Методические указания МУК 4.1.1966-05 "Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Методические указания МУК 4.1.1966-05
"Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Дата введения: 1 июля 2005 г.
Введены впервые

2. Методика определения остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на газохроматографическом определении протиоконазол-дестио (SXX 0665) с ЭЗД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых культур.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица

Метрологические параметры метода

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение S, %	относительное отклонение DS, %	доверительный интервал среднего, %
Зерно	0,02	0,02-0,2	88,6	5,3	2,4	+- 4,9
Солома	0,1	0,1-1,0	83,6	3,6	1,6	+- 3,4

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Протиоконазол-дестио с содержанием д.в. 98,5% (Байер, Германия)
Ацетон, чда	ГОСТ 2603-79
Вода бидистиллированная	ГОСТ 7602-72
Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Дихлорметан	ГОСТ 12794-80
Калия перманганат	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77
Натрий двууглекислый	ГОСТ 83-79
Натрия сульфат безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Этилацетат	ГОСТ 22300-76
Элюент N 1 для колоночной хроматографии:
смесь гексан-этилацетат (85:15, по объему)
Элюент N 2 для колоночной хроматографии:
смесь гексан-этилацетат (70:30, по объему)
Элюент N 1 для Диапак-диола: смесь гексан-дихлорметан (1:1, по объему)
Алюминия оксид 90 (0,063-0,2 мм), нейтральный для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности по Брокману Концентрирующий патрон Диапак-диол (ЗАО БиоХимМак СТ, Москва, Ленинские горы, МГУ)
Азот газообразный, осч	ГОСТ 0203-74
Стекловата
Фильтры бумажные "синяя лента"	ТУ 6-09-1678

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с ЭЗД с пределом детектирования по линдану не выше 3,18 х 10(-14) г/с или аналогичный
Колонка хроматографическая, набивная, стеклянная, 1 000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12-0,15 мм)
Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф	ТУ 64-1-2850
Аппарат для встряхивания АВУ	ТУ 64-1-1081-83
Весы аналитические типа ВЛР-200	ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос	ГОСТ 10696-75
Колонка для адсорбционной хроматографии
Мельница электрическая, лабораторная или аналогичная	ТУ 46-22-236-79
Ротационный испаритель, тип ИР-1М	ТУ 25-11-917-76
Баня ультразвуковая, модель D 50
Branson Instr.Co, США
Баня водяная	ТУ 46-22-603-75
Воронка Бюхнера	ГОСТ 0147-73
Воронки делительные, вместимостью 100 мл	ГОСТ 25336-82
Воронки для фильтрования стеклянные	ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена	ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100, 250 мл	ГОСТ 9737-70

ГАРАНТ:

Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г. взамен ГОСТ 9737-70 с 1 января 1995 г. принят ГОСТ 9737-93

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы мерные, вместимостью 25, 50 и 100 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы грушевидные, вместимостью 50 и 100 мл	ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл	ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 мл	ГОСТ 10515-75
Цилиндры мерные, вместимостью 25, 50 и 100 мл	ГОСТ 1770-74

2.4 Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79).

Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре или в холодной комнате при температуре 4°С. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г .

Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 4,6% воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности.

2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250°С в течение 8-10 ч.

2.5.3. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего 98,5% д.в., в этилацетате в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12°С не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита соответствующим последовательным разведением этилацетатом.

При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

2.5.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ x с от концентрации протиоконазол-дестио в растворе в мкг/мл.

2.5.5. Подготовка колонки с оксидом алюминия и концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения протиоконазол-дестио на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 мл элюента N 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента N 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 2.7.

Фракции, содержащие протиоконазол-дестио, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1. Экстракция протиоконазол-дестио

К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-го водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл 70%-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3 и 2.6.4.

2.6.2. Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном испарителе при температуре 40°С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С.

2.6.3. Очистка на колонке с оксидом алюминия

К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25 мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40°С. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7. Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак-диол.

2.6.4. Очистка на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток экстракта соломы из п. 2.6.3 переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.5). Патрон промывают 5 мл смеси гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин, которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30°С. Для удаления следовых количеств дихлорметана в колбу приливают 5 мл гексана и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф "Кристалл 2000 М" с электронозахватным детектором с пределом детектирования по линдану не выше г/с.

Колонка хроматографическая, стеклянная, 1 000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).

Температура детектора - 320°С, испарителя - 270°С, термостата колонки - 230°С.

Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин; поддув - 25 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Время удерживания протиоконазол-дестио - 2 мин 28 с.

Линейный диапазон детектирования: 0,1-1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание протиоконазол-дестио рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

, где

Х - содержание протиоконазол-дестио в пробе, мг/кг;

- площадь пика образца, мВ х с;

- площадь пика стандарта, мВ х с;

А - концентрация стандартного раствора протиоконазол-дестио, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5 г, для соломы - 1 г).

При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5. Разработчики

Дубовая Л.В., Макеев А.М.

ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко