют 750 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют, дегазируют.

2.5.3. Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил-вода (25:75, по объему) в течение 30 мин при скорости подачи растворителя 0,6 мл/мин. Включают детектор и ждут стабилизации базовой линии (5 - 15 мин).

2.5.4. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор имидаклоприда с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,6% д.в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12°С не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04, 0,08, 0,20 и 0,40 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора имидаклоприда соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике не более одного дня.

При изучении полноты открывания имидаклоприда в модельных матрицах используются ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.5. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 0,04; 0,08; 0,20 и 0,40 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации имидаклоприда в растворе в мкг/мл.

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан-этиладетат (2:8, по объему) и 30 мл смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1 (гексан-этилацетат, 4:6), затем 60 мл элюента N 2 (гексан-этилацетат, 2:8) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания имидаклоприда может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция имидаклоприда

2.6.1.1. Вода. 100 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и обрабатывают 10 мл гексана при встряхивании в течение 1 мин. Гексановый слой отбрасывают и водную фазу экстрагируют дихлорметаном трижды (30 + 30 + 20 мл). Объединенную органическую фазу промывают в делительной воронке 20 мл 0,05 М раствора К2СO3, а затем пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30°С. Сухой остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют по п. 2.7.

2.6.1.2. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-вода (3:1, по объему) и суспензию перемешивают в течение 1 ч на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок переносят в колбу, приливают 50 мл указанной выше смеси, перемешивают 30 мин на аппарате для встряхивания и суспензию фильтруют через бумажный фильтр. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 35 мл), эквивалентную 5 г почвы. Дальнейшую очистку проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3. Сахарная свекла, картофель, огурцы, томаты, перец, баклажаны. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 125 мл смеси ацетон-вода (3:1, по объему) и гомогенизируют 3 мин при 10 000 об./мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл указанного выше водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 35 мл), эквивалентную 5 г растительной ткани. Дальнейшую очистку проводят по п.п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного (из п. 2.6.1.3) и почвенного (из п. 2.6.1.2) экстрактов упаривают до объема 5 - 7 мл на роторном испарителе при температуре 30°С. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 40 мл бидистиллированной воды, 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 мин. Органический слой отбрасывают. Обработку водной фазы гексаном повторяют еще раз. Затем водную фазу трижды обрабатывают дихлорметаном (30 + 30 + 20 мл) при встряхивании. Объединенный дихлорметановый экстракт промывают в делительной воронке 20 мл 0,05 М раствора К2СO3, а затем пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов почвы или растительного материала, количественно переносят тремя порциями (1 мл) смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колонку промывают 30 мл смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему), которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 50 мл смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему) и собирают элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.

Примечание. При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США).

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасорб 130-C10CN, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (25:75, по объему).

Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Время выхода имидаклоприда: 6 мин 45 с.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,4 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16 Т (5 мкм).

Подвижная фаза: метанол-вода (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин.

Время выхода имидаклоприда: 5 мин 20 с.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание имидаклоприда рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                          Н A V

                           1

                      X = ------, где

                           Н m

                            0

Х  - содержание имидаклоприда в пробе, мг/кг или мг/дм3;

H  - высота пика образца, мм;

 1

Н  - высота пика стандарта, мм;

 0

А  - концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/мл;

V  - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m  - масса или объем анализируемой  части образца, г или  мл (для воды -

     100 мл; для почвы и растительного материала - 5 г).

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

5. Разработчики

Макеев А.М., к. биол. н.; Дубовая Л.В.

ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко