Методические указания по определению остаточных количеств дифлубензурона в яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МУК 4.1.1947-05 (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 18 января 2005 г.)

Дата введения: 18 апреля 2005 г.

1. Вводная часть

Фирма производитель: ЗАО Фирма "Август".

Торговое наименование: Герольд, ВСК

Действующее вещество: дифлубензурон.

Структурная формула:

1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (IUРАС).

N-{[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (С.А.).

Брутто формула: .

Мол. масса: 310,7.

Бесцветное кристаллическое вещество (технический - кристаллы от белых до желтых).

Температура плавления: 228°С (техн.: 210-230°С).

Давление паров при 25°С:  мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: .

Растворимость (г/л) при 20°С: н-гексан - 0.063, толуол - 0.29, дихлорметан - 1.8, метанол - 1.1, вода - 0.08 мг/л (при рН 7 и 25°С).

Вещество стабильно в кислых средах (20°С, рН 5-7, дней), разлагается в щелочных растворах (при рН 9 42 дня).

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность для мышей и крыс - более 4640 мг/кг; острая дермальная токсичность для кроликов - более 2000 мг/кг, для крыс - более 10000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - более 2,88 мг/л. Токсичен для пчел. для рыб 130-150 мг/л при экспозиции 96 часов.

Мутагенный и онкогенный эффекты при использовании препарата не наблюдались.

Гигиенические нормативы для дифлубензурона в России:

ОДК в почве - 0,2 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/л; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 3,0 ; МДУ для яблок - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата: Несистемный регулятор роста насекомых с контактным и кишечным действием. Используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами. Эффективен против яблонной плодожорки, листоверток и др.

2. Методика определения дифлубензурона в яблоках методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении дифлубензурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0.95
Яблоки	0.01	0.01 - 0.1	89,7	6,24	5,47

Таблица 2

Полнота определения дифлубензурона в яблоках (N = 5 для каждой концентрации)

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение,	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Яблоки	0,01	0,00887		88,7
	0,02	0,01788		89,4
	0,05	0,04475		89,5
	0,1	0,0012		91,2
Среднее				89,7

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бикарбонат натрия, х.ч., ГОСТ 4201-79.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Дифлубензурон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 2631-019-44493179-98.

Диэтиловый эфир, ч., ОСТ 84-2006-88.

Железо (II) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (56:44, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0.040-0.063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (55:45, по объему).

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.

Колонка Symmetry - С18 (250х4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 , ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 , ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 , ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25х1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.79 г., N 2051-79. Пробы яблок хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°С, перед проведением анализа пробы гомогенизируют в гомогенизаторе.

2.5. Подготовка к определению.

2.5.1. Подготовки и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5% раствором перманганата калия, 5% раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ).

Ацетонитрил (х.ч.) сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0.02М раствора ортофосфорной кислоты 2 г 98% (или 2,25 г 87%) кристаллической помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0.1М раствора 9,3 г кристаллического бикарбоната натрия помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки. Для получения 60%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 600 мл ацетона с 400 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 560 мл ацетонитрила с 440 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 800 мл н-гексана и 200 мл диэтилового эфира. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 550 мл н-гексана и 450 мл диэтилового эфира.

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску дифлубензурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (Стандартный раствор с концентрацией 1.0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 и 2.0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - бидистиллированная вода (56:44, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (55:45, по объему) и 30 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения дифлубензурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора дифлубензурона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 60 мл элюента N 1, затем 60 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3.) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 2.6.3.

Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания дифлубензурона может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение дифлубензурона в яблоках

Навеску, массой 20 г гомогенизированных в гомогенизаторе яблок помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют дифлубензурон 40 мл 60%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 мл. Объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе при температуре 40°С до объема ~50 мл.

Дифлубензурон переэкстрагируют трижды хлористым метиленом, порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2-3 мин. Верхний водный слой отбрасывают.* Объединённый экстракт промывают в делительной воронке дважды 0,1 М раствором бикарбоната натрия порциями по 30 мл и один раз 50 мл 0.02М раствора ортофосфорной кислоты, встряхивая воронку в течение 2-3 минут (при всех промывках верхний водный слой отбрасывают). Органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2.

2.6.2. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1. экстрактов яблок, количественно переносят тремя порциями (по 3 мл) смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6.). Промывают колонку 60 мл элюента N 1, который отбрасывают. Дифлубензурон элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry - С18 (250х4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Температура колонки °С.

Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 56:44 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 260 нм.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Время удерживания дифлубензурона  мин.

Линейный диапазон детектирования 0.1-2.00 мкг/мл.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифлубензурона в образце яблок (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где - площадь пика дифлубензурона в стандартном растворе, ;

- площадь пика дифлубензурона в анализируемой пробе, ;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора дифлубензурона, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 2 мкг/мл разбавляют.

3. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерения осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

4. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

5. Разработчики

Цибульская И.А., Юзихин О.С. (ВИЗР, Санкт-Петербург).

Главный Государственный санитарный врач Российской Федерации, Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Г.Г. Онищенко