Методические указания МУК 4.1.2344-08 "Определение остаточных количеств клокуинтоцет-мексила в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 29 февраля 2008 г.)

Методические указания МУК 4.1.2344-08
"Определение остаточных количеств клокуинтоцет-мексила в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 29 февраля 2008 г.)

Дата введения: 18 мая 2008 г.
Введены впервые

1. Вводная часть

Действующее вещество: клокуинтоцет-мексил.

Структурная формула:

1-метилгексил(5-хлорохинолин-8-илокси)ацетат (IUPAC).

Мол. масса: 335,8.

Брутто формула: .

Химически чистый клокуинтоцет-мексил представляет бесцветные кристаллы с температурой плавления 69,4°C, давлением паров мПа (25°C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода (25°C).

Растворимость (г/л): в воде - 0,00059, этаноле - 190, ацетоне - 340, толуоле - 360, н-гексане - 0.14, н-октаноле - 11 (25°C).

Стабилен в кислых и нейтральных средах, гидролизуется в щелочных средах. (25°C) 133,7 дня (pH 7).

Группа токсичности по ВОЗ - III. Острая пероральная токсичность для крыс и мышей >2000 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс >2000 мг/кг. Не ирритант для глаз и кожи (кролики). Ингаляционная токсичность (4 часа) для крыс - более 935 . Не токсичен для пчел.

Клокуинтоцет-мексил ускоряет процесс детоксикации некоторых гербицидов в хлебных злаках, повышает устойчивость к ним урожая. Используется в комбинации с этими гербицидами в качестве антидота.

Гигиенические нормативы для клокуинтоцет-мексила в России не установлены.

2. Методика определения клокуинтоцет-мексила в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств клокуинтоцет-мексила в воде водоемов в диапазоне концентраций 0.002-0.02 мг/кг, в почве - 0.01-0.1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - 0.01-0.1 мг/кг и в соломе - 0.04-0.4 мг/кг.

Методика основана на определении клокуинтоцет-мексила методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов гексаном или водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (граница относительной погрешности), , %	Стандартное отклонение повторяемости, , %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Вода	0.002-0.02	100-50	7.5	21.0	19.2
Почва	0.01-0.1	50	8.6	24.1	22.2
Зерно	0.01-0.1	50	7.1	20.0	21.0
Солома	0.04-0.4	50-25	6.5	18.2	18.0

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения клокуинтоцет-мексила, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0.95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, , %
Вода	0.002	0.002-0.02	82.6	6.6	5.9
Почва	0.01	0.01-0.1	81.9	7.0	6.3
Зерно	0.01	0.01-0.1	80.7	7.1	6.5
Солома	0.04	0.04-0.4	81.7	6.5	5.8

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения клокуинтоцет-мексила достигается условиями подготовки проб и хроматографирования.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, х.ч., ГОСТ 6552-80; 2М и 0.01М водные растворы.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Клокуинтоцет-мексил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,7% (Cheminova).

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0.01М (50:50, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0.040-0.063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (85:15, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Аналитическая колонка Nova-Pac Phenyl (150х3.9) мм, 4 мкм (Waters).

Предколонка Nova-Pac Phenyl (Waters).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

pH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 , ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 , ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 , ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25x1) см.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 ацетона 10 г и 2 г ). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Nova-Pac Phenyl) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 2М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98% (или 225 г 87%) кристаллической помещают в мерную колбу объемом 1 , растворяют в 600 дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Для приготовления 0.01М раствора ортофосфорной кислоты 5,0 2М раствора вносят в мерную колбу на 1 и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 смешивают 500 ацетона с 500 дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.01М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 смешивают 850 н-гексана и 150 этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 смешивают 500 н-гексана и 500 этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску клокуинтоцет-мексила (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 , растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 ). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 и 2.0 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - 0.01М ортофосфорная кислота (50:50, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения клокуинтоцет-мексила используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0.2, 2.0 и 10.0 готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация клокуинтоцет-мексила в растворе) в хроматограф вводят по 50 градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клокуинтоцет-мексила в градуировочном растворе .

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 элюента N 2 и 50 элюента N 1 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения клокуинтоцет-мексила на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 отбирают 0,1 стандартного раствора клокуинтоцет-мексила с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40°C), остаток растворяют в 5 элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 30 элюента N 1, затем 70 элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 каждая, выпаривают, остаток растворяют в 1 подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание клокуинтоцет-мексила по п. 2.6.6.

Фракции, содержащие клокуинтоцет-мексил, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.6. Рассчитывают содержание клокуинтоцет-мексила в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания клокуинтоцет-мексила и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение клокуинтоцет-мексила в пробах воды

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 помещают в делительную воронку емкостью 250 и экстрагируют трижды гексаном порциями по 50 , встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2-3 мин и собирая верхний органический слой. Объединенный гексановый раствор пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°C. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с силикагелем по пункту 2.6.5.

Сухой остаток растворяют в 2 подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Извлечение клокуинтоцет-мексила из проб почвы

Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 с притертой пробкой, добавляют 100 50%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин в ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (70-75 ) на роторном испарителе при температуре не выше 40°C. Доводят объем экстракта до 100 дистиллированной водой. При необходимости (наличие взвеси) раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента".

Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

2.6.3. Извлечение клокуинтоцет-мексила из проб зерна и соломы зерновых колосовых культур

Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 20 г или измельченной на ножевой мельнице соломы массой 5 г помещают в коническую колбу емкостью 250 и экстрагируют клокуинтоцет-мексил 50 смеси ацетон-вода (1:1, по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 50 , выдерживая в ультразвуковой ванне каждый раз в течение 15 мин. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40°C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 100 дистиллированной водой. При необходимости (наличие взвеси) раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

2.6.4. Очистка экстрактов

Полученные по пп. 2.6.2 и 2.6.3 водные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 и экстрагируют трижды гексаном порциями по 50 , встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2-3 мин и собирая верхний органический слой.* Гексановые экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г). Осушитель промывают 10-15 гексана, который также объединяют с экстрактом. После этого гексан выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.5. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по пп. 2.6.4 экстрактов, количественно переносят двумя порциями по 5 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 элюента N 1, которые отбрасывают. Клокуинтоцет-мексил элюируют 70 элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 . Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°C. Сухой остаток растворяют в 2 подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.6. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный. Рабочая длина волны 245 нм. Аналитическая колонка Nova-Pac Phenyl (150x3,9) мм, 4 мкм (Waters). Предколонка Nova-Pac Phenyl (Waters) для защиты аналитической колонки. Температура колонки .

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,01 М раствор в соотношении 50:50 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Время удерживания клокуинтоцет-мексила: мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание клокуинтоцет-мексила в образцах воды, почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

,

где - площадь пика клокуинтоцет-мексила в стандартном растворе, мм;

- площадь пика клокуинтоцет-мексила в анализируемой пробе, мм;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

P - навеска анализируемого образца, г;

C - концентрация стандартного раствора клокуинтоцет-мексила, .

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клокуинтоцет-мексила 2 , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

(1)

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

, мг/кг, при вероятности P = 0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0.005 мг/кг*, где * - 0.005 мг/кг - предел обнаружения).

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

,

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

,

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где , X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, (3)

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

8. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

9. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Юзихин О.С.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

______________________________

* В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии промывки экстрактов гексаном небольшое количество (до 10 ) этилового спирта.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко