Приложение 8. Молекулярно-генетические методы выявления резистентных к пиретроидам насекомых

Приложение 8
к Р 4.2.3647-20

Молекулярно-генетические методы выявления резистентных к пиретроидам насекомых

1. Метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления резистентных к перметрину микропопуляций вшей Pediculus humanus.

Подготовка проб. Вшей (по одной особи) помещают в пробирки (тип пробирок зависит от способа гомогенизации материала), которые подписывают водостойким маркером. Добавляют 96%-й этиловый спирт (экспозиция 5 мин), затем отбирают его при помощи медицинского вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, "ОМ-1"). После этого таким же образом насекомых промывают физиологическим раствором (экспозиция 5 мин). Затем в каждую пробирку добавляют 130--180 мкл физиологического раствора в зависимости от размера (стадии развития) вшей и помещают шарик из нержавеющей стали (диаметр 5 мм), который при встряхивании вызывает механическое разрушение и гомогенизацию вшей. Пробирки плотно закрывают и помещают в гомогенизатор на 10 мин. Далее осаждают капли жидкости с крышки, используя вортекс. После чего аккуратно отбирают жидкость и переносят ее в чистую пробирку типа "Eppendorf". Пробирки помещают в микроцентрифугу и центрифугируют в течение 2 мин при 1500 g, затем в новые (чистые) пробирки типа "Eppendorf" отбирают по 100 мкл надосадочной жидкости и используют ее для выделения ДНК.

ДНК выделяют, используя стандартные наборы реактивов, предназначенные для этих целей согласно инструкции по применению. Образцы выделенной ДНК можно хранить при температуре не выше минус 16°С в течение 1 месяца, не выше минус 68°С - в течение года и более.

2. ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводят в термоциклере для проведения ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентным детектированием продуктов амплификации.

Готовят две смеси: Смесь 1 - ПЦР-смесь-1-FRT: праймер Ped-F: TGGGTCGAACTGTTGGAGCTT, 0,9 пмоль/мкл; праймер Ped-R: CCATAACGGCAAATATGAATATGAT концентрация в ПЦР-смеси-1, 0,9 пмоль/мкл; зонд Ped-S: FAM-TGGGTAATTTAACATTCGTCCTT TGCC-BQH1, концентрация в ПЦР-смеси-1, 0,25 пмоль/мкл; зонд Ped-R: R6G-TGGGTAATTTAATATTCGTCTTTTGCC-BQH1, 0,25 пмоль/мкл.

Для приготовления реакционной смеси 2 в отдельной стерильной пробирке смешивают из расчета на 1 реакцию: 5 мкл буфера для ПЦР (например, Taq буфер с сульфатом аммония и 20 мМ хлоридом магния (10х) с добавлением по 100 мМ каждого из 4 нуклеозидтрифосфатов) 0,5 мкл Taq-полимеразы. Тщательно перемешивают смесь на вортексе и осаждают капли с крышки пробирки. В пробирки (чипы) для проведения РТ-ПЦР вносят 10 мкл ПЦР-смесь-1-FRT, 5 мкл смеси 2 и 10 мкл исследуемого образца ДНК. Реакцию амплификации проводят в следующем режиме: 95°С - 15 мин, затем 45 циклов по схеме: 95°С - 10 с, 60°С - 20 с.

Детекцию флуоресцентного сигнала проводят по каналам для флуорофоров канал детекции Green (чувствительный аллель) и Yellow (резистентный аллель) при 60°С. Метод позволяет выявить гомозиготных по резистентному аллелю (RR, Yellow), гетерозиготных (SR, Yellow и Green одновременно) и гомозиготных чувствительных (SS, Green) особей.

Для секвенирования участка гена vsscl, содержащего все три мутации, используют праймеры 5'QSMI-TGTGGCCTTACTTGTATTCGA и 3'QSTILF-TTACCCGTGTAATTTTTTCCA, фланкирующие область, содержащую исследуемые мутации. Программа амплификации состоит из следующих циклов 95°С - 5 мин - 1 цикл, 95°С - 10 с, 58°С - 10 с, 72°С - 10 с - 42 цикла, 72°С - 2 мин - 1 цикл.

На основании полученных данных определяют частоту резистентного аллеля (R) в исследуемых микропопуляциях. Частота аллеля равна отношению количества данных аллелей у всех особей к общему количеству аллелей в популяции.

Пример расчета: установлено, что в выборке особи с генотипами SS, RS, RR составляют 20%, 30% и 50% соответственно. Сумма всех аллелей равна 20 x 2 (SS) + 30 x 2 (RS) + 50 x 2 (RR) = 200, сумма резистентных аллелей 50 x 2 (RR) + 60 : 2 (RS) = 130. Частота резистентного аллеля в выборке 130 : 200 = 0,65 (65%).

3. Метод полимеразной цепной реакции для выявления резистентных к пиретроидам популяций постельного клопа Cimex lectularius.

Подготовка проб (гомогенизация). Клопов (по 5 особей) помещают в пробирки (тип пробирок зависит от способа гомогенизации материала) с предварительно добавленным реагентом, которые подписывают водостойким маркером, и растирают тефлоновым пестиком. Инкубируют лизат при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы произошла полная диссоциация нуклеотидных комплексов. Центрифугируют лизат при 12000 g в течение 10 мин для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переливают в новые пробирки.

Разделение фаз. После добавления хлороформа (0,2 на каждый 1 реагента экстракт РНК, добавленного на этапе гомогенизации) пробирки слегка встряхивают вручную в течение 15 с и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 10 мин периодически встряхивая пробирки. Затем центрифугируют суспензию при 12000 g при 4°С в течение 15 мин на центрифуге. При центрифугировании происходит разделение смеси на три фазы: нижнюю органическую фенолхлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. Рибонуклеиновая кислота (РНК) находится в водной фазе. Держа пробирку под углом 45°. аккуратно отбирают водную фазу, избегая касания интерфазы или органической фазы. Перемещают водную фазу в новую пробирку.

Выделение РНК. На этом этапе необходимо соблюдать соответствующие меры безопасности, чтобы избежать загрязнения проб РНКазами. Добавляют в водную фазу 0,5 100%-го изопропанола на каждый 1 реагента, использованного для гомогенизации. Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугируют образец при 12000 g в течение 10 мин при комнатной температуре и тщательно отбирают супернатант, оставив осадок РНК на дне пробирки (осадок может быть невидимым). Аккуратно, по стенке пробирки, добавляют 2 75%-го этанола на каждый 1 изопропанола, использованного ранее, и центрифугируют на максимальной скорости 14000 g в течение 5 мин при комнатной температуре. Удаляют этанол. Высушивают осадок на воздухе в пробирке с открытой крышкой в течении 5-7 мин. Растворяют РНК в необходимом объеме свободной от РНказ воды, перемешивают пипетированием и прогревают при 55-60°С в течение 3 мин для лучшего растворения осадка.

Выделенная РНК может сразу же быть использована. Все дальнейшие работы с препаратом следует вести на льду. Перед длительным использованием препарат рекомендуется распределить на аликвоты и заморозить. Замороженная РНК хранится при температуре -20°С и ниже в течение 1 года.

4. Синтез комплементарной ДНК (кДНК). Синтез первой цепи кДНК выполняют на матрице мРНК с помощью фермента MMLV ревертазы и гексануклеотидов. Готовят смесь следующих компонентов объемом 9 мкл в стерильной пробирке: 1-4 мкл РНК матрицы; 1 мкл Random праймера; 4-7 мкл стерильной воды, свободной от РНКаз. Смесь инкубируют при 70°С в течение 3 мин и охлаждают на льду. Добавляют 11 мкл предварительно подготовленной смеси следующего состава: 2 мкл стерильной воды, свободной от РНКаз; 4 мкл 5х буфер для синтеза первой цепи; 2 мкл смеси дезоксинуклеозида трифосфата (dNTP); 2 мкл дитиотреитола (DTT); 1 мкл MMLV ревертазы.

Инкубируют реакционную смесь в амплификаторе с греющейся крышкой или в сухом термостате 60 мин при 40°С, для остановки реакции прогревают смесь при 70°С в течение 10 мин. Образец первой цепи кДНК может храниться до 3 месяцев при минус 20°С или в течение года при -70°С.

5. Постановка полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию проводят на матрице к ДНК на амплификаторе с помощью Taq-полимеразы, используя dNTP и реакционный буфер. Все составляющие взяты из набора для амплификации ДНК (табл. 1).

Таблица 1

Условия ПЦР амплификации для мутаций I925L и L419V

Этап	Количество циклов	Температура инкубации,	Время, min/sec
I	1	94	05:00
II	45	94	00:20
		60 для I925	00:20
		64 для L419	00:20
		72	00:30
III	1	72	05:00

Состав реакционной смеси: 1 мкл реакционного буфера, 0,8 мкл смеси dNTP, 1 мкл прямого праймера (конечная концентрация в смеси 0,2 мМ), 1 мкл обратного праймера (конечная концентрация в смеси 0,2 мМ), 0,1 мкл Taq-полимеразы, 1 мкл матрицы и вода. Общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл.

Структуры и положение праймеров, а также размеры соответствующих ПЦР-фрагментов представлены в табл. 2. При конструировании праймеров для ПЦР-анализа используют компьютерную программу.

Таблица 2

Праймеры для ПЦР-анализа

	Структура праймеров	Размер ПЦР-фрагмента, н.п.
L419V	Пр. 5'TCCTCCGGTGCTGGACAATGTAAA 3' Обр. 5'CTTCCTCTTCAGCAGCTTCTTC 3'	305
I925L	Пр. 5'TGCCATGAAGTTGATAGCAATG 3' Обр. 5'TCTCCACACAGGACCCTAAAC 3'	403

Агарозный электрофорез. С помощью анализатора гелей визуально оценивают интенсивность свечения полос в 1,2%-м агарозном геле. Окрашивание нуклеиновых кислот производится во время электрофореза путем добавления бромистого этидия в гель.