Методические указания по лабораторным исследованиям на пневмококковую (диплококковую) инфекцию животных (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 5 января 1984 г.)

1. Общие положения

1.1. Пневмококковая (диплококковая) инфекция - заразная болезнь различных видов животных. Наиболее восприимчивы молодые животные, особенно телята и ягнята. У молодняка различают септическую, легочную, суставную и смешанную формы болезни. Для первой характерно острое и сверхострое течение. При хроническом течении развиваются пневмония, бронхопневмония или артриты.

У взрослых животных пневмококковая инфекция проявляется гнойно-катаральным эндометритом, гнойно-катаральным или фибринозным маститом с острым или хроническим течением.

1.2. Возбудитель болезни Streptococcus pneumoniae (синонимы Diplococcus lanceolatus, Dipl. septicus, Dipl. pneumoniae) - грамположительный микроорганизм овальной или ланцетовидной формы, располагающийся попарно или короткими цепочками. В мазках из патологического материала и культур, выращенных на сывороточных средах, возбудитель имеет капсулу.

1.3. Диагноз на пневмококковую инфекцию ставят на основании эпизоотологических, клинических, патолого-анатомических данных и результатов лабораторного исследования.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют кровь сердца, печень, селезенку, головной мозг и трубчатую кость. При подозрении на легочную форму дополнительно направляют кусочки легкого, взятые на границе здоровой и пораженной тканей, средостенные лимфатические узлы, при артритах - синовиальную жидкость. Трупы мелких животных направляют целиком. От животных, больных маститом, направляют секрет пораженных долей вымени, который берут в стерильные пробирки после обработки соска 70°-ным этиловым спиртом, при эндометритах - истечения из половых органов, собранные стерильными тампонами со слизистой влагалища.

Патологический материал должен быть доставлен в лабораторию не позднее 6 ч с момента гибели или убоя животного, при условии хранения и транспортировки его в термосе со льдом при 4-6°С. Более длительное хранение материала приводит к гибели пневмококков. При хранении материала в обычных температурных условиях срок доставки не должен превышать 2-3 ч.

Необходимым условием эффективности бактериологического исследования является взятие материала до лечения животных антибиотиками.

1.5. Лабораторная диагностика пневмококковой инфекции включает микроскопию мазков-отпечатков из патологического материала, выделение культуры возбудителя на питательных средах с последующей ее идентификацией и изучением патогенных свойств.

2. Микроскопическое исследование

2.1. Из патологического материала готовят мазки-отпечатки и окрашивают по Граму и на капсулу по Романовскому - Гимзе или Ольту.

2.2. Обнаружение в мазках грамположительных овальных или ланцетовидных диплококков, окруженных капсулой, позволяет заподозрить пневмококковую инфекцию. Однако микроскопическое исследование имеет только ориентировочное значение.

3. Бактериологическое исследование

3.1. Высевы из патологического материала делают в МПБ с 1% глюкозы и 15-20% нормальной сыворотки крови лошади, инактивированной при 58°С в течение 30 мин, на МПА - с 1% глюкозы и 10% дефибринированной крови барана или кролика (рН сред 7,6-7,8). Посевы инкубируют при 37-38°С в течение 24-48 ч.

3.2. На жидкой питательной среде пневмококки дают легкое равномерное помутнение, в дальнейшем возможно образование осадка.

На глюкозо-кровяном агаре пневмококки образуют мелкие, гладкие, полупрозрачные колонии с приподнятыми краями и центром, окруженные зеленоватой зоной .

3.3. Идентификацию возбудителя проводят на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, гемолитических свойств, а также патогенности для белых мышей.

При микроскопии мазков из культур необходимо учитывать, что в молодых культурах преобладают диплококковые формы, в старых - диплострептококковые.

Для дифференциации пневмонийного стрептококка от других стрептококков изучают следующие свойства: лизис желчью, ферментацию сорбита, маннита и раффинозы (см. схему), чувствительность к оптохину.

Схема дифференциации стрептококков

Наименование микроорганизмов	Дифференциальные тесты
	гемолиз	лизис 10%-ной желчью	чувствительность к оптохину	ферментация
				раффинозы	сорбита	маннита
Str. pneumoniae		+	+	+	-	- (+) некоторые
Str. agalactiae		-	-	-	-	-
Str. dysgalactiae		-	-	-		-
Str. sanguis		-	-	-	-	-
Str. salivarius	, реже	-	-	+	-	-
Str. anginosus	, реже	-	-	+	-	-
Str. mitis		-	-		-	-
Str. bovis	, редко	-	-	+	+	+
Str. faecalis	, редко	-	-	-	+	+
Str. faecium		-	-
Str. thermophilus		-	-		-	-
Str. uberis	или	-	-	-	+	+
Str. lactis	или	-	-	-	-
Str. cremoris	или	-	-		-

3.3.1. Определение лизиса культуры желчью. В две пробирки с глюкозо-сывороточным бульоном, в одну из которых добавлено 10% желчи крупного рогатого скота (вторая контрольная - без добавления желчи), вносят по 0,5-0,7 мл суточной бульонной культуры и выдерживают при 37°С в течение часа. В случае лизиса культуры содержимое пробирки с желчью просветляется. При получении нечетких результатов пробирки оставляют при комнатной температуре на 18-20 ч, после чего окончательно учитывают результат.

Для определения чувствительности к желчи могут быть использованы диски из фильтровальной бумаги, пропитанные 20%-ным раствором желчи в физиологическом растворе. Диски накладывают на суточную культуру, выросшую на глюкозо-кровяном агаре. Чашки с посевами инкубируют 1-2 ч при 37-38°С. Результаты учитывают по наличию или отсутствию зоны лизиса размером 1-2 мм вокруг диска.

Культуры пневмококков лизируются желчью.

3.3.2. Ферментативные свойства выделенных культур проверяют на средах Гисса с раффинозой, сорбитом и маннитом. В пробирки с указанными средами вносят по 0,5-0,7 мл суточной бульонной культуры и выдерживают в термостате при 37-38°С в течение 5 сут.

Пневмококки ферментируют раффинозу с образованием кислоты без газа и не сбраживают сорбит и маннит.

3.3.3. Определение чувствительности к оптохину. Исследуемую культуру засевают на глюкозо-кровяной агар, содержащий оптохин в концентрации 1:50 000, и инкубируют при 37-38°С в течение 20-24 ч.

Существует модификация этого теста. Диски из фильтровальной бумаги, содержащие 6 мкг оптохина, накладывают на поверхность глюкозо-кровяного агара, засеянного исследуемой культурой. Посевы инкубируют, как указано выше. Учет результатов проводят по наличию или отсутствию зоны задержки культуры вокруг диска.

Пневмококки не растут на среде с оптохином.

3.3.4. При отсутствии оптохина тест с желчью в совокупности с типичными для пневмококков культуральными, морфологическими и ферментативными свойствами позволяет идентифицировать эти микроорганизмы.

4. Патогенные свойства пневмококков определяют на трех белых мышах массой 14-16 г.

Подопытных животных заражают внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл свежевыделенной суточной культурой пневмококков, выращенной на глюкозо-сывороточном бульоне.

Для постановки биопробы может быть использован патологический материал. Из материала (лучше из селезенки и печени) готовят на физиологическом растворе суспензию 1:2, которую после отстаивания вводят трем белым мышам по 0,5 мл внутрибрюшинно.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 6 дн. Мыши чаще погибают через 1-2 сут.

Биопробу признают положительной при гибели не менее двух белых мышей и выделении из них пневмококков.

5. Лабораторный диагноз на пневмококковую инфекцию считают установленным при получении одного из следующих показателей:

выделение из патологического материала культуры пневмококков, патогенной для белых мышей;

гибель зараженных лабораторных животных и выделение из органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя пневмококковой инфекции, если даже в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено.

Срок исследования - до 8 дн.