Методические рекомендации MP 4.2.2017-20 "Методы идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы MON87419, MON87427 и ГМ-рапса MS11" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 7 октября 2020 г.)

Методические рекомендации MP 4.2.2017-20
"Методы идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы MON87419, MON87427 и ГМ-рапса MS11"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 7 октября 2020 г.)

I. Общие положения и область применения

1.1. Наращивание производства и импорта генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки, повышение вероятности попадания пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, или с их использованием, на российский продовольственный рынок обусловливает необходимость разработки методики идентификации присутствия компонентов генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО), не зарегистрированных в Российской Федерации. Контроль и мониторинг продукции, содержащей ГМО, обеспечивает биобезопасность Российской Федерации, предупреждая проникновение и расселение ГМО на территории Российской Федерации.

Имеется большое количество стратегий скрининга и идентификации ГМО в различных лабораториях по всему миру. Современная тенденция заключается в создании систем, способных осуществлять скрининг максимального количества известных в настоящее время ГМО в процессе одного исследования. Еще одной современной тенденцией является комбинирование таких систем с базами данных, что может значительно повысить эффективность скрининга [4, 9-11].

1.2. Настоящие методические рекомендации (далее - MP) содержат описание методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК (ГМ-специфичной ДНК), характерной для уникальных трансформационных событий генетически модифицированной кукурузы (далее - ГМ-кукурузы) MON87419, MON87427 и генетически модифицированного рапса (далее - ГМ-рапса) MS11.

Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее - ПЦР-РВ) по технологии TaqMan*, могут быть использованы для контроля за ГМО в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения).

1.3. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО основаны на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.

1.4. MP могут применяться при контроле растительного сырья и пищевых продуктов на наличие ГМО на этапах гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза и реализации в Российской Федерации.

1.5. MP предназначены для лабораторий организаций Роспотребнадзора, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке.

II. Сущность метода

2.1. Метод выявления компонентов ГМО, не зарегистрированных в Российской Федерации, основан на использовании ПЦР-РВ. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО базируется на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.

2.2. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:

- одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);

- другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).

2.3. Для построения калибровочных кривых могут быть использованы соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее - ССО**) с известным содержанием ДНК. Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) - по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.

III. Оборудование и материалы

3.1. Испытательное и вспомогательное оборудование

Амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени с программным обеспечением
Дозаторы механические с переменным объемом дозирования
Центрифуга настольная со скоростью вращения не менее 11000 g со сменными роторами для пробирок на 1,5 и на 0,5 мл	ГОСТ IEC 61010-2-020 [3]
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс" или микроцентрифуга "Вортекс" (максимальное ускорение 450 g)	ТУ 64-1-1081
Ламинарный бокс или бокс для ПЦР со встроенной системой УФ-облучения
Холодильник с отделениями на температуру плюс 2-8°С и на температуру от -24 до -16°С	ГОСТ 26678 [1]
Термостат твердотельный для пробирок полипропиленовых с крышкой объемом 0,5 мл и 1,5 мл, диапазон температур - от комнатной до плюс 99°С
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ Р 53228 [2]

Примечание. Допускается использование испытательного и вспомогательного оборудования с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.

3.2. Расходные материалы

Пробирки полипропиленовые с крышкой вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл
Наконечники одноразовые с фильтром, для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 100; 200 и 1000 мкл

Примечание. Допускается использование расходных материалов с характеристиками не хуже указанных.

3.3. Реактивы

Реакционная смесь для ПЦР
Вода деионизованная
Специфичные праймеры и ДНК-зонды, перечисленные в табл. 2, 6, 10
Методика может быть реализована с помощью готовых наборов реактивов

Примечание. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

IV. Методы идентификации и количественного определения линий ГМ-кукурузы (MON87419, MON87427)

4.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии МОN87419 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87419, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген hmg, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (англ. high mobility group, HMG).

4.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 5 геномных копий кукурузы линии MON87419 на реакцию; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 200 нг ДНК кукурузы.

4.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг [8]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в таблицах 1-4. Для приготовления раствора 1 (табл. 1) может быть использован стандартный образец, содержащий 10% ДНК кукурузы линии MON87419. Для количественного определения трансформационного события MON87419 используется реакционная смесь (табл. 3) согласно протоколу Объединённого Научного Центра Европейского Союза (англ. Joint Research Centre, далее - JRC) [5]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 1

Количество геномных копий ГМ-кукурузы в растворах ДНК, используемых для построения калибровочной кривой

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1 10% (получен из 10% ССО)	Раствор 2 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 1)	Раствор 3 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 2)	Раствор 4 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 3)	Раствор 5 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 4)
Общее содержание ДНК в реакции, нг	250	63	16	3,9	0,98
Референсный ген кукурузы hmg, копии	91575	22894	5723	1431	358
Трансформационное событие MON87419, копии	9158	2289	572	143	36

Таблица 2

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MON87419
Прямой праймер	87419 QF	5' CGG TCG CTG CCA GGT ATT G 3'	19
Обратный праймер	87419 QR	5' CAG ACC TCA ATT GCG AGC TTT CT 3'	23
TaqMan-зонд	87419 QP	5' FAM-TGT GCG CCA GTC AGC АТС АТС ACA CC-TAMRA 3'	26
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы hmg
Прямой праймер	hmg primer 1	5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA 3'	23
Обратный праймер	hmg primer 2	5' GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС Т 3'	22
TaqMan-зонд	hmg probe	5' FAM-CAA ТСС АСА CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA 3'	23

Таблица 3

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК, MON87419
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер 87419 QF (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер 87419 QR (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд 87419 QP (10 мкМ)	200 нМ	0,50
Вода деионизированная	-	5,5
Образец ДНК	-	5,0
Итого:		25 мкл
Таксон-специфичная ДНК, hmg
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер hmg primer 1 (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер hmg primer 2 (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд hmg probe (10 мкМ)	160 нМ	0,40
Вода деионизированная	-	5,6
Образец ДНК	-	5,0
Итого:		25 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу JRС для количественного определения трансформационного события MON87419. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 4

Температурно-временной режим амплификации*

Стадия	Температура	Время (с)	Детекция	Циклы
Активация урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ)	50	120	нет	1
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	45
	60	60	да

______________________________

* Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87419. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

4.2. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON87427 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87427, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген hmg.

4.2.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 200 нг ДНК кукурузы.

4.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг [8]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 5-8. Для приготовления раствора 1 (табл. 5) может быть использован 100% ССО, кат. N AOCS 0512-A2. Для количественного определения трансформационного события MON87427 используется реакционная смесь (табл. 7) согласно протоколу JRC [6]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 5

Количество геномных копий ГМ-кукурузы в растворах ДНК, используемых для построения калибровочной кривой

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1 10% (получен из 10% ССО)	Раствор 2 (получен путем 3,8-кратного разбавления раствора 1)	Раствор 3 (получен путем 3,8-кратного разбавления раствора 2)	Раствор 4 (получен путем 3,8-кратного разбавления, раствора 3)	Раствор 5 (получен путем 3,8-кратного разбавления раствора 4)
Общее содержание ДНК в реакции, нг	200	53	14	3,6	0,96
Референсный ген кукурузы hmg, копии	73260	19413	5128	1318	351
Трансформационное событие MON87427, копии	7326	1941	513	132	35

Таблица 6

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MON87427
Прямой праймер	MON87427 primer 1	5' ACG GAA ACG GTC GGG TCA AAT G 3'	22
Обратный праймер	MON87427 primer 2	5' CCA TGT AGA TTT CCC GGT TTT CTC 3'	24
TaqMan-зонд	MON87427 probe	5' FAM-TCG GGA CAA TAT GGA GAA AAA GAA AGA G-TAMRA 3'	28
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы hmg
Прямой праймер	hmg primer 1	5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA 3'	23
Обратный праймер	hmg primer 2	5' GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС Т 3'	22
TaqMan-зонд	hmg probe	5' FAM-CAA ТСС АСА CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA 3'	23

Таблица 7

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК, MON87427
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер MON87427 primer 1 (10 мкМ)	450 нМ	1,125
Праймер MON87427 primer 2 (10 мкМ)	450 нМ	1,125
Зонд MON87427 probe (5 мкМ)	200 нМ	1,0
Вода деионизированная	-	5,25
Образец ДНК	-	4,0
Итого:		25 мкл
Таксон-специфичная ДНК, hmg
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер hmg primer 1 (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер hmg primer 2 (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд hmg probe (10 мкМ)	160 нМ	0,80
Вода деионизированная	-	6,2
Образец ДНК	-	4,0
Итого:		25 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87427. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 8

Температурно-временной режим амплификации*

Стадия	Температура	Время (с)	Детекция	Циклы
Активация урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ)	50	120	нет	1
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	45
	60	60	да

______________________________

* Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87427. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

V. Метод идентификации и количественного определения ГМ-рапса линии MS11

5.1. Метод идентификации и количественного определения рапса линии MS11 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MS11, расположенная на границе геномной ДНК рапса и генно-инженерной генетической конструкции.

- таксон-специфичная для рапса масличного целевая последовательность - ген круциферина А (CruA).

5.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 0,023% в 200 нг ДНК рапса; предел количественного определения метода составляет не менее 0,08% в 200 нг ДНК рапса.

5.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома рапса, равной 1,15 пкг [8]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 13-16. Для приготовления раствора 1 (табл. 9) может быть использован 100% ССО, кат. N AOCS 1116-А. Для количественного определения трансформационного события MS11 используется реакционная смесь (табл. 11) согласно протоколу JRC [7]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 9

Количество геномных копий ГМ-рапса в растворах ДНК, используемых для построения калибровочной кривой

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1 5% (получен из 5% ССО)	Раствор 2 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 1)	Раствор 3 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 2)	Раствор 4 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 3)	Раствор 5 (получен путем 3-кратного разбавления раствора 4)
Общее содержание ДНК в реакции, нг	300	75	18,8	4,7	1,6
Количество геномных копий рапса масличного, копии	260870	65217	16304	4076	1359
Трансформационное событие MS11, копии	13043	3261	815	204	68

Таблица 10

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MS11
Прямой праймер	SHA086	5' САА GAT GGG AAT TAA CAT СТА САА ATT G 3'	28
Обратный праймер	MDB371	5' GAA АТС CAT GTA AAG СAG СAG GG 3'	23
TaqMan-зонд	ТМ280	5' FAM-CGA CCA TGT АСА ТСС ТАС СА-MGB 3'	20
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген рапса CruA
Прямой праймер	MDB510	5' GGC CAG GGT ТТС CGT GAT 3'	18
Обратный праймер	MDB511	5' CCG TCG TTG TAG AAC CAT TGG 3'	21
TaqMan-зонд	ТМ458	5' JOE-AGT CCT TAT GTG CTC CAC TTT CTG GTG CA-BHQ1 3'	29

Таблица 11

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК, MS11
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер SHA086 (10 мкМ)	400 нМ	1,0
Праймер MDB371 (10 мкМ)	400 нМ	1,0
Зонд ТМ280 (10 мкМ)	200 нМ	0,50
Вода деионизированная	-	5,0
Образец ДНК	-	5,0
Итого:		25 мкл
Таксон-специфичная ДНК, CruA
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер MDB510 (10 мкМ)	200 нМ	0,50
Праймер MDB511 (10 мкМ)	200 нМ	0,50
Зонд ТМ458 (10 мкМ)	200 нМ	0,50
Вода деионизированная	-	6,0
Образец ДНК	-	5,0
Итого:		25 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MS11. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 12

Температурно-временной режим амплификации*

Стадия	Температура	Время (с)	Детекция	Циклы
Активация урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ)	50	120	нет	1
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	40
	60	60	да

______________________________

* Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MS11. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

VI. Интерпретация результатов

6.1, Полученные в ходе испытания данные (кривые накопления флуоресцентного сигнала) анализируют по одному каналу детекции с использованием программного обеспечения прибора.

6.2. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует значению порогового цикла Ct для каждой реакции.

6.3. Калибровочными точками являются значения пороговых циклов Ct, которым соответствуют логарифмы количества копий ДНК растворов, приготовленных из ССО. Калибровочная кривая строится по калибровочным точкам, что может быть сделано с помощью электронных таблиц или непосредственно в программном обеспечении прибора. По полученным калибровочным кривым путем линейной интерполяции рассчитывается количество копий ГМ-специфичной ДНК и таксон-специфичной ДНК в анализируемых пробах.

6.4. Содержание ГМО в пробе представляет собой отношение количества копий ГМ-специфичной ДНК к количеству копий таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах. Расчет производят по формуле:

Библиографические ссылки

1. ГОСТ 26678 "Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ IEC 61010-2-020 "Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 2-020. Частные требования к лабораторным центрифугам".

4. Barbau-Piednoir, E. Inter-laboratory Testing of GMO Detection by Combinatory SYBR Green PCR Screening (CoSYPS)/E. Barbau-Piednoir, P. Stragier, N. Roosens, M. Mazzara, С. Savini, G. Van den Eede, M.Van den Bulcke//Food Analytical Methods. 2014. Vol. 7, no. 8. P. 1719-1728.

5. Event-specific Method for the Quanitification of maize MON87419 by Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02_17_VM_MON87419.pdf.

6. Event-specific Method for the Quantification of Maize MON87427 Using Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-03-12-VM.pdf.

7. Event-specific Method for the Quantification of oilseed rape MS11 by Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-03-16-VM.pdf.

8. Plant DNA C-values Database. Royal Botanic Gardens, Kew. URL: http://data.kew.org/cvalues/.

9. Scholtens, I. Practical experiences with an extended screening strategy for genetically modified organisms (GMOs) in real-life samples/I. Scholtens, E. Laurensse, B. Molenaar, Zaaijer S., H. Gaballo, P. Boleij, E. Kok//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013. Vol. 61, no. 38. P. 9097-9109.

10. Van den Bulcke, M. A theoretical introduction to "Combinatory SYBR Green qPCR Screening", a matrix-based approach for the detection of materials derived from genetically modified plants/M. Van den Bulcke, A. Lievens, E. Barbau-Piednoir, G. Mbon-goloMbella, N. Roosens, M. Sneyers, A.L. Casi//Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010. Vol. 396, no. 6. P. 2113-2123.

11. Waiblinger, H.-U. A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants/H.-U. Waiblinger, L. Grohmann, J. Mankertz, D. Engelbert, K. Pietsch//Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010. Vol. 396, no. 6. P. 2065-2072.

______________________________

* Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченого флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.

** Могут использоваться ССО Института контрольных материалов и измерений (англ. Institute for Reference Materials and Measurements (JRC-IRMM) [ec.europa.eu/jrc/en/reference-materials/catalogue], CCO Американского общества химиков масложировой промышленности (англ. American Oil Chemists Society; AOCS) [www.aocs.org/crm], или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова