Приложение 7. Определение ферментативной активности

Приложение 7

Определение ферментативной активности

В качестве диагностического показателя восстановления нарушенных и загрязненных земель наиболее перспективным является определение дегидрогеназа (15).

Учитывая, что ферментативная активность почвы значительно уменьшается с глубиной, отбор почвенных образцов проводится на глубине 0-10 см. Во всех случаях показатели ферментативной активности переводят на вес воздушно-сухой или абсолютно сухой почвы и обязательно указывают какие образцы почвы (сухие или естественно-влажные) проанализированы.

Ход анализа. 1 г воздушно-сухой почвы, а влажной с учетом влажности, помещают в стеклянную пробирку и доливают 2 мл 0,5%-ного водного раствора ТТХ, суспензию тщательно перемешивают и помещают в термостат на 24 ч при температуре 30°С. После инкубации смесь центрифугируют в течение 5 мин. при 3000 oб/мин., насадочную жидкость сливают. Для извлечения формазана, образовавшегося в процессе восстановления ТТХ, почву заливают 7,5 мл ацетона. Экстракцию проводят в течение 1 ч. Пробирки встряхивают и центрифугируют 5 мин. при 3000 об/мин. Окрашенный раствор сливают в пробирки и колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром, используя кюветы толщиной 5 или 1 мм в зависимости от концентрации растворов.

Количество формазана рассчитывают по калибровочной кривой (рис. 6) и выражают в микролитрах водорода (мкл H2 г почвы ч) с учетом того, что на образование 1 мг формазана необходимо 150, 35 мкл водорода.

Результаты измерений активности дегидрогеназ в чистых и загрязненных образцах характеризуют соответствующие состояния почвенной микрофлоры.

Расчет активности дегидрогеназ ведется по формуле:

           С х В 150,35

      АД = ------------,                                            (7.1)

            а Т 10

      где С     - концентрация   формазана,   найденная  по калибровочной

                  кривой;

          а     - навеска почвы (1 г);

          Т     - время инкубации (24 ч);

          10 мл - объем   формазана,    используемый    при    построении

                  калибровочнoй кривой;

          В     - количество ацетона, пошедшее  на  извлечение  формазана

                  (7,5 мл).

      На основании закона Бера С можно выразить как С = Д/К_1,      (7.2)

      где С  - концентрация поглощающегося вещества;

          Д  - показания ФЭK, характеризующие поглощение света;

          К - коэффициент пропорциональности.

           1

Подставляя это выражение в формулу для определения активности дегидрогеназ, получают

           Д В 150,35

      АД = ----------                                              (7.3.)

           К  а Т 10

            1

При использовании кюветы толщиной 1 мм

              7,5 х 150,35

      АД = ------------------ = 18,43                              (7.4.)

           2,55 х 1 х 24 х 10

Таблица 7.1.

Результаты определения активности дегидрогеназ

Дата	Вариант	Кювета, (ф)	Показания ФЭК (В)	АД	Средняя АД	Примечания
01.03.98	2	1	0,049	0,90
			0,039	0,72	0,79
			0,040	0,74
			0,044	0,81

Таблица 7.2.

Результаты измерения оптической плотности ( XР ) рабочих растворов ТФФ

Толщина кювета, мм	Концентрация ТФФ, мг/мл	Средняя оптическая плотность
1	0,0025	0,0088+-0,0015
	0,0050	0,0163+-0,0026
	0,0125	0,0330+-0,0063
	0,0250	0,0620+-0,0014
	0,0500	0,1213+-0,0092
	0,1250	0,3045+-0,0098

Приготовление стандартных растворов и построение калибровочных кривых.

Стандартный раствор TФФ. 25 мг ТФФ взвешивают на аналитических весах, растворяют в 100 мл ацетона при нагревании до З0°С на водяной бане. Концентрация полученного основного раствора 0,25 мг/мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Стандартные рабочие растворы ТФФ готовят из основного раствора. Разводя егo в 2, 5, 10, 20, 50 и 100 раз ацетоном. Для этого в гранулированные пробирки помещают 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1 мл основного раствора ТТФ и доливают до 10 мл ацетона. Содержание пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Каждая концентрация готовится в 3-4-х повторностях. В течение 1 ч. после приготовления рабочие растворы должны быть проанализированы, при этом не следует допускать попадания на них прямых солнечных лучей. Интенсивность окраски рабочих растворов ТФФ, содержащих от 0,0025 до 0,1250 мг/мл вещества, измеряют на ФЭК с синим светофильтром, используя кювету толщиной 1 мм.

Результаты измерения оптической плотности рабочих растворов приведены в табл. 7.2. Калибровочная кривая, построенная по этим данным, представлена на рис. 6. Линейная зависимость оптической плотности от концентрации сохраняется в интервале от 0,0025 до 0,1250 мг/мл.

Значение средней оптической плотности определяли по формуле:

      _   сумма (x j)

      Х = -----------,

               n

а значения (оценка среднего квадратичного отклонения) - по формуле

                                  _ 2

                      сумма (x  - x)

                              i

      S = кв. корень (---------------)

                         n - 4

оценки получены при n = 4.

Приготовление рабочих растворов.

0,5%-ный раствор 2, 3, 5 - ТТХ растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед употреблением.

Основной раствор ТФФ. 25 мг ТТФ растворяют в 100 мл ацетона при нагревании до 30°С на водяной бане.

Реактивы. Ацетон ч.д.а., ГОСТ 2606-63. Трифенил-третразолит хлористый (2,3,5 - ТТХ) ч.д.а., МРТУ 6-09-5328-68. Трифенил-формазан (формазан: 2, 3, 5 - ТФФ) получают следующим образом. 2, 3, 5 - ТТХ растворяют в 5 мл дистиллированной воды. 1,26 г гидросульфита натрия (NaHSO3) растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Растворы сливают после выпадения темно-красного осадка, смесь фильтруют через стеклянный пористый фильтр и осадок промывают на фильтре дистиллированной водой до отсутствия реакции на хлориды (с 0,5%-ным раствором AgNO3). Осадок (2, 3, 5-трифенил-формазин высушивают в сушильном шкафу. Гидросульфит натрия ч.д.а. ТУ МХПГХП 125-56. Нитрат серебра ч.д.а., ГОСТ 1277-63.