Методические указания МУК 4.1.1975-05 "Определение остаточных количеств метсульфурон-метила в семенах, масле и соломке льна методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Методические указания МУК 4.1.1975-05
"Определение остаточных количеств метсульфурон-метила в семенах, масле и соломке льна методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 апреля 2005 г.)

Дата введения: 1 июля 2005 г.
Введены впервые

2. Методика определения
метсульфурон-метила в семенах, масле и соломке льна методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении метсульфурон-метила методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице.

Таблица

Метрологическая характеристика метода

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S,%	Доверительный интервал среднего, % n = 24, Р = 0,95
Семена	0,01	0,01-0,1	86,2	5,9	5,2
Масло	0,01	0,01-0,1	86,5	6,1	5,3
Соломка	0,04	0,04-0,4	79,8	5,3	4,6

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или хч	ТУ 6-09-3534-87
Бумажные фильтры "красная лента"	ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная	ГОСТ 6709-79
Встряхиватель механический или аналогичны#	ТУ 64-673М
Дихлорметан, хч	ТУ 6-09-3716-80
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Калий фосфорно-кислый 2-замещенный, 3-водный, чда, 0,1М водный раствор	ГОСТ 2493-75
Калия перманганат	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или хч, 2М и 0,005М водные растворы	ГОСТ 6552-80
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Метсульфурон-метил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98%, производства фирмы "Riedel de Haеn AG" (Германия)
Натрий двууглекислый	ГОСТ 83-79
Натрий серно-кислый безводный, ч, свежепрокаленный	ГОСТ 4166-76
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77
н-Гексан, хч, свежеперегнанный	ТУ 2631-003-05807999-98
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,005М ортофосфорная кислота
(28:72, по объему)
Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040-0,063 mm) (Merck, Германия)
Стекловата
Фосфора пентоксид, ч	МРТУ 6-09-5759-69
Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (60:40, по объему)
Этиловый эфир уксусной кислоты, чда	ГОСТ 22300-76

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный
Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная (например, Hypersil-MOS (C-8), (100 х 2,1) мм, 5 мкм;
Symmetry C-18, (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters);
LiChrosphert C-18, (250 х 4,6) мм, ODS Zorbax (100x3) мм
Предколонка Waters Symmetry C-18
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные	ГОСТ 34104-80Е
Установка ультразвуковая "Серьга"	ТУ 3.836.008
Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ	ТУ 1-01-0593-79
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1M	ТУ 25-11-917-74
или аналогичный
Бидистиллятор
рН-метр универсальный ЭВ-74	ГОСТ 22261-76
Насос водоструйный	МРТУ 42861-64
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС	ГОСТ 10384-72
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС	ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110	ГОСТ 25336-82
Воронки делительные ВД-3-500	ГОСТ 8613-75
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1 000 см3	ГОСТ 1774-74
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1 000 см3	ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1, 2, 5, 10 см3	ГОСТ 22292-74
Колонки стеклянные (25 х 1) см

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы семян и соломки льна для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 2М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98% (или 225 г 87%) кристаллической помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Для приготовления 0,005М раствора ортофосфорной кислоты 2,5 мл 2М раствора вносят в мерную колбу на 1 л и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.

Для приготовления 1М раствора 228 г кристаллического калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 0,1М раствора 10 мл 1M раствора помещают в мерную колбу на 1 л и доводят раствор до метки дистиллированной водой.

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды.

Для приготовления подвижной фазы в колбе емкостью 1 л смешивают 350 мл ацетонитрила с 650 мл 0,005М раствора ортофосфорной кислоты.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1 000 мл смешивают 600 мл н-гексана и 400 мл этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл. Берут точную навеску метсульфурон-метила (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-0,005М ортофосфорная кислота (35:65, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения метсульфурон-метила в семенах и соломке используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. При изучении полноты определения метсульфурон-метила в льняном масле используют растворы вещества в изопропиловом спирте. Внесение в масло проводят следующим образом: 20 мг аналитического стандарта вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют его в 10 мл изопропилового спирта, доводят до метки льняным маслом и хорошо перемешивают. Затем колбу нагревают на водяной бане для удаления растворителя и отстаивают до получения однородного прозрачного раствора. Этот раствор разбавляют льняным маслом до получения требуемой концентрации метсульфурон-метила в масле.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация метсульфурон-метила в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации метсульфурон-метила в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан-этилацетат (60:40, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл этилацетата и 50 мл элюента N 1 со скоростью 1-2 капли в с, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического
поведения метсульфурон-метила на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора метсульфурон-метила с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40°С), остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 100 мл этилацетата со скоростью 1-2 капли в с. Отбирают фракции по 10 мл каждая, выпаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание метсульфурон-метила (п. 2.6.5).

Фракции, содержащие метсульфурон-метил, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.5). Рассчитывают содержание метсульфурон-метила в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания метсульфурон-метила и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение метсульфурон-метила в масле

Образец масла массой 20 г растворяют в 100 мл гексана, помещают раствор в делительную воронку объемом 250 мл и переэкстрагируют метсульфурон-метил дважды дистиллированной водой, порциями по 50 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2-3 мин и собирая нижний водный слой. Объединенный экстракт промывают трижды гексаном порциями по 50 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2-3 мин. Верхний органический слой отбрасывают. К водному экстракту добавляют 10 мл 1М раствора и промывают дважды хлористым метиленом порциями по 20 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2-3 мин. Нижний органический слой отбрасывают*.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

Водную фазу подкисляют 2М ортофосфорной кислотой до рН 3 и метсульфурон-метил экстрагируют хлористым метиленом трижды по 30 мл, встряхивая воронку каждый раз по 2-3 мин. Верхний водный слой отбрасывают. Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.4.

2.6.2. Определение метсульфурон-метила в семенах льна

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл и экстрагируют метсульфурон-метил 150 мл смеси ацетон-вода (50:50, по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще с 150 мл водно-ацетоновой смеси. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 5 г образца. Ацетон удаляют на роторном испарителе при температуре не выше 40°С, объем водного раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250 мл и промывают трижды гексаном порциями по 50 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2-3 мин и отбрасывая после расслоения верхний органический слой. К водному экстракту добавляют 10 мл 1М раствора и промывают дважды хлористым метиленом порциями по 20 мл, встряхивая делительную воронку в течении 2-3 мин. Нижний органический слой отбрасывают*.

Водную фазу подкисляют 2М ортофосфорной кислотой до рН 3 и метсульфурон-метил экстрагируют хлористым метиленом трижды по 30 мл, встряхивая воронку каждый раз по 2-3 мин. Верхний водный слой отбрасывают. Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

2.6.3. Определение метсульфурон-метила в соломке льна

Навеску измельченной на ножевой мельнице соломки льна массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл и экстрагируют метсульфурон-метил 75 мл ацетонитрила на встряхивателе в течение 1 часа. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 75 мл ацетонитрила. Объединенные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 мл и промывают трижды гексаном порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2-3 мин и отбрасывая верхний гексановый слой. Экстракт выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток в колбе растворяют в 100 мл 0,1 М раствора , помещая колбу на 5 минут в ультразвуковую ванну. Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 30 мл (верхний гексановый слой отбрасывают) и дважды хлористым метиленом порциями по 20 мл (нижний метиленхлоридный слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2-3 минут*.

Водную фазу подкисляют 2М ортофосфорной кислотой до рН 3 и метсульфурон-метил экстрагируют хлористым метиленом трижды по 30 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2-3 мин (верхний водный слой отбрасывают). Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

2.6.4. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1-2.6.3 экстрактов масла и семян и соломки льна количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан-этилацетат (60:40, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Метсульфурон-метил элюируют 90 мл этилацетата, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ детектором (Waters 2487).

Рабочая длина волны 223 нм.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

1. Колонка Symmetry С-18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA). Подвижная фаза: ацетонитрил-0,005М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65. Скорость потока 1 мл/мин. Время удерживания метсульфурон-метила 12,8 0,2 мин.

2. Колонка Nova-Рас С-18 (150 х 3,9) мм, 4 мкм (Waters, USA).

Температура колонки комнатная (в отсутствие термостатирования).

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,005М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 28:72 (по объему). Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Время удерживания метсульфурон-метила 9,8 0,3 мин.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1-2,0 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание метсульфурон-метила в образце семян, масла или соломки льна (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- площадь пика метсульфурон-метила в стандартном растворе, мм;

- площадь пика метсульфурон-метила в анализируемой пробе, мм;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);

С - концентрация стандартного раствора метсульфурон-метила, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств метсульфурон-метила в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор метсульфурон-метила 2 мкг/мл, разбавляют неподвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-106.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "ГОСТ ИСО 5725-106.2002" имеется в виду "ГОСТ ИСО 5725-1 - 6.2002"

4. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

5. Разработчики

Цибульская И.А., Долженко В.И., Юзихин О.С. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

______________________________

* В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном и хлористым метиленом - небольшое количество (до 10 мл) этилового спирта, а на стадии переэкстракции - насыщенный раствор хлорида натрия (15-20 мл).