Методические рекомендации МР 4.2.0161-19 "Методы индикации биологических плёнок микроорганизмов на абиотических объектах" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 23 декабря 2019 г.)

Методические рекомендации МР 4.2.0161-19
"Методы индикации биологических плёнок микроорганизмов на абиотических объектах"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 23 декабря 2019 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют методы санитарно-бактериологических исследований по идентификации бактерий, в том числе в состоянии биологических плёнок, на абиотических поверхностях в медицинских организациях и на предприятиях по производству пищевой продукции.

1.2. Биологические плёнки являются одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных процессов. На сегодняшний день достоверно установлена роль биоплёнок при большинстве случаев всех хронических и/или рецидивирующих инфекций. Биоплёнки с высокой устойчивостью к антибиотикам и другим противомикробным препаратам являются причиной более 65% случаев инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП, HAIs), которые, по данным зарубежных центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC и ECDC, соответственно), ежегодно поражают более 6 миллионов человек. Биоплёнки участвуют в развитии 80% всех микробных инфекций в организме, в том числе связанных с медицинскими устройствами, такими как катетеры, эндотрахеальные трубки, протезы суставов и клапанов сердца. Биоплёнки значительно задерживают заживление ран и снижают эффективность антимикробной терапии инфицированных кожных ран, участвуют в развитии инфекций среднего уха, кариеса, гингивита, простатита и т.д.

В окружающей среде бактерии обнаруживаются в двух формах существования:

- свободное движение или планктонное состояние;

- состояние прикрепления к какой-либо поверхности, при котором они образуют микробные ассоциации, сообщества или так называемые биологические плёнки (биоплёнки, biofilms).

Большинство популяций бактерий (более 95%) существует в прикрепленном состоянии и образуют биопленки на различных поверхностях, как биотических, так и абиотических, в природе и в организме различных хозяев.

Выделяют пять стадий развития биоплёнки:

- первичное прикрепление микроорганизмов к поверхности (адгезия, адсорбция) из окружающей среды (обычно жидкости, стадия обратима);

- окончательное (необратимое) прикрепление (фиксация, на этой стадии бактерии выделяют внеклеточные полимеры, обеспечивающие прочную адгезию);

- созревание - клетки, прикрепившиеся к поверхности, облегчают прикрепление последующих клеток, внеклеточный матрикс удерживает вместе всю колонию (на этой стадии накапливаются питательные вещества, клетки начинают делиться);

- рост - на этой стадии образована зрелая биоплёнка, которая изменяет свой размер и форму (внеклеточный матрикс служит защитой клеток от внешних угроз);

- дисперсия (распространение бактерий, на этой стадии в результате деления периодически от биопленки отрываются отдельные клетки, способные через некоторое время прикрепиться к поверхности и образовать новую колонию).

Планктонные бактерии присоединяются друг к другу и к поверхностям в течение нескольких минут. Соединенные микроколонии образуются в течение 2-4 часов. В течение 6-12 часов клетки вырабатывают внеклеточные полисахариды, и биоплёнка становится толерантной к антибактериальным средствам. Зрелые биоплёнки, резистентные к биоцидам, образуются в течение 24-48-72 часов, в зависимости от видов бактерий и условий роста. Биоплёнки быстро восстанавливаются после механического разрушения и вновь формируют зрелую форму в течение 8-12-24 часов. Дисперсия планктонных клеток из зрелых биоплёнок происходит по достижении максимальной зрелости микроколоний (более 72 часов).

Биологические плёнки способствуют формированию устойчивости бактерий к неблагоприятным факторам окружающей среды, включая воздействие антибактериальных препаратов, образуя экзополисахаридный матрикс (далее - ЭПМ), обладающий защитными (протективными) функциями. При наличии биопленок на поверхностях возможно получение ложноотрицательных результатов при проведении санитарно-бактериологических исследований (смывов), т.к. зрелый ЭМП препятствует механическому переносу бактерий на диагностические питательные среды. Разрушение ЭПМ позволяет проводить высокоэффективные смывы, исключая вероятность ложноотрицательного результата.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, проводящих санитарно-эпидемиологические экспертизы, исследования и иные виды оценок, а также для аккредитованных лабораторий, проводящих отбор проб, исследования и контроль за санитарно-гигиеническим состоянием и микробиологическими показателями в медицинских организациях и на предприятиях по производству пищевой продукции.

1.4. Объектами санитарно-бактериологических исследований являются поверхности объектов окружающей среды медицинских организаций (в операционных блоках, хирургических, послеоперационных палатах и отделениях, палатах и отделениях реанимации и интенсивной терапии, перевязочных и процедурных кабинетах и других подразделениях) и изделия медицинского назначения (включая эндоскопическое оборудование, зонды, катетеры, бужи и прочее), а также объекты производственной среды пищевых производств (смывы с технологического оборудования, тары, инвентаря, стен, полов, одежды и т.д.).

1.5. При проведении исследований используются питательные среды, расходные материалы и средства, перечисленные в приложении 1 к настоящим МР, либо аналогичные или с лучшими характеристиками.

1.6. В медицинских организациях бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов окружающей среды осуществляется в соответствии с методическими указаниями*.

1.7. На предприятиях по производству пищевой продукции перечень микроорганизмов, подлежащих контролю (общее количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), стафилококки, бактерии группы кишечных палочек, клостридии, бактерии родов Salmonella, Proteus, Listeria, Campylobacter и др.), определяется в соответствии со стандартами**.

II. Методы и этапы индикации биологических плёнок

2.1. К методам и этапам индикации биологических плёнок относятся:

- визуальная индикация мест локализации биоплёнок с помощью каталазного экспресс-теста (первый этап);

Примечание. Каталазный экспресс-тест применяется для экспресс-индикации мест возможного биологического загрязнения, в том числе для определения мест последующего применения ферментного теста.

- визуальная индикация мест локализации биоплёнок с помощью флуорохромных красителей и дальнейшей визуализации их при помощи специального освещения (второй этап);

Примечание. Флуорохромный экспресс-тест является вспомогательным и не обязательным для исполнения. Данный экспресс-тест может применяться, в том числе, для проверки качества текущих и генеральных уборок.

- разрушение экзополисахаридного матрикса биоплёнки специальными ферментными индикаторами с последующим отбором и микробиологическим исследованием проб смывов (третий этап).

Примечание. Ферментный тест является базовым для обнаружения бактерий в состоянии биоплёнки.

Этапность и очередность тестов не является обязательной. Тесты применяются в зависимости от конкретных поставленных задач.

2.2. Каталазный экспресс-тест обнаружения бактериальной контаминации абиотических поверхностей, в том числе в состоянии биоплёнок, основан на реакции индикатора на основе пероксида водорода с каталазой - ферментом системы антиоксидантной защиты бактериальной клетки.

Реакция основана на ферментативном разрушении перекиси водорода до кислорода и воды.

Наличие незначительного количества каталазонегативных штаммов бактерий не влияет на чистоту проведения каталазного экспресс-теста, поскольку биоплёнка, как правило, имеет поливидовой состав.

Чувствительность каталазного экспресс-теста, при условии соблюдения всех рецептурных характеристик индикатора, - от кл./мл бактерий.

Каталазный индикатор (в соответствии с п. 8 приложения 1) наносят на очищенную и продезинфицированную исследуемую поверхность, не допуская взбалтывания, в соответствии с инструкцией производителя (порядка 2,0-3,0 мл на 5 поверхности) распылением с расстояния от 10 до 15 см.

При положительной реакции в течение 5-30 секунд после нанесения индикатора начинается процесс барботирования (образования микропузырьков при реакции выделения кислорода), что является подтверждением наличия каталазоположительных форм бактерий, в том числе в состоянии биологической плёнки, на исследуемой поверхности.

Примечание. При проведении исследования на эндоскопах индикатор не должен быть густым, раствор индикатора должен свободно проникать в каналы эндоскопа.

При исследовании эндоскопа дистальный подвижный конец опускается в раствор индикатора, а в исследуемый инструментальный канал эндоскопа индикатор заливается принудительно, в объеме, достаточном для возникновения реакции (обычно 150-200 мл на эндоскоп).

2.3. Экспресс-тест с флуорохромным красителем применяется для обнаружения структур ЭПМ биологических пленок методом окрашивания их флуорохромным красителем (в виде раствора на основе флуорохромного красителя Нильский красный (Nill red) согласно пункту 9 приложения 1) и дальнейшей визуализации при помощи специального освещения.

Индикатор избирательно связывается с липидами и липополисаха-ридами ЭПМ биологических плёнок грамположительных и грамотрицательных бактерий. Детекция ЭПМ биологических плёнок проводится методом визуализации свечения флуорохромного красителя, после отмыва водой, в темноте, в проходящем зелёном свете. Визуализация производится в специальных очках красно-оранжевого фильтра.

Степень свечения зависит от зрелости матрикса биоплёнки и от количества липидов и липополисахаридов ЭПМ.

Примечание. Данный экспресс-тест не применяется для индикации биопленок на поверхности и в каналах эндоскопов.

Флуорохромный индикатор наносится на обрабатываемую поверхность в количестве 3-5 мл распылением с расстояния от 10 до 15 см.

Через 5-10 секунд после нанесения индикатора обработанную поверхность промывают дистиллированной водой, без применения механических методов обработки поверхности.

Положительная реакция визуализируется в специальных защитных очках с красно-оранжевым фильтром согласно ГОСТ Р 12.4.230.1 (ЕН 166) в проходящем зеленом свете фонарика.

Отрицательная реакция заключается в отсутствии свечения (или флуоресценции) красителя, что указывает на отсутствие загрязнения на исследуемых поверхностях.

Примечание. Индикатор необходимо наносить только на очищенные и продезинфицированные поверхности.

2.4. Ферментный тест, включающий применение ферментных индикаторов перед проведением бактериологических смывов, позволяет провести разрушение структур ЭПМ, в результате чего бактериальные клетки освобождаются от защитного барьера и могут быть уничтожены, удалены или идентифицированы в ходе последующих процедур.

Ферментный индикатор согласно пункту 10 приложения 1 представляет собой стерильный раствор, основным действующим веществом которого является смесь специальных энзимов из группы карбогидраз в рабочем растворе, содержащем функциональные и технологические компоненты, увеличивающие эффективность раствора и обладающие бактерицидным, фунгицидным и бактерицидным действием (катионные ПАВ, растворители и стабилизаторы активности).

Ферментный индикатор применяют методом протирания или локального распыления на поверхности перед проведением отбора проб смывов. Метод распыления применяют при обработке небольших по площади или труднодоступных поверхностей. Индикатор в виде раствора или в виде пены (при наличии специальной насадки на триггере-распылителе) наносится на поверхности в достаточном количестве (порядка 5 мл на 10 ) с расстояния 10-15 см. После нанесения индикатора на поверхность время экспозиции составляет 10 минут.

При обработке эндоскопов ферментный индикатор наносится на места смывов с поверхностей или вносится в каналы эндоскопа в количестве не менее 150 мл. Время экспозиции после обработки ферментным индикатором составляет 10 минут.

2.5. Отбор проб для проведения микробиологических исследований осуществляют методом смывов с чистых поверхностей различных объектов и проводят после обязательного проведения процедур, указанных в пункте 2.4. Рекомендуется предварительно определить места проведения ферментного теста и отбора проб смывов путем применения каталазного теста в соответствии с пунктом 2.2. После отбора проб поверхности (объекты) подвергают промывке водопроводной водой либо обработке в соответствии с требованиями, установленными для конкретных изделий (в частности, для медицинских изделий - предстерилизационной очистке, дезинфекции высокого уровня или стерилизации).

III. Порядок отбора проб смывов

3.1. Отбор проб смывов с объектов больничной среды и производственной среды предприятий по производству пищевой продукции осуществляется при следующих условиях:

- при отборе смывов с поверхности необходимо использовать тампон (губку, ткань, салфетку), увлажненный нейтрализатором ферментного индикатора (пункт 11 приложения 1 к настоящим МР) и/или нейтрализатором соответствующего дезинфицирующего средства в случае отбора смывов после дезинфекции, либо пептонной водой (пункт 1 приложения 1 к настоящим МР) - в остальных случаях;

- смывы с площади меньше или равной 10х10 см (100 ) отбирают стерильным тампоном с хлопком или синтетическим материалом;

- при отборе смывов с площади более 100 следует использовать губку, ткань, салфетку;

- смывы с мелких объектов (поверхность которых менее 100 ) берут со всей поверхности;

- если при взятии смывов с ровной поверхности используются металлические рамки-трафареты, ограничивающие площадь взятия смывов, то такие рамки-трафареты должны быть стерильными;

- смывы с перчаток берут только с наружной стороны ладонной поверхности перчатки;

- смывы с санитарной одежды отбирают с помощью тампонов с четырех участков, каждый из которых должен быть не менее 25 , а именно нижняя часть каждого рукава и две площадки с верхней и средней частей передних пол одежды;

- для отбора проб с труднодоступных небольших участков рекомендуется использовать тампоны.

3.2. При определении объектов, которые подлежат санитарно-бактериологическим исследованиям на выявление биоплёнок, основное внимание необходимо уделять объектам, которые имеют постоянный и периодический контакт с жидкостями и органическими веществами, которые могут быть использованы бактериями в качестве питательных веществ.

Труднодоступные места, такие как отверстия или щели в волокнистом, пористом, трудно моющемся оборудовании, пустотелые материалы, являются потенциальными участками для отбора проб на наличие биоплёнок. Для отбора проб в труднодоступных и недоступных местах необходима разборка оборудования. Выбор места отбора проб должен определяться в соответствии с поэтапной проверкой технологической цепи (процесса).

3.3. Ориентировочные места отбора проб в медицинских организациях и на предприятиях по производству пищевой продукции указаны в приложении 2 к настоящим МР.

3.4. Санитарно-бактериологические исследования по обнаружению биоплёнок на абиотических поверхностях в медицинских организациях необходимо проводить:

- в порядке, определенном программой производственного контроля организации, в том числе в эндоскопических отделениях и кабинетах (включая поверхности и каналы эндоскопов);

- по эпидемиологическим показаниям;

- при оценке чувствительности госпитальной микрофлоры к дезинфицирующим средствам в соответствии с методическими указаниями***.

3.5. Санитарно-бактериологические исследования по обнаружению биоплёнок на абиотических поверхностях на предприятиях по производству пищевой продукции необходимо проводить в порядке, определенном программой производственного контроля организации (после проведения генеральных уборок), и по эпидемиологическим показаниям.

IV. Порядок исследования проб смывов

4.1. Для обнаружения стафилококков делают посев 0,2-0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл 6,5% солевого бульона. Засеянные культурой пробирки инкубируют при 37°С в течение ч, после чего делают посев на желточно-солевые среды или другие питательные среды, разрешенные к применению в установленном порядке.

4.2. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек делают посев 0,2-0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл среды Кесслера по пункту 17 приложения 1 к настоящим МР. После посева пробирки инкубируют при 37°С в течение ч и делают пересев на среду Эндо по пункту 2.21 приложения 1 к настоящим МР. Колонии, выросшие на среде Эндо, подвергают дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным энтеробактериям.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "пункту 2.21 приложения 1" имеется в виду "пункту 21 приложения 1"

4.3. Для обнаружения сальмонелл делают посев 0,2-0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл одной из сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппопорта-Вассилиадиса). Засеянные пробирки инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч, делают пересев на среду Эндо (по пункту 21 приложения 1 к настоящим МР) и агар висмут-сульфитный (по пункту 18 приложения 1 к настоящим МР) с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

4.4. Для обнаружения синегнойной палочки делают посев на среду N 8 по пункту 19 приложения 1 к настоящим МР (бульон для накопления стафилококков и синегнойной палочки) и среду N 9 по пункту 20 приложения 1 к настоящим МР (для определения синегнойной палочки по наличию пигмента пиоцианина) или другие питательные среды, разрешенные к применению в установленном порядке.

______________________________

* Пункт 3.2.1 МУК 4.2.2942-II "Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях" (далее - МУК 4.2.2942-11).

** ГОСТ 31746; ГОСТ 31747; ГОСТ 10444.15; ГОСТ 31659; ГОСТ 28560; ГОСТ 29185; ГОСТ 32031; ГОСТ ISO 10272-1.

*** МУ 3.5.1.3439-17 "Оценка чувствительности к дезинфицирующим средствам микроорганизмов, циркулирующих в медицинских организациях".

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

3. СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

4. СП 3.1.7.2616-10 "Профилактика сальмонеллеза".

5. СП 3.1.7.2817-10 "Профилактика листериоза у людей".

6. СП 3.1.7.2816-10 "Профилактика кампилобактериоза среди людей".

7. СП 2.3.6.1079-01 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям общественного питания, изготовлению и оборотоспособности в них пищевых продуктов и продовольственного сырья".

8. МУК 4.2.2942-11 "Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях".

9. МУ 3.5.1.3439-17 "Оценка чувствительности к дезинфицирующим средствам микроорганизмов, циркулирующих в медицинских организациях".

10. Методические указания по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами, утвержденные Минздравом СССР 31.12.1982 N 2657.

11. Порядок санитарно-микробиологического контроля при производстве мяса и мясных продуктов, утвержденный Минсельхозпродом России 15.12.1995.

12. Инструкция о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания, утверждена Госкомсанэпиднадзором России 01.01.1994.

13. ГОСТ 31659 (ISO 6579) "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella".

14. ГОСТ 32031 "Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes".

15. ГОСТ 31746 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus".

16. ГОСТ 28560 "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia".

17. ГОСТ 31747 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)".

18. ГОСТ ISO 10272-1 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 1. Метод обнаружения".

19. Тец В.В. Клеточные сообщества. СПб., 1998. 15-73 с. [Tetz V.V. Cell community. Spb. 1998. 15-73 p.]

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

21. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок. 2010 г. Т.А. Смирнова, Л.B. Диденко, P.P. Азизбекян, Ю.М. Романова. Микробиология, 2010, Т. 79, N 4, с. 435-446.

22. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg Е.Р. Bacterial biofilm: a common cause of persistent infections//Science. 1999. V. 284. P. 318-322.

23. Pintucci J.P., Corno S., Garotta M. Biofilms and infections of the upper respiratory tract. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2010; 14:683-90.

24. Aslam S., Darouiche R.O. Role of antibiofilm-antimicrobial agents in controlling device-related infections. Int J Artif Organs 2010; 34:752-8.

25. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilm: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284:318-322.

26. Biofilm life cycle. Montana State University Center for Biofilm Engineering. Available at URL: http://www.biofilm.montana.edu

27. George O'Toole, Heidi B. Kaplan and Roberto Kolter. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 2000; 54:49-79.

28. Bester, E. et al. Metabolic differentiation in biofilms as indicated by carbon dioxide production rates/E. Bester [et al.] Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76(4):1189-1197.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова