Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приложение 7
Определение ферментативной активности
В качестве диагностического показателя восстановления нарушенных и загрязненных земель наиболее перспективным является определение дегидрогеназа (15).
Учитывая, что ферментативная активность почвы значительно уменьшается с глубиной, отбор почвенных образцов проводится на глубине 0-10 см. Во всех случаях показатели ферментативной активности переводят на вес воздушно-сухой или абсолютно сухой почвы и обязательно указывают какие образцы почвы (сухие или естественно-влажные) проанализированы.
Ход анализа. 1 г воздушно-сухой почвы, а влажной с учетом влажности, помещают в стеклянную пробирку и доливают 2 мл 0,5%-ного водного раствора ТТХ, суспензию тщательно перемешивают и помещают в термостат на 24 ч при температуре 30°С. После инкубации смесь центрифугируют в течение 5 мин. при 3000 oб/мин., насадочную жидкость сливают. Для извлечения формазана, образовавшегося в процессе восстановления ТТХ, почву заливают 7,5 мл ацетона. Экстракцию проводят в течение 1 ч. Пробирки встряхивают и центрифугируют 5 мин. при 3000 об/мин. Окрашенный раствор сливают в пробирки и колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром, используя кюветы толщиной 5 или 1 мм в зависимости от концентрации растворов.
Количество формазана рассчитывают по калибровочной кривой (рис. 6) и выражают в микролитрах водорода (мкл H2 г почвы ч) с учетом того, что на образование 1 мг формазана необходимо 150, 35 мкл водорода.
Результаты измерений активности дегидрогеназ в чистых и загрязненных образцах характеризуют соответствующие состояния почвенной микрофлоры.
Расчет активности дегидрогеназ ведется по формуле:
С х В 150,35
АД = ------------, (7.1)
а Т 10
где С - концентрация формазана, найденная по калибровочной
кривой;
а - навеска почвы (1 г);
Т - время инкубации (24 ч);
10 мл - объем формазана, используемый при построении
калибровочнoй кривой;
В - количество ацетона, пошедшее на извлечение формазана
(7,5 мл).
На основании закона Бера С можно выразить как С = Д/К_1, (7.2)
где С - концентрация поглощающегося вещества;
Д - показания ФЭK, характеризующие поглощение света;
К - коэффициент пропорциональности.
1
Подставляя это выражение в формулу для определения активности дегидрогеназ, получают
Д В 150,35
АД = ---------- (7.3.)
К а Т 10
1
При использовании кюветы толщиной 1 мм
7,5 х 150,35
АД = ------------------ = 18,43 (7.4.)
2,55 х 1 х 24 х 10
Таблица 7.1.
Результаты определения активности дегидрогеназ
Дата |
Вариант |
Кювета, (ф) |
Показания ФЭК (В) |
АД |
Средняя АД |
Примечания |
01.03.98 |
2 |
1 |
0,049 |
0,90 |
|
|
|
|
|
0,039 |
0,72 |
0,79 |
|
|
|
|
0,040 |
0,74 |
|
|
|
|
|
0,044 |
0,81 |
|
|
Таблица 7.2.
Результаты измерения оптической плотности ( XР ) рабочих растворов ТФФ
Толщина кювета, мм |
Концентрация ТФФ, мг/мл |
Средняя оптическая плотность |
1 |
0,0025 |
0,0088+-0,0015 |
|
0,0050 |
0,0163+-0,0026 |
|
0,0125 |
0,0330+-0,0063 |
|
0,0250 |
0,0620+-0,0014 |
|
0,0500 |
0,1213+-0,0092 |
|
0,1250 |
0,3045+-0,0098 |
Приготовление стандартных растворов и построение калибровочных кривых.
Стандартный раствор TФФ. 25 мг ТФФ взвешивают на аналитических весах, растворяют в 100 мл ацетона при нагревании до З0°С на водяной бане. Концентрация полученного основного раствора 0,25 мг/мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
Стандартные рабочие растворы ТФФ готовят из основного раствора. Разводя егo в 2, 5, 10, 20, 50 и 100 раз ацетоном. Для этого в гранулированные пробирки помещают 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1 мл основного раствора ТТФ и доливают до 10 мл ацетона. Содержание пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Каждая концентрация готовится в 3-4-х повторностях. В течение 1 ч. после приготовления рабочие р
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.