Методические указания по лабораторной диагностике аэромоноза (краснухи) карпов (утв. Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 23 апреля 1986 г. N 13-3/5)

1. Общие положения

1.1. Аэромоноз - инфекционная болезнь карпов, сазанов и их гибридов, проявляющаяся серозно-геморрагическим воспалением кожного покрова, асцитом, некротическим распадом кожной и мышечной тканей, поражением внутренних органов.

1.2. Возбудитель болезни - Aeromonas hydrophila, представляет собой грамотрицательную, оксидазоположительную, подвижную, не образующую спор и капсул полиморфную палочку. Факультативный анаэроб.

1.3. Диагноз на аэромоноз ставят на основании клинических, эпизоотологических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют не менее 5 живых рыб с признаками острого и подострого течения болезни.

Рыба с признаками хронического течения заболевания для исследования непригодна.

1.5. Исследование на аэромоноз включает посевы на питательные среды и определение патогенности выделенных культур; при необходимости проводят серологическое исследование для определения серогрупповой принадлежности выделенной культуры.

2. Бактериологическое исследование

2.1. Высевы из крови, асцитной жидкости, паренхиматозных органов, содержимого кожных пузырей и язв проводят в МПБ и на МПА. Поверхность язв перед посевом не прижигают, но промывают стерильным физраствором.

2.2. Посевы инкубируют при 25-26°С в течение 48 ч.

В МПБ возбудитель аэромоноза дает равномерное помутнение, при встряхивании муаровые волны, в дальнейшем образуется осадок и маслянистая пленка на поверхности среды.

На МПА A.hydrophila образует круглые, выпуклые, с ровными краями, блестящие, полупрозрачные с голубоватым оттенком или бело-матовые колонии, диаметром 2-3 мм.

2.3. При обнаружении характерного роста для дифференциации A.hydrophila от бактерий сходных родов проводят определение оксидазной активности культуры, подвижности, способности к расщеплению глюкозы в среде Хью-Лейфсона (тест окисления-ферментации), ферментации маннита на среде Гисса (см. табл. 1).

2.3.1. Для определения оксидазной активности 2-суточную агаровую культуру наносят штрихом на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной реактивом, для приготовления которого к 30-40 мг , растворенного в 2,5 мл спирта-ректификата, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и 40-60 мг диметил-парафенилендиамина или проявителя Т-32 (реактив готовят непосредственно перед применением). Оксидазоположительные культуры на месте нанесения на бумагу окрашиваются в ярко-синий цвет через 30-60 сек.

Оксидазоотрицательные культуры в дальнейшем не исследуют.

2.3.2. Способность к расщеплению глюкозы в среде Хью-Лейфсона (тест окисления-ферментации).

Исследуемую культуру высевают уколом в две пробирки со средой Хью-Лейфсона, после чего на поверхность среды в одной из них наслаивают вазелиновое масло (примерно 0,5 мл). Посевы инкубируют 24 ч при 25-26°С. Возбудитель A.hydrophila subsp. hydrophila расщепляет как в аэробных, так и в анаэробных условиях с образованием кислоты и газа (A.hydrophila subsp.anaerogenes газа в среде не образует). В обеих пробирках цвет среды становится соломенно-желтым (происходит окисление и ферментация).

На среде Гисса с маннитом A.hydrophila subsp.hydrophila ферментирует маннит с образованием кислоты и газа, A.hydrophila subsp.anaerog. с образованием кислоты без газа.

2.3.2.1. При отсутствии газообразования на среде Хью-Лейфсона и Гисса определяют способность выделенной культуры продуцировать сероводород и протеолитическую активность ее.

Для определения образования сероводорода под пробку пробирки с МПБ, засеянным исследуемой культурой, помещают сухую полоску фильтровальной бумаги, пропитанную 5%-ным раствором ацетата свинца. Полоска не должна соприкасаться со средой. Посевы инкубируют 48 ч при 25-26°С. Возбудитель аэромоноза в процессе роста образует сероводород, в результате чего часть полоски чернеет.

Дня определения протеолитической способности исследуемую культуру высевают в лакмусовое молоко и инкубируют 48-72 ч при 25-26°С. Возбудитель A.hydrophila обладает протеолитической активностью, в результате чего лакмусовое молоко краснеет, свертывается и в дальнейшем подвергается пептонизации.

2.4. Для определения подвижности культуру высевают в ПЖА и инкубируют 48 ч при 25-26°С. Возбудитель аэромоноза подвижен, растет диффузно.

3. Серологическая идентификация выделенных культур

3.1. Серологическая идентификация выделенных культур основана на выявлении специфических антигенов с использованием типоспецифических аэромонадных сывороток в пластинчатой реакции агглютинации (РА).

3.2. Для исследования берут не менее десяти колоний 2-суточной агаровой культуры, с типичными для возбудителя аэромоноза морфологическими признаками.

3.3. Постановка реакции.

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю смеси типоспецифических аэромонадных сывороток, предварительно разведенных физиологическим раствором 1:10, и каплю физиологического раствора для контроля антигена.

В обе капли вносят исследуемую культуру и тщательно суспендируют.

Реакцию считают положительной, если через 1-2 мин в капле смеси сывороток образуются хлопья, а сама жидкость просветлеет и контроль антигена остается без изменений.

При положительном результате пластинчатой РА, культуру исследуют с каждой типоспецифической сывороткой отдельно.

Необходимо учитывать, что могут быть неизвестные патогенные штаммы возбудителя, присутствие которых выявляют биопробой.

4. Биологическое исследование

4.1. Биологическую пробу ставят на 3 карпах массой 100-200 г, завезенных из благополучного по аэромонозу хозяйства.

4.2. Двухсуточную бульонную культуру или смыв с агара 0,65%-ным раствором NaCI с концентрацией 2 млрд. микробных тел вводят рыбам внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл. Температура воды в аквариумах, где содержат рыб, должна быть не ниже 18-20°С.

Одновременно ставят контроль на 3 рыбах, которым вводят стерильный МПБ в тех же дозах.

Срок наблюдения 10 суток.

4.3. В случае заболевания или гибели рыб проводят бактериологическое исследование. Выделенную культуру идентифицируют, как указано в п. 2.3.

4.4. Биологическую пробу считают положительной, если все зараженные рыбы заболели или погибли с признаками аэромоноза, а из крови и внутренних органов реизолирована исходная культура.

5. Лабораторный диагноз на аэромоноз считают установленным при выделении культуры со свойствами, характерными для возбудителя болезни и патогенной для подопытных рыб.

6. Срок исследования - 20 дней.

Таблица 1

Дифференциация возбудителя аэромоноза A.hydrophila от бактерий сходных родов

Основные признаки	Aeromonas hydrophila		Vibrio	Pseudomonas	Plesiomonas
	подвид hydrophila	подвид anaerogenes
Наличие оксидазы	+	+	+	+	+
Наличие глюкозы на среде Хью-Лейфсона:
аэробное (окисление)	кг	к	к	к	-
анаэробное (ферментация)	кг	к	к	-	к
Маннит	кг	к	к	-	-
Образование сероводорода	+	+	-		-
Лакмусовое молоко	покраснение, свертывание, далее пептонизация	покраснение, свертывание, далее пептонизация	не изменяет

Начальник Главного управления ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР

А.Д. Третьяков