Приложение 3. Приготовление питательных сред

Приложение 3
к Р 4.2.3676-20

Приготовление питательных сред

1. Приготовление пшеничного агара.

В состав среды входят:

- пшеничная крупа 500,0 г;

- агар 25,0 г;

- дистиллированная вода 1000 ;

- рН .

Пшеничную крупу заливают дистиллированной водой. Через 18-24 ч настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 ч). Оставляют в теплом месте до осаждения осадка на 12 ч. Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают рН . Разливают в бутылки, пробирки, матрацы (в зависимости от решаемых задач и целей). Стерилизуют текучим паром в аппарате Коха по 1 ч в течение 3 сут.

2. Приготовление среды Левенштейна-Йенсена.

Среда Левенштейна-Йенсена - международная среда, широко используемая в качестве стандартной для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Это плотная яичная среда, на которой видимый рост М. terrae получают приблизительно на 14-21 день после посева.

Для чистоты эксперимента желательно использовать готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками. При невозможности приобретения готовой среды ее можно приготовить самостоятельно.

В состав среды Левенштейна-Йенсена входят следующие компоненты:

2.1. Раствор минеральных солей:

- калий однозамещенный фосфорнокислый - 2,4 г;

- магний лимоннокислый - 0,6 г;

- магний сернокислый - 0,24 г;

- L-аспарагин - 3,6 г;

- глицерин - 12,0 ;

- вода дистиллированная - 600 .

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогреве (не доводя до кипения) на водяной бане. L-аспарагин рекомендуется растворять отдельно и вносить последним. Затем солевой раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм плюс 121°С в течение 20-30 мин. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

2.2. Раствор малахитового зеленого:

- малахитовый зеленый - 2 г;

- стерильная дистиллированная вода - 100 .

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают полученный раствор в термостат на 1-2,5 ч для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм. плюс 121°С в течение 30 мин. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

2.3. Яичная масса. Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70%-й этиловый спирт на 30 мин. Перед тем как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 (для этого требуется в среднем 20-25 яиц, в зависимости от их величины). Тщательно взбивают яичную массу стерильным венчиком или в стерильном миксере при минимальной скорости.

3. Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают следующие растворы:

- раствор минеральных солей - 600 ;

- гомогенизированная яичная масса - 1000 .

Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через 4-слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20 раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 мин разливают в пробирки приблизительно по 5 , следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Коагуляция (свертывание) среды.

Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели. Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при плюс 85°С в течение 45 мин.

4. Хранение среды.

Готовую питательную среду проверяют на стерильность, помещая 10 пробирок из вновь приготовленной партии в термостат при плюс на трое суток. По истечении времени инкубации в пробирках на питательной среде должен отсутствовать микробный рост. В случае наличия роста приготовленная партия среды подлежит уничтожению. Приготовленная партия среды должна иметь этикетку с датой изготовления и сохраняться в холодильнике при плюс с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.

5. Приготовления среды "Новая".

Среда "Новая" - это плотная яичная среда, на которой хороший рост колоний М. terrae получают приблизительно на 5-7-й день после посева материала (проб).

В рецептуру питательной среды "Новая" входят следующие компоненты (в весовых %):

- калий фосфорнокислый одноосновной - 0,05;

- натрий лимоннокислый - 0,05;

- магний сернокислый - 0,05;

- натрий пировиноградно-кислый (гликокол) - 0,2;

- глицерин - 3,6;

- малахитовая зелень - 0,036;

- желтки яиц - 50,0;

- дистиллированная вода - до 100,0.

Способ получения концентрированной питательной среды заключается в смешивании сухих навесок ингредиентов солей (кроме бактерицидного красителя) с желточной массой, обработке ингредиентов 70%-м этиловым спиртом, растворении бактерицидного красителя в глицерине и соединении всех компонентов среды.

Для получения 1 концентрированной питательной среды необходимо:

- сделать навески однозамещенного фосфорнокислого калия - 1 г, лимоннокислого натрия - 1 г, сернокислого магния - 1 г, натрия пировиноградно-кислого (гликокола) - 4 г и каждую навеску поместить в стерильную фарфоровую ступку;

- обеззаразить навески путем смачивания каждой навески 1 70%-го этилового спирта. Затем поместить ступки с навесками в термостат при температуре плюс и высушить при периодическом помешивании в течение 45 мин;

- приготовить 1 желточной массы. 50 штук куриных яиц обработать снаружи с целью обеззараживания 70%-м спиртом. Затем отделить белок от желтка. Перенести желточную массу в мерную колбу и тщательно гомогенизировать;

- приготовить желточно-солевую смесь. К 1 желточной массы добавить обеззараженные навески и перемешать;

- приготовить раствор бактерицидного красителя. Навеску 700 мг малахитовой зелени смочить 1 70%-го спирта и соединить с 70 глицерина (это соответствует 1%-му раствору малахитового зеленого в глицерине).

6. Получение концентрированной питательной смеси.

Производят соединение 1 желточно-солевой смеси с 70 1%-го раствора малахитового зеленого в глицерине и тщательно гомогенизируют. Полученную концентрированную питательную смесь (среду) выдерживают в течение суток при комнатной температуре и разливают среду во флаконы емкостью 250 , которые герметично упаковывают и маркируют. Укупоренные флаконы с концентрированной питательной средой хранят в холодильнике при плюс 3-5°С в течение 3-4 недель.

7. Приготовление рабочей (используемой при тестировании дезсредств) плотной питательной среды в пробирках.

К концентрированной питательной среде добавляют равный объем стерильной дистиллированной воды (1:1), гомогенизируют, разливают по 5 в пробирки. Для образования скоса питательной среды пробирки укладывают в наклонном положении в свертыватель, предварительно нагретый до плюс 90°С. Среду коагулируют 20 мин при температуре плюс 82-83°С. Контроль приготовленной партии среды на стерильность осуществляют так же, как описано для среды Левенштейна-Йенсена.

8. Хранение пробирок с питательной средой.

Пробирки с питательной средой могут храниться в холодильнике при температуре плюс в течение 4 недель. При длительном хранении необходимо пробирки герметично укупорить и поместить в полиэтиленовые пакеты, чтобы предотвратить высыхание среды.