Приложение N 2. Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа типа А (ВГА), у людей. Временные методические рекомендации (приведены в сокращенном варианте)

Приложение N 2
к приказу министра здравоохранения
Свердловской области
от 22 декабря 2011 г. N 1267-п

Утверждены
Руководителем Роспотребнадзора
Г.Г. Онищенко
01.05.2009 г. N 01/5963-9-23

Организация и проведение
лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа типа А (ВГА), у людей

Временные методические рекомендации (приведены в сокращенном варианте)

1. Общие требования

Все работы по сбору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала осуществляют в строгом соответствии с требованиями МУ 3.4.1028-01 "Организация и проведение первичных мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания карантинными инфекциями, контагиозными вирусными геморрагическими лихорадками, малярией и инфекционными болезнями неясной этиологии, имеющими важное международное значение", СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности", МУ 1.3.1794-ОЗ "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности".

2. Правила сбора клинического (секционного) материала

2.1 Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения, обученный требованиям и правилам биологической безопасности при работе и сборе материала, подозрительного на зараженность ВГА. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами. Все виды работ проводят с соблюдением противоэпидемического режима согласно СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

2.2 Упаковка, маркирование, условия хранения и транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики ВГА должны соответствовать требованиям СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности" и настоящих методических указаний (приложение 3).

2.3. Для исследования забирают следующие виды клинического материала: смывы из полости носа и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа); мазки из полости носа (для ОТ-ПЦР-анализа) и ротоглотки (для ОТ-ПЦР-анализа);

носоглоточное отделяемое (для выделения вируса, ОТ-ПЦР-анализа). Целесообразно также включать в исследование аспираты из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и биоптаты легких при возможности их забора.

Данные процедуры осуществляет подготовленный медицинский персонал в соответствии с МУ 3.4.1028-01 "Организация и проведение первичных мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания карантинными инфекциями, контагиозными вирусными геморрагическими лихорадками, малярией и инфекционными болезнями неясной этиологии, имеющими важное международное значение".

Перечисленные выше процедуры по забору клинического материала обученный медицинский персонал осуществляет в средствах индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор типа ШБ-1 или РБ "Лепесток-200"), защитных очках или щитках для защиты лица, бахилах, двойными резиновыми перчатками. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками в соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

Выбор времени забора клинического материала очень важен, так как наиболее высокое содержание вируса в дыхательных органах человека регистрируется в течение первых четырех дней после появления признаков заболевания. Образцы должны быть собраны в течение 3 суток после появления клинических признаков.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты легких, трахеи и селезенки.

От одного больного должно забираться не менее трех видов клинического материала. Обязательно следует забирать мазки из полости носа и ротоглотки и носоглоточное отделяемое. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

2.4 Сбор материала производят в одноразовые пробирки со стабилизирующей средой, приготовленной согласно приложению 4, и/или в пробирки с транспортной средой (стерильный физраствор).

2.5 Отправку материала в лабораторию осуществляют в транспортной таре со стабилизирующей средой (приложение 4).

3. Упаковка и транспортирование образцов

3.1. Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть герметично упакованы в соответствии с СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности":

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками, проверенные на герметичность); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

2) в плотный полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве, достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять.

3.2. В отдельный полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

3.3. Пакеты с образцами от одного пациента вместе с направлением упаковывают во второй плотный полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

3.4. Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий плотно закрывающийся контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

3.5. В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении N 2.

3.6. Транспортирование проб клинического материала в вирусологические лаборатории осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4. СП 1.2.036-95.

4. Порядок проведения лабораторных исследований

4.1. При отсутствии лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей на данной территории лабораторные исследования с целью диагностики ВГА следует проводить у пациентов с респираторными заболеваниями тяжелого течения и неясной этиологии при наличии как минимум двух из перечисленных симптомов:

- фебрильная лихорадка с температурой тела выше 38С;

- насморк или заложенность носа;

- боль в горле;

- кашель;

- затрудненное дыхание или дыхательная недостаточность.

4.2. Исследование секционного материала от умерших на наличие вируса ВГА проводят при:

- сходстве клинической картины заболевания, приведшего к летальному исходу, или невозможности исключения такой клинической картины в анамнезе и при наличии в анамнезе хотя бы одного из перечисленных дополнительных эпидемиологических признаков.

4.3. Исследования проводят с использованием диагностических тест-систем, разрешенных к применению в установленном порядке.

4.4. При проведении первичного тестирования на наличие вируса ВГА должны исследоваться не менее 2 видов клинического материала (например: мазки из полости носа и из ротоглотки) с использованием метода ОТ-ПЦР.

4.5. При получении отрицательных результатов исследования всех образцов выдается окончательный отрицательный ответ.

При отсутствии регистрации заболевания людей, вызванных ВГА, на данной территории при получении хотя бы одного положительного результата при использовании ОТ-ПЦР выдается предварительный положительный ответ и образцы направляют для подтверждающего тестирования в референс-лабораторию.

В период регистрации заболевания людей, вызванных ВГА на данной территории, обязательное подтверждающее тестирование не проводят, и при получении хотя бы одного положительного результата при использовании ОТ-ПЦР выдается окончательный положительный ответ.

При подтверждении в референс-лаборатории положительного результата первичного тестирования, при исследовании хотя бы одного вида клинического материала выдается окончательный положительный ответ.

При получении в референс-лаборатории отрицательных результатов исследования двух видов клинического материала проводится повторное тестирование. При получении аналогичного результата выдается окончательный отрицательный ответ.

Порядок проведения ПЦР- исследования:

Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени или методом ПЦР с флуоресцентной детекцией результата по конечной точке на базе вирусологических лабораторий. Исследование проводят методами ОТ-ПЦР или РТГА с антигенами на субтипы вируса H1N1, H3N2 (пр-ва НИИ гриппа, Санкт-Петербург).

При исследовании методом ОТ-ПЦР анализ проводится в два этапа:

- исследование по обнаружению вирусов гриппа А с помощью тестов "АмплиСенс Influenza virus A/B-FL" или "АмплиСенс Influenza virus A/H5N1-FL";

- исследование по идентификации вирусов гриппа А, вызывающих сезонный грипп человека с помощью теста "АмплиСенс Influenza virus А-тип-FL".

Ко второму этапу анализа следует приступать при получении положительного результата по обнаружению вируса гриппа А на первом этапе.

Интерпретация результатов исследования.

Обнаружив грипп А с помощью тестов "АмплиСенс Influenza virus A/B-FL" или "АмплиСенс Influenza virus A/H5N1-FL" (в реакции с ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus А) и получив отрицательные результаты с тестом "АмплиСенс Influenza virus A-тип-FL", можно сделать вывод, что в образце присутствует нехарактерный для популяции людей вирус гриппа А (свиней или птиц).

Такие образцы (изоляты) без проведения выделения возбудителя на биосистемах культивирования в субъектах Российской Федерации требуют детального исследования в одной из референс-лабораторий (приложение 1), так как они являются потенциально пандемически опасными.

В случае положительного результата второго этапа анализа больному ставится диагноз "сезонный грипп".

При наличии теста для идентификации вируса гриппа свиней А/Н1 (например, комплект реагентов "АмплиСенс Influenza virus A/Hl-swine-FL" производства#.

Подтверждающее тестирование положительных образцов осуществляется в референс-лабораториях (приложение 1) с обязательным использованием двух методов: вирусологического исследования (выделение вируса должно осуществляться в условиях лаборатории с уровнем защиты BSL-3) и одного из вариантов ПЦР. Результаты исследований в каждом случае передают в ЛПУ, направившее материал, и в учреждения Роспотребнадзора (управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации и ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации) в день получения результата.

При получении положительных результатов подтверждающего тестирования референс-лаборатория проводит изоляцию вируса, изучение его свойств и депонирование в Национальном центре верификации диагностической деятельности, осуществляющим функции государственной коллекции, расположенной на базе ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор".

5. Обеспечение биобезопасности при проведении лабораторных диагностических исследований

5.1 Первичное (скрининговое) исследование материала от больного, подозрительного на зараженность вирусом ВГА, проводят в вирусологических лабораториях, имеющих разрешение на работу с ПБАIII-IV группы патогенности.

Все манипуляции по забору образцов от больных обученный медицинский персонал осуществляет в средствах индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор типа ШБ-1 или РБ "Лепесток-200"), с защитными очками или щитком для защиты лица, резиновыми перчатками в боксе биологической безопасности II класса.

Подтверждающее тестирование осуществляется в референс-лаборатории (приложение 1).

5.2 Проведение работ по проведению вирусологических исследований должно выполняться в лабораториях с уровнем безопасности BSL3: заражение культур клеток или куриных эмбрионов, а также связанных с возможностью образования аэрозоля осуществляют в боксах безопасности III класса. Работы проводят в изолирующем костюме "Кварц".

5.3 Аптечка экстренной профилактики лабораторий, проводящих диагностику заболеваний, вызванных ВГА, должна быть укомплектована в соответствии с СП 1.3.1285-ОЗ и дополнена препаратами группы асельтамивира ("Тамифлю" или аналоги).

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

7.2 Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике ВГА (в соответствии с СП 1.3.1285-ОЗ).

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

7.4.1 Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. - двукратным протиранием с интервалом 15 мин. 6% раствором перекиси водорода или 3% раствором хлорамина (экспозиция 120 мин.) либо любым дезинфицирующим средством, обладающим вирулицидной активностью, с последующей обработкой УФ в течение 60 мин.

Запрещено одновременное использование 6% раствора перекиси водорода и 3% раствора хлорамина в пределах одной лаборатории в связи с опасностью взрывоподобного характера протекания химической реакции при смешении этих растворов.

7.4.2 Обеззараживание защитной одежды осуществляют:

а) кипячением в 2% растворе соды в течение 30 мин. с момента закипания;

б) замачиванием на 30 мин. при 50°С в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

7.4.3 Обеззараживание перчаток - замачиванием на 60 мин. в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства или в 3% растворе хлорамина.

7.4.4 Обеззараживание лабораторной посуды, автоклавируемых дозаторов, наконечников, вирусосодержащих жидкостей, агарозного геля, инструментария из металла проводится методом автоклавирования - давление 2,0 кГс/см2 (0,2 Мпа), температура 1322°С, время 45 мин.

7.4.5 Обеззараживание дозаторов - двукратным протиранием поверхностей дозатора с интервалом 15 мин. 6% раствором перекиси водорода, с последующей обработкой в парах формалина в течение 60 мин.

Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ВГА

1. Мазки из ротоглотки
1.1. Сбор материала	Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают
1.2. Предобработка проб	Не требуется
1.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
1.4. Условия хранения материала	При температуре от 2 до 8°С - в течение трех суток. При температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. Температура хранения минус 20°С не допускается
1.5. Условия транспортирования материала	В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 0-4°С - не более трех суток; - при температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20°С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней
2. Мазки из полости носа
2.1.Сбор материала	Мазки (слизь) берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Для ПЦР-анализа. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую микропробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают
2.2. Предобработка проб	Не требуется
2.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
2.4 Условия хранения материала	Пункт 1.4
2.5. Условия транспортирования материала	Пункт 1.5
3. Смывы из полости носа
3.1. Сбор материала	Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
3.2.Предобработка проб	Не требуется
3.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
3.4. Условия материала	См. п. 1.4.
3.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.
4. Смывы из ротоглотки
4.1. Сбор материала	Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек.) 8-10 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием
4.2. Предобработка проб	Не требуется
4.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
4.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
4.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.
5. Носоглоточное отделяемое
5.1. Сбор материала	Производится натощак после взятия мазков из полости носа. Осуществляется двумя способами: 1. Больной в три приема прополаскивает горло 10-15 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Смыв собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Ватными тампонами, зажатыми пинцетом, протирают заднюю стенку глотки и носовые ходы. Ватные тампоны опускают во флакон со смывом. 2. Сухим или слегка увлажненным 0,9% раствором натрия хлорида тампоном, который удерживают с помощью пинцета, протирают заднюю стенку глотки и опускают его в пробирку с 5 мл стабилизирующей среды (приложение 3). Процедуру повторяют 2-3 раза. Все тампоны от одного больного собирают в одну пробирку. После взятия материала с задней стенки глотки тщательно протирают носовые ходы небольшими ватными тампонами и опускают их в ту же пробирку. Пробирку закрывают
5.2. Предобработка проб	Тампоны прополаскивают в стабилизирующей среде, в которой они содержались, отжимают о стенку сосуда и удаляют. Смыв отстаивают в холодильнике 40-60 мин. Центрифугирование и фильтрацию не проводят. Для выделения вируса используют среднюю часть отстоя, которую небольшими порциями переносят в 3 стерильные пробирки. Одну используют для выделения вируса, остальные замораживают при температуре минус 70°С или в жидком азоте
5.3. Метод исследования	Выделение вируса
5.4. Условия хранения материала	При температуре от 2 до 8°С - не более 3 дней. При температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. Температура хранения минус 20°С не допускается
5.5. Условия транспортирования материала	См. п.п. 1.5.
6. Секционный материал
6.1. Сбор материала	В качестве секционного материала используются ткани легких, трахеи, сегментарных бронхов, селезенки. Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл
6.2. Предобработка проб	Кусочки органов гомогенизируют в стерильных фарфоровых ступках и готовят 10% суспензию на стерильном 0,9% растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 10000 оборотах в течение 30 секунд. Супернатант используют для выделения РНК
6.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР, выделение вируса
6.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
6.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.