Приложение 2. Статистическая обработка результатов по оценке вирулицидной активности

Приложение 2
к Р 4.2.3647-20

Статистическая обработка результатов по оценке вирулицидной активности

Определение 50%-й дозы по методу Рида и Менча и по методу Спермана-Кербера.

Титрование вируса в пробирочных культурах предусматривает определение дозы, при которой действие вируса (цитопатогенный эффект) проявляется в 50% тест-объектов (пробирочных культур), которая является тканевой цитопатогенной дозой (далее - или ). Поскольку в большинстве случаев по данным титрования сразу не удается определить 50%-ую дозу, возникает необходимость в статистической обработке результатов. Результаты могут считаться статистически достоверными при соблюдении следующих условий:

- количество тест-объектов, зараженных одним разведением вируса, должно быть не менее 4;

- в титрование должны быть включены два разведения вируса ниже 50%-й дозы и два разведения вируса выше этой дозы.

Среди различных методов подсчета или или наибольшее распространение получили метод полных кумулятивов Рида и Менча и метод определения "центральной величины" Кербера.

1. Метод Рида и Менча*.

Метод подразумевает, что тканевая культура дегенерирует и при заражении любым более низким разведением. Пример подсчета показан в табл. 1.

Таблица 1

Подсчет 50%-й дозы по методу Рида и Менча

Разведение вируса	Количество тест-объектов	Исходные данные		Кумулятивные данные		Процент гибели (в %)
		погибло	выжило	погибло	выжило
	4	4	0	7	0	100
	4	2	2	3	2	60
	4	1	3	1	5	17
	4	0	4	0	9	0

Из табл. 1 видно, что 50%-я доза находится между разведениями вируса и .

Далее расчет величины X, которую необходимо прибавить к разведению непосредственно ниже 50%-й дозы (в ). производится по следующей формуле 1:

, где (1)

А - процент гибели при разведении, непосредственно ниже искомой 50% дозы (в данном случае 60%);

В - процент гибели при разведении непосредственно выше искомой 50% дозы (в данном случае 17%).

Подставляя полученные значения в формулу 1, находим:

откуда титр вируса (в обратных ) равен 6 + 0,23 =6.23; т.е., одна или соответствует разведению вируса .

Если в титрование были взяты разведения вируса с интервалом 0,5 , то величину X в формуле 1 следует умножить на 0,5.

Поскольку при титровании вируса в пробирочных культурах обычно получаются четкие результаты и культуры со 100%-й дегенерацией отделены от культур с полным отсутствием дегенерации всего одним разведением вируса, удобно пользоваться при подсчете титров по Риду и Менчу упрощенной схемой, приведенной в табл. 2.

Таблица 2

Подсчет титров по Риду и Менчу

Количество пробирочных культур, зараженных разведением	Количество культур с ЦПЭ	Процент культур с ЦПЭ	Титр вируса в
4	1	25	(n - 1), 66
4	2	50	n, 0
4	3	75	n, 33
4	4	100	n, 50

Для вычисления вируса в 1 исследуемой жидкости к показателю величины титра вируса в прибавляют, в зависимости от количества вируссодержащего материала, взятого для заражения одной культуры, соответствующие величины поправок (табл. 3).

Например, если во всех пробирочных культурах, зараженных по 0,2 материалом в разведении , наблюдается ЦПД, а в культурах, инокулированных разведением , ЦПД не наблюдается (при инокуляции же разведением ЦПД отмечен в одной из четырех пробирок), то титр вируса в будет равен . Содержание же его в 1 будет равно .

Таблица 3

Вычисление вируса в 1 исследуемой жидкости к показателю величины титра вируса в

Объем материала в миллилитрах, взятого для заражения одной культуры	Величина поправки в единицах логарифма
0,2	0,7
0,25	0,6
0,3	0,52
0,4	0,4
0,5	0,3
0,6	0,22
0,7	0,16
0,8	0,1

2. Определение вируса по методу Спермана-Кербера.

представляет собой отрицательный десятичный логарифм наибольшей использованной концентрации вируса, умноженной на логарифм разведения, т.е. (сумма % пораженных клеток в каждом разведении / 100 - 0,5) x разведения.

Таблица 4

Пример результата титрования по методу Спермана-Кербера

Разведения,	Результаты по ЦПД*	Процент (%) культур с наличием ЦПД
-4	4, 4, 4, 4, 4, 4	100
-5	4, 4, 3, 4, 4, 4	100
-6	4, 4, 3, 3, 0, 0	66,7
-7	4, 2, 0, 0, 0, 0	33,3
-8	0, 0, 0, 0, 0, 0	0
Сумма % с ЦПД		300

Примечание: * - от 1 до 4 - плюсовая система %-го выражения гибели клеточных культур (1+ = 25%, 2+ = 50%, 3+ = 75% и 4+ = 100%), 0 = отсутствие ЦПД.

Формула расчета по этим данным:

-4 - [{(100 + 100 + 66,7 + 33,3 + 0) / 100} - 0,5] х 1 = -4 - [300 / 100 - 0,5] х 1 = -4 - 2,5 = 6,5.

Таким образом, будет равно или 6,5 .

3. Метод бляшек.

Для расчета среднего значения количества бляшек используется следующая формула 2:

, где (2)

t - объем, добавляемый в лунку при каждом шаге разведения;

- число БОЕ во всех лунках наименьшего разведения, при котором возможен учет (уже несливные бляшки);

- число БОЕ во всех лунках следующего разведения;

- число БОЕ во всех лунках последнего разведения;

- количество всех лунок наименьшего разведения с несливными бляшками (соответствует );

- число всех лунок второго разведения с несливными бляшками ;

- фактор разведения между (например, и , то );

- количество всех лунок последнего разведения, при котором имеются бляшки ;

- фактор разведения между и (например, и , то );

d - шаг разведения .

Вычисления проводятся с целыми числами: если последнее число меньше 5, то оно остается неизменным; если оно больше 5, то округляется до следующего целого числа.

Пример:

Если объем, добавляемый при разведении, равен 0,2 , то .

______________________________

* Reed L.J., Muench Н.А. A simple method of estimating 50% endpoints. Am. J. Hyd., 1938, 27, 493-497; Упрощенный вариант по книге Ворошиловой М.К., Жевандеровой В.И., Балаяна М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М., Медицина, 1964. - с. 127-129.