Методика микологического исследования и оценки спермы, применяемой при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 2 января 1978 г.)

1. В сперме, используемой для искусственного осеменения животных, не допускается содержание патогенных грибов.

1.1. Сперму, содержащую грибы Aspergillus fumigatus, Absidia corimbifera, Absidia ramosa, Candida albicans, Candida tropicalis, бракуют, не прибегая к определению их патогенных свойств.

1.2. Оценку спермы при наличии в ней грибов Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Mucor pusillus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rnizopus cohnii, Candida stellatoidea, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida parakrusei, Candida guilliermondi, Candida parapsilosis проводят после предварительного определения их патогенных свойств на лабораторных животных. В случае установления их патогенности сперму следует считать непригодной для искусственного осеменения.

2. Исследованию подлежит цельная, разбавленная и замороженно-оттаянная сперма. Замороженную сперму оттаивают в стерильных условиях с соблюдением ветеринарных правил при воспроизводстве сельскохозяйственных животных.

Микологическое исследование проводят по следующей схеме: первичное выделение грибов, идентификация их и, в случае обнаружения грибов, указанных в п. 1.2., определение их патогенных свойств.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

3.1. При посеве цельной спермы ее предварительно разбавляют стерильной водой или стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:10 и высевают по 0,5 мл на 2 чашки с питательной средой. Разбавленную и сохраненную сперму высевают без предварительного разбавления, или разбавляют в зависимости от дозы расфасованной спермы, 1:1 - 1:4 и высевают также на 2 чашки по 0,5 мл.

3.2. Для первичного выделения грибов сперму высевают на сусло-агар с рН 6,0-6,8. При отсутствии сусло-агара сперму высевают одновременно и на среду Чапека и агар Сабуро. Вместе с тем выделение грибов можно проводить при посеве спермы на 2% МПА с 1% глюкозы при одновременном определении общего количества микробных тел в 1 мл.

3.3. Для подавления сопутствующей микрофлоры, в питательные среды, используемые для первичного выделения грибов, после стерилизации можно добавлять антибиотики - пенициллина - 50 ЕД и стрептомицина - 100 ЕД на 1 мл среды, имеющей температуру около 46°.

3.4. При посеве спермы проводят контроль зараженности грибами воздуха в боксе, для чего чашку со средой оставляют открытой в течение 3-х минут.

3.5. Культивирование посевов проводят при температуре в течение 8 дней. Рост большинства грибов становится заметным через трое суток.

4. Идентификация грибов

4.1. Родовую (а иногда и видовую) принадлежность грибов устанавливают в первичном посеве. При росте грибов, относящихся к роду aspergillus, семейству Мuсоrасеа и роду Candida, их выделяют в чистые культуры для дальнейшей идентификации (установления вида) и, при необходимости, определения патогенных свойств. При этом для каждой из указанных групп применяют специальные питательные среды.

4.2. Для пересева пользуются иглой, длиной не менее 5 см, загнутой под тупым углом и вставленной в иглодержатель. Бактериологические петли можно применять только при работе с дрожжеподобными грибами. При пересеве для выделения чистых культуры используют 2 метода:

4.2.1. Метод непосредственного пересева применяют в том случае, если в первичном посеве выросли изолированные колонии, а также при поддержании культуры. Пересевают маленький кусочек мицелия или часть колонии, помещая их на поверхность питательной среды. При этом следует избегать комкания, скручивания и деформаций взятого кусочка мицелия.

При наличии обильного спороношения (например, у Aspergillus) иглой лишь касаются поверхности колонии и переносят минимальное количество спор. Посевы штрихом при работе с грибами обычно не применяют. Допускается только легкое касание в одном месте поверхности среды.

4.2.2. Метод разделения применяют в тех случаях, если колонии загрязнены другими грибами. С этой целью делают 3-4 последовательных разведений взвеси спор гриба и высевают из 1-2 последних разведений в количестве 1 мл на поверхность агара в чашку Петри.

Изучение культурально-морфологических свойств

4.3. Для изучения культурально-морфологических свойств грибы из рода Aspergillus высевают на агаризированную среду Чапека; из семейства Mucoraceae - на сусло-агар; из рода Candida - высевают одновременно на несколько сред: сусло-агар или агар Литмана, культивируя последний при 37°. Для дифференциации Candida от истинных дрожжей высевают на среду Городковой.

Способность отдельных видов Candida образовывать хломидоспоры изучают на кукурузном агаре, культивируя посевы при комнатной температуре в течение 24-48 часов. В этом случае петлей с культурой делают на среде разрез длиной 0,5 см и глубиной 2-3 см, место посева накрывают покровным стеклом, через которое при малом увеличении микроскопа рассматривают колонию и устанавливают наличие хламидоспор.

При идентификации видов Candida учитывают также их биохимическую активность - способность сбраживать сахара, для чего делают посев на пептонную воду с углеводами.

На среде Пагано-Левин-Трейо виды Candida идентифицируют по цвету колоний.

После окончания культивирования проводят макро- и микроскопическое исследование.

4.4. При макроскопическом определении признаков грибов рассматривают колонии на месте их роста, учитывают цвет, форму, консистенцию колонии, характер роста, форму растущего края, наличие или отсутствие пигмента, цвет его, степень развития воздушного мицелия.

4.5. Микроскопическое исследование проводят после приготовления препарата. Для изучения Aspergillus и Mucoraceae частицы мицелия, взятые иглой из разных частей колонии - на старых (ближе к центру) и молодых (у края), помещают на предметное стекло в каплю жидкости, состоящей из равных частей воды, спирта и глицерина, осторожно снимают их другой иглой, накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала при малом увеличении микроскопа (обх8х10), затем при большом (обх40).

Примечание: при работе с культурами необходимо строго соблюдать правила асептики для предупреждения загрязнения воздуха помещения спорами изучаемых грибов, особенно аспергиллов

Дрожжеподобные грибы - Candida исследуют в капле физиологического раствора, водно-спиртового или 50%-ного раствора глицерина, равномерно распределяя небольшое количество материала.

4.6. Культурально-морфологические свойства грибов отдельных видов.

4.6.1. Род Aspergillus (кл. Fungi imperfecti, пор. Moniliales).

Мицелий у видов рода Aspergillus бесцветный или светлоокрашенный, с перегородками, у некоторых видов (A. flavus, A. niger) образует шаровидные склероции из толстостенных клеток. Цвет колонии определяется массой конидий, развивающихся на конидиеносцах. Конидиеносцы на концах имеют вздутие (верхушечный пузырь) различной формы, на поверхности которого располагаются цилиндрические клетки-стеригмы в один или два яруса, несущие цепочки конидий. Вздутие конидиеносца, стеригмы и цепочки конидий составляют головку аспергилла. Головка называется радиальной в случае, если стеригмы расположены радиально на поверхности всего вздутия и цепочки конидий радиально расходящиеся. Нерадиальная головка имеет прижатые кверху стеригмы, направленные параллельно оси конидиеносца, и сближенные в плотную колонку цепочки конидий.

A. fumigatus. Колонии широко разрастающиеся, бархатистые, редко пушисто-войлочные от развития воздушного мицелия, сначала голубовато-зеленые, затем зеленые, с возрастом темнеющие. Обратная сторона колонии бесцветная или окрашена в желто-коричневые тона. Конидиеносцы гладкие, короткие, до 300 длиной и 5-8 толщиной, часто более или менее зеленые. Головки нерадиальные - в верхней части колбообразного вздутия до 20-30 в диаметре развиваются одноярусные стеригмы 6-8 (длина) х 2-3 (толщина), расположенные не строго параллельно оси конидиеносца. Конидии шиповатые, округлые, обычно 2,5-З в диаметре, цепочки их склеены в колонку.

A. flavus. Колонии широко разрастающиеся, зеленые, часто с оттенком желтой, лимонной окраски, с возрастом обычно темно-желто-зеленые; на обратной стороне бесцветные, или розовато-тускло-желтоватые. Многие штаммы образуют склероции, хорошо видимые невооруженным глазом в виде шаровидных твердых образований, сначала белые, затем коричневые. Конидиеносцы 400-1000х5-15 , с бесцветной шероховатой оболочкой, образуют на верхушке у молодых культур продолговатые, позже полукруглые или круглые вздутия 10-40 в диаметре. Головки радиальные. Стеригмы или одноярусные 10-15x3-5 (главным образом на маленьких вздутиях) или двухъярусные (на больших вздутиях), в последнем случае стеригмы I яруса 7-10x3-4 , II - 7-10x2,5-3,5 . Конидии яйцевидные или шаровидные, 3-6 в диаметре, от бесцветных до желто-зеленых, иногда почти гладкие, но большей частью с шероховатой оболочкой.

A. niger. Колонии быстро растущие, бурые, черновато-коричневые или угольно-черные, на обратной стороне бесцветные или желтоватые, иногда образуют твердые белые, с возрастом становящиеся коричневыми, склероции. Конидиеносцы 200-400x7-10 , иногда значительно крупнее, с толстостенной гладкой оболочкой, обычно желтые, а ближе к вершине коричневые. Головки радиальные, крупные. Вздутие шаровидное, 20-50 , иногда до 100 в диаметре, стеригмы одно- и двухъярусные. Стеригмы первого яруса 10-15x6-8 , тесно скученные, второго яруса 6-10x2-3 , более или менее коричневые или почти черные. Конидии иногда гладкие, но чаще шероховатые или шиповатые, коричневые или бурые.

A. terreus. Колонии широко разрастающиеся, бархатистые, плоские, гладкие, или с неглубокими радиальными бороздами, орехово-бурые, на обратной стороне палевые, желтые или темно-бурые. Конидиеносцы более или менее извилистые, гладкие, бесцветные, 50-150-(250)х 5-8 , у вершины с полушаровидным вздутием 10-16 в диаметре. Головки нерадиальные. Стеригмы двухъярусные. Стеригмы первого яруса 7-9x2-2,5 , второго яруса 5-7x2-2,5 , Конидии шаровидные или слегка эллиптические, гладкие, 2,5x2,2 , в цепочках, соединенных в длинную колонку.

A. versicolor. Колонии медленно растущие, компактные, у некоторых штаммов бархатистые, у других пушистые или же штамм имеет тот и другой признак; вначале белые, затем приобретают желтые оттенки, оранжево-желтые, дымчато-зеленые или телесного цвета; зеленые тона могут отсутствовать. Обратная сторона и субстрат от желтого и оранжевого цвета до розового, пурпурно-красного или красного. Конидиеносцы 500-700x5-10 , с гладкой бесцветной оболочкой.

Головки радиальные. Вздутие бутыльчатое или почти шаровидное, 12-20 в диаметре, в верхней, большей своей части, образует радиально расположенные двухъярусные стеригмы - отеригмы первого яруса 3-10x3-5 , второго яруса 5-10x1,5-2 . Конидии шаровидные, обычно слегка шероховатые, 2,5-3 в диаметре, в свободно расходящихся цепочках.

A. nidulans. Колонии широко разрастающиеся, гладкие, бархатистые, темно-зеленые или желтовато-зеленые на обратной стороне пурпурно-красные, красно-коричневые, или с возрастом темно-коричневые. Конидиеносцы более или менее извилистые, гладкие, с коричневой оболочкой, 50-100(200)x3-5 . Головки нерадиальные. Вздутие куполовидное, 7-15 в диаметре; двухъярусные стеригмы покрывают верхнюю часть вздутия, направлены параллельно оси конидиеносца, стеригмы первого яруса 5-8x2-3 , второго 5-6x2-2,5 . Конидии шаровидные, 3-3,5 в диаметре, гладкие или шероховатые, в массе зеленые, в цепочках, склеенных в колонки.

Помимо конидиального A. nidulans имеет сумчатое спороношение, возникшее в результате полового процесса, и представленное сумками с аскоспорами, развивающимися внутри плодовых тел - клейстотециев (клейстокарпиев). Клейстотеции шаровидные, 100-200 в диаметре, хорошо различимы невооруженным глазом вначале в центре колонии, затем и по ее периферии, имеют желтоватую или коричневую окраску за счет окружающих их покровных клеток, образованных конечными клетками вегетативных гиф, шаровидных до 25 в диаметре, с очень толстой оболочкой до 4-5 . Стенка клейстотециев тонкая, красноватая. Сумки, заполняющие клейстотеции, многочисленные, состоят из 8 аскоспор. Аскоспоры чечевицеобразные, пурпурно-красные, гладкие, с двумя экваториальными гребешковидными образованиями, 3,8-4,5x3,5-4 .

4.6.2. Семейство Mucoraceae - мукоровые грибы (класс Phycomycetes, пор. Mucorales). Мицелий хорошо развит, представлен одиночными, разветвленными гифами с далеко отстоящими друг от друга поперечными перегородками или, чаще, без перегородок, главным образом поверхностный. Иногда мицелий прикрепляется к субстрату с помощью корешекообразных разветвленных выростов-ризоидов. В этом случае он часто развивается в виде дугообразно изогнутых воздушных гиф - столонов. Некоторые виды образуют хламидоспоры - клетки с утолщенной оболочкой, одиночные или собранные цепочкой, могут возникать на протяжении гиф (интеркалярные) или на их концах (терминальные).

Бесполое воспроизведение мукоровых грибов эндогенное. Органы бесполого размножения представлены спорангиями, развивающимися на концах простых или разветвленных спорангиеносцев и содержащими многочисленные одноклеточные спорангиоспоры. Характерным образованием внутри спорангии является колонка (столбик) шаровидной, грушевидной и др. формы. У некоторых видов спорангиеносец у основания спорангия расширяется в апофизу. Оболочка спорангия или полностью растворяется в воде, или сохраняется у основания колонки в виде воротничка.

Половой процесс происходит путем соединения двух специальных клеток (гаметангиев) и образования зигоспоры.

Семейство Mucoraceae объединяет 12 родов, среди них Mucor, Rhizopus, Absidia.

Род Mucor

Спорангиеносцы простые или разветвленные (моноподиально, симподиально, мутовчато), неокрашенные или бледноокрашенные, отходят одиночно от гиф мицелия. Спорангии шаровидные, без апофизы; оболочка растворяется в воде или разрывается и остается у основания колонки в виде воротничка. Столбик различной формы. Ризоиды и столоны обычно отсутствуют.

M. racemosus. Колонии быстрорастущие, без воздушного вегетативного мицелия, пушистые, 0,8-1,5 см высоты, трудно смачиваемые водой, легко разрывающиеся при незначительном прикосновении. Спорангиеносцы отходят от субстрата, кистевидноразветвленные, до 1,5 см длины и 8-20 толщины. Спорангии шаровидные, 40-100-(140) в диаметре, вначале желтоватые, затем темно-коричневые, просвечивающие. Колонка коричневатая или темно-коричневая, обратно-грушевидная, иногда эллиптически-шаровидная, 20-60-(70) х 15-50-(60) . Споры эллиптически-шаровидные, эллиптические, (4)-5-8-(12) х 4-6-(8) или шаровидные (4)-5-8-(20) в диаметре, бесцветные, в массе бледно-сероватые. Имеются многочисленные хламидоспоры 10-20 х 10-15 , одиночные или в коротких цепочках. Ризоиды и столоны отсутствуют.

М. pusillus. Колонии быстрорастущие, 0,2-0,4 см высоты, обычно без воздушного вегетативного мицелия, бархатистые, вначале темно-серые, затем коричневато или рыжевато-темно-серые, с обратной стороны коричневатые. Имеются немногочисленные простые или слабо разветвленные, большей частью неокрашенные ризоиды. Столоны слабо выраженные, также немногочисленные. Споронгиеносцы прямостоящие, отходят от субстрата, прямые, до 0,4 см высоты, 10-25 в диаметре, с (1)2-5(7) короткими веточками в верхней части. Спорангии шаровидные, 20-70(80) в диаметре, вначале неокрашенные, затем серые или свинцово-серые. Колонка яйцевидная или обратно-грушевидная, 20-50 х 20-45 , коричневато- или серовато-металлического цвета. Споры шаровидные, гладкие, (2,5)-3,5-4,5 (5) в диаметре.

Род Rhizopus.

Колонии с развитым воздушным мицелием в виде дугообразно изогнутых столонов, прикрепляющихся к субстрату с помощью ризоидов. Спорангиеносцы темноокрашенные, простые или, реже, разветвленные, отходят пучком по 1-5-(7) от шейки ризоида (т.е. в месте прикрепления столона к субстрату), от столонов или являются продолжением последних. Столоны и ризоиды светлоокрашенные. Спорангии шаровидные или приплюснутые, бурые, черно- или серо-бурые. Колонка светлоокрашенная, от шаровидной до цилиндрической или обратно-грушевидной формы, с воронковидной или блюдцевидной окрашенной апофизой. Споры шаровидные, эллиптические или неправильной формы, часто угловатые и продольноисчерченные. У большинства видов имеются хламидоспоры.

R. nigricans

Колонии быстрорастущие войлочные и рыхловойлочные 1-1,5 см высоты, вначале оливково-зеленые или оливково-темно-зеленые, затем оливково- или буровато-серые, обычно наползающие на боковые стенки и крышку чашки Петри.

Столоны хорошо выражены. Розоиды темно-коричневые, разветвленные, хорошо развитые. Спорангиеносцы обычно прямые, неразветвленные, бурые или темно-бурые, 500-3000-(4000) х10-35 ; отходят пучком по 2-3-5, реже I от шейки ризоида. Спорангии (50)-80-250(350) в диаметре, черноватые. Колонка шаровидная или приплюснуто-шаровидная, крупная - (40)-50-120-(150) в диаметре, бледно-бурая. Апофиза блюдцевидная. Споры эллиптически-шаровидные или неправильной формы, сильно угловатые, с продольной исчерченностью, серые или бледно-коричневато-серые, 4-12-(16)х4-10-(12) . Хломидоспоры отсутствуют.

R. cohnii

Колонии быстрорастущие, рыхловойлочные или пушисто-рыхло-войлочные, со слабо или хорошо развитым воздушным вегетативным мицелием, 0,2-0,6-(1) см высоты, сначала серые или темно-серые, затем становятся свинцово- или синевато-темно-серыми.

Ризоиды слабо выражены, неразветвленные или коротко и слабо разветвленные, коричневатые. Столоны слабо выраженные. Спорангиеносцы темно-коричневые или бледно-буроватые, простые или с раздвоенной или мутовчато разветвленной верхушкой, отходят по 1-3-(5) от шейки ризоида или столоновидных гиф; длина их 75-500-(700) , толщина (6)-10-20 . Спорангии 40-120-(140) в диаметре. Колонка чаще эллиптически-цилиндрическая или обратногрушевидная, 20-70-(100) х 20-60-(80) , вначале синевато-серая, затем коричневатая. Апофиза блюдцевидная. Споры шаровидные, гладкие, бледно-голубоватые, в массе синевато-черные, 4-6-(7) в диаметре. Имеются довольно многочисленные хламидоспоры.

Род Absidia

Колонии с развитым воздушным мицелием, обычно пушистые и светлоокрашенные. Ризоиды обычно имеются, неокрашенные, простые (стержневидные) или разветвленные, столоны выражены в различной степени. Спорангиеносцы простые или с 1-2-(3) боковыми веточками, отходят мутовкой или одиночно большей частью от вершины дуги столона. Спорангии (без учета апофизы) шаровидные или слегка яйцевидные, мелкие. Колонка полушаровидная, короткоконическая, реже сосочковидная; гладкая или с коническим выступом, булавовидным придатком или с зубчиками; иногда впячивается в полость апофизы. Апофиза воронковидная, реже бокаловидная, придает спорангию обратногрушевидную форму. Споры мелкие, различной формы. Могут иметь хламидоспоры и жировые клетки - крупные шаровидные или другой формы клетки, обычно наполненные каплями жира.

A. corymbifera

Колонии пушистые, превышают 0,3 см высоты, вначале неокрашенные или бледно-пепельного цвета, затем становящиеся пепельными или пепельными с бледно-зеленоватым оттенком, обратная сторона часто желтая или золотисто-желтая. Столоны слабо выраженные. Спорангиеносцы отходят одиночно от столоновидных гиф или являются продолжением последних, до 400-(600) длины. Апофиза воронковидная. Споры гладкие, эллиптически-шаровидные и эллиптические, 3,5-6-(7) х 3,5-5,5-(6,5) . В субстрате и над субстратом образуются жировые клетки различной формы, чаще крестообразные или неправильношаровидные, до 150-(200) в диаметре, бледно-серые или неокрашенные. Хламидоспоры отсутствуют.

A. ramosa

Колонии пушистые или войлочно-пушистые, 0,7-1,5 см высоты, вначале неокрашенные или бледно-серые, затем становящиеся серыми, синевато-серыми, оливково-серыми, иногда с желтоватой или золотисто-желтоватой обратной стороной. Столоны слабо выраженные, неокрашенные или бледно-оливковые. Ризоиды разветвленные. Спорангиеносцы отходят одиночно от столоновидных гиф или являются продолжением последних; прямые или слегка изогнутые, (6)-100-400-(600) х 4-10-(14) ; неразветвленные или с мутовкой веточек до 200 длины ниже верхушечного спорангия. Спорангии шаровидные (без учета апофизы) или слегка яйцевидные, 10-80-(120) в диаметре, серые или темно-серые. Колонка полушаровидная, эллиптически-шаровидная, иногда слегка коническая, 10-50-(60) х 6-40(50) , буровато-серая или коричневатая, гладкая или реже 1-3-(5) мелкими зубчиками, иногда впячивается в полость апофизы. Апофиза воронковидная, темно-серая или буровато-серая. Споры неокрашенные, короткоцилиндрические, более или менее усеченные на концах, или эллиптически-цилиндрические, 3,5-6-(8)х2-4-(5) . Жировые клетки немногочисленные, образуются в субстрате, шаровидные или неправильношаровидные, до 100 в диаметре. Хламидоспоры отсутствуют.

4.6.3. Род Candida - дрожжеподобные грибы, лишенные полового процесса размножения (сумки с аскороспорами не развиваются), большинством систематиков относятся к классу несовершенных грибов. Появление в первичном посеве гладких, круглых, белых или кремовых, матовых или блестящих сметанообразных колоний, врастающих в субстрат, может свидетельствовать о росте Candida. Грибы этого рода представлены дрожжевидными клетками, размножающимися почками (бластоспорами).

Для Candida характерно образование псевдомицелия, отличающегося от истинного мицелия отсутствием перегородок по ходу гифы и тем, что длинные дрожжевые клетки соприкасаются друг с другом узкими основаниями, образуя перетяжки. Псевдомицелий образует бластоспоры на концах или по бокам нитей на перетяжках, в последнем случае бластоспоры образуют скопления - вертициллы. Бластоспоры, сидящие непосредственно на нити псевдомицелия, называются псевдоконидиями. Два вида (С. albicans С. stellatoidea образуют хламидоспоры - клетки округлой формы и крупнее бластоспор, с плотными (часто двойными) оболочками, и зернистой плазмой. (смотри приложение N 1 и приложение N 2)

5. Определение патогенных свойств грибов

5.1. Приготовление материала для заражения.

Выращенную на агаровой среде культуру гриба смывают стерильным физиологическим раствором. Смыв центрифугируют в градуированных пробирках при 1000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливают, осадок разводят до 1 мл стерильным физиологическим раствором. Количество клеток гриба в суспензии подсчитывают в счетной камере Горяева (на 1 , т.е. на 1 мл). Для приготовления взвеси с плотностью, которая необходима для заражения подопытных животных, пользуются методом последовательного разведения.

Для приготовления споровой суспензии Aspergillus fumigatus желательно добавлять небольшое количество (1-2 капли) твина-80 (эфир олеиновой кислоты и сорбита).

5.2. Для заражения следует брать не менее 2-х кроликов, 6-ти мышей. Суспензию грибов соответствующего разведения вводят кроликам внутривенно в количестве 1 мл и белым мышам внутрибрюшинно в количестве 0,5 мл. За животными ведут наблюдение.

Заболевание в зависимости от вирулентности гриба развивается обычно на второй-четвертый день, при этом наблюдается угнетение, повышенная температура, парезы, параличи.

Если по истечении 10 дней животные не погибают, то, независимо от наличия или отсутствия клинических признаков заболевания, их убивают и подвергают патолого-анатомическому вскрытию.

Патогенность грибов устанавливают на основании обнаружения на вскрытии характерных патолого-анатомических изменений во внутренних органах (гранулем); по результатам микроскопического исследования гранулем и обнаружения в них элементов гриба; на основании выделения чистой культуры гриба; в некоторых случаях проводят гистологическое исследование гранулем.

5.3. Определение патогенности Aspergillus и Mucoreceae

Патогенность определяют на кроликах. Для заражения используют 1 мл суспензии, содержащей около 1 млн спор, приготовленной из 6-8-дневной культуры. При изучении мукоровых грибов можно пользоваться суспензией, содержащей большее число спор, а также частицы гиф мицелия.

Смерть животного обычно наступает на 4-5 день, иногда значительно позднее. Если в течение 10 дней животное не погибает, его убивают. При патолого-анатомическом вскрытии наиболее тяжелые поражения обнаруживают в легких и почках. Легкие гиперимированы, отечные, с хорошо заметными, особенно на разрезе, множественными серовато-беловатыми небольшими узелками (гранулемами). Почки увеличены, бугристые, гранулемы обычно хорошо заметны.

5.4. Определение патогенности Candida

Для заражения кроликов используют 1 мл суспензии, содержащей 300-500 тысяч клеток, полученной из 24-48-часовой культуры.

На вскрытии обнаруживают поражения прежде всего почек в виде множественных серовато-белых гранулем в корковом слое, а также печени, селезенки, сердца. Если зараженные кролики не гибнут через 10 дней, их убивают и при обнаружении гранулем в почках штамм определяют как слабовирулентный. Гибель у животных такие штаммы могут вызывать лишь на 20-30 день после заражения.

Для определения патогенности Candida можно использовать внутрибрюшинные введения 20-дневным белым мышам той же суспензии в количестве 0,5 мл. При вскрытии обнаруживается гранулематозное поражение в почках, печени, селезенке, легких.

6. Среды для культивирования грибов.

6.1. Сусловый агар

Неохмеленное пивное сусло (промежуточный продукт производства пива), содержащее 12-14% сахаров, фильтруют через тонкий слой ваты или 3-4 слоя марли, разбавляют водой (1:2 или 1:3) до 3-7° по ареометру Баллинга, затем добавляют 2% агар-агара и стерилизуют в автоклаве, Рн среды - 6,0-6,8.

Сусловый агар, как и другие среды, содержащие сахара, стерилизуют при температуре 110-112° (0,5 атм. по показанию манометра) в течение 10-20 мин. При более высоком давлении или большей продолжительности автоклавирования происходит карамелизация сахаров.

6.2. Среда Чапека с агаром.

Сахарозы	30,0 г
натрия азотнокислого	3,0 г
калия фосфорнокислого одноосновного	1,0 г
калия хлористого	0,5 г
магния сернокислого	0,5 г
железа сернокислого	0,01 г
агар-агара	15-20 г
воды дистиллированной	1000,0 мл

6.3. Среда Городковой

Мясного бульона	10 мл
пептона	10,0 г
хлористого натрия	5,0 г
глюкозы	25,0 г
агар-агара	15,0 г
воды дистиллированной	до 1000,0 мл
Стерилизуют 20 мин при 0,5 атм.

6.4. Кукурузный агар

Кукурузной муки	40,0 г
агар-агара	20,0 г
воды дистиллированной	1000,0 мл

Для приготовления среды кукурузную муку вносят в 500 мл воды, выдерживают при 65° в течение 1 часа, после чего настой фильтруют через бумажный фильтр. Агар-агар растворяют отдельно в 500 мл воды при кипячении, затем обе части смешивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют 15 минут при 1 атм.

6.5. Пептонная вода с углеводами.

В дистиллированную воду вносят 1% пептона, 0,5% поваренной соли и несколько капель 0,05%-ного раствора бромтимолового синего. Синяя окраска индикатора при Рн 7,6 переходит в желтую при Рн 6,0 и ниже. Для растворения бромтимолового синего можно использовать 20%-ный этанол или дистиллированную воду с добавлением 3,2 мл 0,05-нормального раствора едкого натра на 100 мг индикатора.

Среду разливают в пробирки, предварительно поместив в них стеклянные "поплавки", в количестве 4,5 мл. Стерилизуют 15-20 мин при 0,5 атм.

Концентрированные растворы сахаров (20%) стерилизуют фильтрацией через асбестовый фильтр и добавляют по 0,5 мл к стерильной пептонной воде, так чтобы конечная концентрация углевода в пробирке было равна 2%.

6.6. Среда Сабуро.

Глюкозы	40,0 г
пептона	10,0 г
воды дистиллированной	1000,0 мл

Вместо глюкозы можно использовать мальтозу или декстрозу в том же количестве. Стерилизуют 15 мин при 1 атм. Для приготовления агаризированной среды добавляют 18 г агар-агара.

6.7. Среда Пагано-Левин-Трейо.

Пептона	10,0 г
дрожжевого экстракта	1,0 г
глюкозы	40,0 г
агар-агара	15,0 г
2,3,5-трифенилтетразолхлорида	1,0 г
воды дистиллированной	1000,0 мл

Стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20-40 мин Рн - 6,0-6,2

6.8. Кровяной агар.

мясного экстракта	10,0 г
пептона	10,0 г
хлористого натрия	5,0 г
агар-агара	15,0 г
воды дистиллированной	1000,0 мл

Стерилизуют при 1 атм. 15 мин, Рн - 5,0

6.9. Серин-сульфитная среда.

маннита	2,0 г
серина	1,0 г
сульфата аммония	1,0 г
сульфита натрия	0,5 г
агар-агара	2,0 г
картофельного отвара	100 мл

Стерилизует при 0,5 атм. 15-20 мин.

Для приготовления отвара 100 г очищенного и измельченного картофеля заливают 500 мл воды и кипятят 15 минут. Затем отвар процеживают через 2-3 слоя марли и стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Перед употреблением отвар осторожно сливают с осадка и фильтруют через бумажный фильтр.

6.10. 2%-ный МПА с 1% глюкозы.

мясопептонного бульона	1000 мл
агар-агара	20 г
глюкозы	10 г

Рн-7-7,2. Среду стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. - 30 мин. Перед стерилизацией агар желательно профильтровать.

Старший научный сотрудник ВНИИВС

Л.С. Малиновская

Схема
дифференциальной диагностики видов рода Candida по культурально-морфологическим признакам

Наименование вида	Сусловый агар	Кровяной агар	Среда Пагано-Левин-Трейо с агаром	Кукурузный агар
1	2	3	4	5
Цвет и морфология колоний				Микроскопическое строение
C. albicans*	белые, кремовые, мягкие, гладкие, блестящие с ровными краями, глубоко врастают в субстрат, 2-3 см в диаметре	тускло-серый рост по всей поверхности среды	кремовые до слабо-розовых	Псевдомицелий хорошо развит, бластоспоры; хламидоспоры крупные, круглые, двухконтурные, находятся на боковых и концевых в точках по краям колонии
C. tropicalis*	серо-белые, круглые зубчатыми краями, матовые, слабо врастают в субстрат, 3,5-4,5 см в диаметре.	обильные, серые, окруженные мицелиальной бахромой	темно-красные	псевдомицелий хорошо развит, ветвистый, бластоспор и псевдоконидии обильные, хламидоспоры отсутствуют
С. pseudotropicalis	серые, матовые, сметанообразной консистенции, слегка приподнятые, 2-3,5 см в диаметре	мелкие, не характерные	розовые	Псевдомицелий слабо развит, бластоспор мало, хломидоспоры отсутствуют
C. ksrusei	белые или серые, гладкие, суховатые, матовые плоские, с неровными выямчатыми краями; врастание в глубь среды отсутствует	мелкие, различной формы, плоские или высокие	белые	Псевдомицелий хорошо развит, бластоспоры удлиненные, хламидоспоры отсутствуют
C. parakrusei	белые с гладкими краями и поверхностной исчерченностью по перифирии, выпуклые; врастание в глубь среды отсутствует; 2-3 см в диаметре	мелкие, зеленовато-белые	бледно-розовые	Псевдомицелий хорошо развит, бластоспор мало, хламидоспоры отсутствуют
C. stellatoidea	Белые, желтоватые, мягкие, сметанообразные, складчатые (звездчатые), борозды довольно глубокие	звездчатой формы	бледно-красные	Псевдомицелий хорошо развит, большие шарообразные бластоспоры, хламидоспоры обильные
С. guilliermondi	белые, плоские, влажные, гладкие, с короткими отпрысками в субстрат	тускло-серый рост по всей поверхности среды	темно-красные	Псевдомицелий умеренно развит, бластоспоры мелкие, хламидоспоры отсутствуют
C. parapsilosis	белые, кремовые до желтоватых, блестящие, мягкие гладкие (иногда слабо складчатые) колонии с ровными краями	-	-	Псевдомицелий хорошо развит, тонкий и ветвистый, бластоспоры

Примечание: * Для дифференциации С. albicans и C. tropicalis от других дрожжеподобных грибов можно применить серин-сульфитную среду, на которой указанные виды, в отличие от остальных, образуют обильный псевдомицелий. Посев проводят штрихом с врезанием в агар. Посевы выдерживают при температуре 37° 5 суток.

Схема дифференциальной диагностики видов рода Candida по биохимической активности

Наименование вида	глюкоза	фруктоза	галактоза	манноза	сахароза	лактоза	левулеза	мальтоза	рафиноза	лакмусовое молоко
С. albicans	кислота-газ	-	кислота-газ	-	-	-	кислота-газ	кислота-газ	-	-
C. tropicalis	кислота-газ	-	кислота-газ		кислота-газ	-	кислота-газ	кислота-газ	-	-
С. pseudotropicalis	кислота-газ	-	-	-	-	кислота-газ	кислота-газ	-	кислота-газ	кислота-газ
C. krusei	кислота-газ	-	-	-	-	-	-	-	-	-
C. parakrusei	кислота-газ	-	-	-	-	-	-	-	-	-
C. stellatoidea*	кислота-газ	-	-	-	-	-	-	кислота-газ	-	-
C. guilliermondi**	кислота-слабо	-	-	-	кислота-газ	-	-	-	-	-

______________________________

* - иногда ферментирует глюкозу только с образованием кислоты

** - часто биохимически совсем неактивен; кислоту и газ на глюкозе и сахарозе образует через 20 дней культивирования при температуре 25°.

Начальник Главного управления ветеринарии МСХ СССР

А.Д. Третьяков