Методические указания МУ 2.3.2.3687-21 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов животного происхождения, включая рыб и птицу" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 12 февраля 2021 г.)

Методические указания МУ 2.3.2.3687-21
"Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов животного происхождения, включая рыб и птицу"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 12 февраля 2021 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) устанавливают порядок проведения оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов животного происхождения, включая рыб и птицу (далее - ГМО животного происхождения), предназначенных для производства продовольственного сырья и пищевых продуктов.

1.2. Порядок оценки безопасности, изложенный в настоящих МУ, применяется на этапе государственной регистрации ГМО животного происхождения, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.

1.3. МУ разработаны с целью обеспечения единой, научно обоснованной системы оценки безопасности ГМО животного происхождения, и учитывают новые методические подходы, как используемые в Российской Федерации, так и рекомендованные международными организациями.

II. Характеристика исследуемого ГМО животного происхождения

2.1. Общая характеристика ГМО животного происхождения содержит следующую информацию:

- позволяющую идентифицировать ГМО животного происхождения (вид, порода/линия, трансформационное событие, характеристика отличий от немодифицированного организма);

- об исходном организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения, данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);

- об организмах - донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования);

- о методах генетической модификации и способах получения ГМО животного происхождения (описание метода модификации, структуры векторов, структуры вставок);

- о ГМО животного происхождения (описание свойств, приобретенных организмами в результате модификаций, описание структур встроенных генетических конструкций и мест их локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза организма, экспрессия в структурных компонентах организма и др.);

- о генетической и фенотипической стабильности, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО животного происхождения.

III. Проведение оценки безопасности ГМО животного происхождения

3.1. Оценка безопасности ГМО животного происхождения проводится в соответствии с пунктами 3.1.1-3.1.5 и включает в себя следующие этапы:

- экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем, содержащих результаты ветеринарного освидетельствования ГМО животного происхождения; оценка композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога (содержание нутриентов, витаминов, минеральных веществ в аналогичных органах и тканях); результаты токсикологических, аллергологических и других исследований; результаты пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах;

- экспертную оценку методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения;

- медико-генетическую оценку ГМО животного происхождения;

- оценку функционально-технологических свойств ГМО животного происхождения;

- медико-биологическую оценку безопасности ГМО животного происхождения;

- подтверждение соответствия показателей качества и безопасности ГМО животного происхождения (содержание токсичных элементов, радионуклидов, и др.) требованиям технических регламентов Евразийского экономического союза (Таможенного Союза)*;

- формирование заключения о результатах оценки безопасности ГМО животного происхождения, оформленное в виде отчета о научно-исследовательской работе.

3.2. Для проведения исследований, предусмотренных разделами 3.1.1-3.1.5 настоящих МУ, заявитель представляет образцы ГМО животного происхождения и их традиционных аналогов в количестве, достаточном для выполнения полного объема исследований.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

3.1.1. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих ГМО животного происхождения

3.1.1.1. Анализ результатов ветеринарного освидетельствования ГМО животного происхождения (выполненного на репрезентативной выборке ГМО обоего пола, содержавшихся в условиях, полностью удовлетворяющих физиологические потребности соответствующего вида организмов, включавшего результаты наблюдения за общим состоянием, поведением, скоростью роста на протяжении всего исследования с периодичностью, используемой в стандартной практике для соответствующего вида организмов, результаты обследований, выполненных в соответствии со стандартной ветеринарной практикой для соответствующего вида организмов - клинические осмотры, лабораторные исследования крови (гематологические и биохимические), мочи, кала, инструментальные исследования (ЭКГ, УЗИ внутренних органов, рентгенография и др.), оценку репродуктивной функции - подтверждение возможности размножения ГМО, и др.).

3.1.1.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании информации о результатах сравнения химического состава ГМО животного происхождения с химическим составом его традиционного аналога, представленной заявителем (содержание белка; аминокислотный состав; содержание жира; жирнокислотный состав; содержание углеводов; макро- и микроэлементов; биологически активных веществ; аллергенов, характерных для исходного вида/породы/линии; содержание антропогенных и природных контаминантов - токсичных элементов, пестицидов, радионуклидов, антибиотиков и др.; содержание антинутриентов и других веществ, характерных для организмов исходного вида/породы/линии).

Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого организма.

Оценка композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для организмов данного вида, и справочных данных о химическом составе исходного вида (породы, линии).

В случае если целью генетической модификации является изменение метаболизма, этот фактор необходимо учитывать при оценке композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога.

3.1.1.3. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки безопасности белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО животного происхождения (молекулярная и биохимическая характеристика белков; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании международных баз данных, содержащих информацию о белках**); изучение стабильности белков при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и рН, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белков к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белков в эксперименте на грызунах и др.);

- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстрорастущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.) в случае, если такие исследования проводились;

- результаты других токсикологических исследований.

3.1.1.4. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки аллергенных свойств белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО животного происхождения (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белков в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием иммуноглобулинов Е, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина и др.); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в том числе in vivo);

- результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО животного происхождения с набором аллергенов его традиционного аналога и др.) в случае, если такие исследования проводились;

- результаты других аллергологических исследований.

3.1.1.5. Анализ результатов других исследований, включая результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.

3.1.1.6. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга, осуществляемого в странах, где ГМО животного происхождения был зарегистрирован ранее, проводится в случае, если в процессе мониторинга были получены данные о незаданных эффектах генетической модификации.

3.1.1.7. Анализ научных данных о ГМО животного происхождения, представленных в научной литературе за весь период его использования.

3.1.2. Методы обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения в пищевых продуктах

3.1.2.1. Основным методом, используемым для обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения, является полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР) и ее модификации. Также для обнаружения ГМО животного происхождения в пищевых продуктах и продовольственном сырье, не подвергавшихся технологической переработке, могут быть использованы иммунологические методы детекции специфичных для ГМО белков.

3.1.2.2. Экспертная оценка методов идентификации ГМО животного происхождения направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО животного происхождения и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО животного происхождения.

3.1.2.3. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий (событие - специфичные тест-системы);

- метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий (событие - специфичные тест-системы);

- протоколы проведения анализов;

- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;

- стандартные образцы состава и свойств.

3.1.3. Медико-генетическая оценка ГМО животного происхождения

3.1.3.1. Медико-генетическая оценка ГМО животного происхождения включает проверку присутствия всех заявленных генетических конструкций методом ПЦР.

3.1.3.2. Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- описание молекулярной структуры всех заявленных генетических конструкций (нуклеотидная последовательность);

- метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;

- протокол проведения анализа;

- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;

- стандартные образцы состава и свойств.

3.1.3.3. Заключение о результатах медико-генетической оценки ГМО животного происхождения оформляется в виде отчета о научно-исследовательской работе, включающего основные сведения, на основании которых можно судить о присутствии всех заявленных генетических конструкций.

3.1.4. Оценка функционально-технологических характеристик ГМО животного происхождения

3.1.4.1. Исследования проводятся на основании сравнения функционально-технологических характеристик ГМО животного происхождения и его традиционного аналога.

3.1.4.2. Изучаемые функционально-технологические характеристики (в соответствии со стандартами на конкретный вид исследуемых продуктов):

- сравнительная органолептическая оценка;

- сравнительная оценка структурно-механических характеристик исследуемого продукта и/или его отдельных фракций;

- сравнительная оценка физико-химических характеристик исследуемого продукта и/или его отдельных фракций.

3.1.4.3. Заключение о результатах исследований оформляется в виде отчета о научно-исследовательской работе, включающего основные сведения, на основании которых можно судить о функционально-технологических характеристиках ГМО животного происхождения в сравнении с традиционным аналогом.

3.1.5. Медико-биологическая оценка безопасности ГМО животного происхождения

3.1.5.1. Исследования проводятся на основании сравнения ГМО животного происхождения с его традиционным аналогом по следующим параметрам: гигиеническая характеристика, токсикологические, генотоксикологические, аллергологические свойства, влияние на репродуктивную функцию и развитие потомства.

Наиболее предпочтительный материал для исследований определяется в зависимости от вида ГМО (животное, птица, рыба) - мясо, молоко, субпродукты, яйца, икра и т.п. При выборе материала следует учитывать, во-первых, соотношение содержания белка, определяющего проявление заданного признака, к общему содержанию белка в материале, во-вторых, предполагаемую частоту использования в рационе человека, в-третьих, степень технологической обработки, традиционно используемой для данного пищевого продукта.

3.1.5.2. Гигиеническая характеристика ГМО животного происхождения включает определение показателей качества и безопасности. Перечень показателей безопасности формируется на основании требований технических регламентов Евразийского экономического союза (Таможенного Союза)*.

Изучаемые показатели:

- содержание токсичных элементов;

- содержание пестицидов;

- содержание диоксинов;

- содержание гистамина;

- содержание нитрозаминов (сумма N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина);

- содержание полихлорированных бифенилов;

- содержание ветеринарных (зоотехнических) препаратов, стимуляторов роста животных (в том числе гормональных препаратов);

- содержание антимикробных средств;

- содержание антипротозойных средств;

- содержание остатков инсектицидов;

- содержание радионуклидов;

- микробиологические показатели;

- другие показатели (в случае необходимости).

3.1.5.3. Перечень показателей качества формируется на основании свойств соответствующего организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для организмов данного вида), исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов.

3.1.5.4. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО животного происхождения, рекомендуется провести исследования, подтверждающие заявленные изменения.

3.1.5.5. Изучение репродуктивной токсичности и токсичности ГМО животного происхождения проводится в эксперименте на крысах линии Вистар. Токсикологические исследования включают изучение репродуктивной функции крыс поколения , пре- и постнатальное развитие потомства поколения , а также оценку физиолого-биохимических показателей крыс поколения (на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения). Схема проведения эксперимента представлена в таблице 1.

Таблица 1

Схема проведения эксперимента

Ключевые элементы системы планирования эксперимента	Рекомендуемые условия
Вид животных	Крысы линии Вистар
Пол	Самцы, самки
Возраст	25-30 дней
Исходная масса тела	70-80 г
Количество животных в группе в начале эксперимента	Не менее 80 особей в каждой группе: 55 , 25 Все животные должны быть выбраны из пометов со сходной численностью и выживаемостью потомства. При невозможности такой стандартизации количество животных в группах должно быть увеличено не менее чем в 2 раза: 110 , 50
Распределение по группам	Животных делят на 2 группы: группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО
Рацион	Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных
Карантин	Не менее 7-ми дней
Условия содержания	Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении
Отбор материала для гематологических, биохимических, морфологических исследований	У самцов поколения нe ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество животных, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (далее - ПКР). Исследуемый ГМО животного происхождения и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона проводится с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.

Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлены в таблицах 2-3.

Таблица 2

Состав базового полусинтетического казеинового рациона

Ингредиенты	Кол-во, г	Белок, г	Жиры, г	Углеводы, г	Калорийность
					Ккал	%
Казеин	23,949	20,21	0,36	-	84,08	23,46
Крахмал маисовый	59,0	0,59	-	51,07	206,64	57,65
Масло подсолнечное нерафинированное	5,0	-	4,99	-	44,91	12,53
Лярд	2,0	-	1,99	-	17,91	5,00
Солевая смесь*	3,5	-	-	-	-	-
Смесь в/р витаминов**	1,0	-	-	1,0	4,00	1,11
Смесь ж/р витаминов***	0,1	-	0,1	-	0,9	0,25
L-цистеин	0,2	-	-	-	-	-
Холин	0,25	-	-	-	-	-
Трет-бутилгидрохинон	0,001	-	-	-	-	-
Микрокристаллическая целлюлоза	5,0	-	-	-	-	-
Итого	100,0	20,80	7,44	52,07	358,44	100
* Состав солевой смеси представлен в таблице 3. ** 1 г содержит: тиамина (В1) - 0,6 мг, рибофлавина (В2) - 0,6 мг, пиридоксина (В6) - 0,7 мг, никотиновой кислоты - 3,0 мг, пантотената кальция - 1,6 мг, фолиевой кислоты - 0,2 мг, биотина - 0,02 мг, цианокобаламина (В12) - 0,0025 мг, викасола - 0,075 мг, L-метионина - 50 мг, глюкозы - до 1 г. *** 0,1 мл содержит: ретинола ацетата - 400 ME, эргокальциферола - 100 ME, ацетата - 7,5 мг, подсолнечного масла - до 0,1 мл

Таблица 3

Состав солевой смеси

N	Название соли	Химическая формула	Количество, г
1	Кальций углекислый		357,00
2	Калий фосфорнокислый. однозамещенный		196,00
3	Калий сернокислый		46,60
4	Калий лимоннокислый, моногидрат		70,78
5	Натрий хлористый	NaCl	74,00
6	Магния окись	MgO	24,00
7	Железо лимоннокислое		6,06
8	Цинк углекислый		1,65
9	Марганец углекислый		0,63
10	Медь углекислая		0,30
11	Калия йодат		0,01
12	Натрия селенат		0,01025
13	Парамолибдат аммония		0,00795
14	Натрия метасиликат		1,45
15	Хромовокалиевые квасцы		0,275
16	Борная кислота		0,0815
17	Натрий фтористый	NaF	0,0635
18	Никель углекислый		0,0318
19	Аммоний ванадиевокислый		0,0066
20	Сахароза		221,0434
	Итого		1000

Физиолого-биохимические показатели состояния здоровья крыс поколения оценивают на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения. Перечень исследуемых показателей и сроки отбора материала для исследований представлены в таблицах 4-12.

Таблица 4

Интегральные показатели

Изучаемые показатели	Сроки и периодичность сбора данных
Общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова)	Ежедневно
Поедаемость корма	Ежедневно
Масса тела	Каждые 7 дней
Масса тела самок во время беременности	С 1-го по 20-й дни беременности - у самок, предназначенных для изучения пренатального развития потомства. - каждые 5 дней
Масса тела самок во время беременности	С 1-го дня беременности до момента родов - у самок, предназначенных для изучения постнатального развития потомства - каждые 5 дней
Масса внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, простата, надпочечники, семенники) у самцов поколения	Не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу
Масса внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, надпочечники, яичники) у беременных самок поколения - на 20-й день беременности	Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу

Таблица 5

Общий клинический анализ крови

Изучаемые показатели [13, 36]

Сроки отбора материала

- концентрация гемоглобина; - гематокрит; - общее количество эритроцитов; - средний объем эритроцита; - среднее содержание гемоглобина в эритроците; - средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); - общее количество тромбоцитов: - тромбокрит; - средний объем тромбоцита: - общее количество лейкоцитов; - дифференцированный подсчет лейкоцитарной формулы (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы)

У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 6

Общий биохимический анализ сыворотки крови

Изучаемые показатели [13, 36]	Сроки отбора материала
- общий белок; - альбумин; - глобулин; - триглицериды; - общий билирубин; - прямой билирубин; - мочевина; - мочевая кислота; - креатинин: - глюкоза; - холестерин; - лактатдегидрогеназа; - альфа-амилаза; - креатинфосфокиназа; - щелочная фосфатаза; - аланинаминотрансфераза; - аспартатаминотрансфераза; - кальций; - магний; - железо; - натрий; - калий; - фосфор; - хлор	У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 7

Общий и биохимический анализ мочи

Изучаемые показатели [13, 36]	Сроки отбора материала
- суточный диурез; - цвет и прозрачность; - относительная плотность; - рН; - белок; - глюкоза; - креатинин; - мочевина; - мочевая кислота; - кальций; - магний; - фосфор	У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов. взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 8

Система антиоксидантной защиты

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Активность ферментов антиоксидантной защиты. Материал для исследований: эритроциты [11, 12, 28, 29, 31, 33] - глутатионредуктаза: - глутатионпероксидаза; - супероксиддисмутаза; - каталаза	У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу
Содержание продуктов перекисного окисления липидов. Материал для исследований: кровь, печень [7, 24, 27] - малоновый диальдегид

Таблица 9

Стабильность мембран лизосом

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом [4] Материал для исследований: печень - ; - ; - арилсульфатазы А и В	У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 10 на группу

Таблица 10

Система ферментов метаболизма ксенобиотиков

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков [22, 23, 26, 30, 34] Материал для исследований: печень - общее содержание цитохрома р-450; - этоксирезоруфиндеалкилаза; - пентоксирезоруфиндеалкилаза; - УДФ-глюкуронозилтрансфераза; - ХДНБ-глутатионтрансфераза	У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 10 на группу

Таблица 11

Интенсивность процессов апоптоза

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Щелочной гель-электрофорез изолированных клеток (метод "ДНК-комет") [18] Материал для исследований: печень, тимус, почки - Индекс апоптоза; - Степень фрагментации ДНК	У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 12

Морфологические исследования

Исследуемые органы	Методы исследований [1, 6, 8-10, 14-17, 21]
- головной мозг; - гипофиз; - сердце; - тимус; - легкие; - печень; - селезенка; - почки; - надпочечники; - жкт: желудок, тонкая и толстая кишки; - яичники; - семенники; - простата	Отбор материала у самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу. 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования: - обзорные гистологические исследования 3. Морфометрический анализ
	Вскрытие погибших в течение эксперимента животных (внеплановый отбор) 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования (перечень исследуемых органов может быть сокращен до минимально необходимого для установления причины смерти): - обзорные гистологические исследования.
	Дополнительные исследования 1. Микроскопические исследования: - гистохимические исследования; - иммуногистохимические исследования клеточных популяций и их производных. 2. Электронно-микроскопические исследования

Репродуктивную функцию оценивают по генеративной и эндокринной функции гонад родительских животных поколения , пренатальному и постнатальному развитию потомства поколения . Перечень исследуемых показателей и сроки отбора материала для исследований представлены в таблицах 13-15.

Таблица 13

Показатели, характеризующие генеративную функцию

Изучаемые показатели [19, 20]	Сроки сбора данных
Эффективность спаривания самцов и самок. Оценивают по способности к оплодотворению самок и самцов., выраженной в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. Для получения потомства самок ссаживают с самцами в соотношении 2:1 не менее чем на 7 дней	В период ссаживания половозрелых крыс поколения (возраст не менее 100 дней) с целью получения потомства для оценки постнатального развития. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 30 на группу
Эндокринная функция яичников и семенников. Оценивают по содержанию эстрадиола, прогестерона и тестостерона в сыворотке крови	У беременных самок поколения - на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу. У самцов поколения не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу
Дополнительные исследования
Спермограмма. Оценивают макроскопические параметры эякулята - рН, объем спермы, цвет, время разжижения и вязкость эякулята, а также характеристики клеточных элементов спермы - количество, подвижность, жизнеспособность, морфологию сперматозоидов, количество и типы лейкоцитов, количество и типы незрелых клеток сперматогенеза и пр.	У половозрелых самцов поколения или (возраст не менее 100 дней). Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу
Морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза)	У самцов поколения нe ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу
Морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм)	У беременных самок поколения - на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу

Таблица 14

Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства

Изучаемые показатели [19, 20]	Сроки сбора данных
Эвтаназия и вскрытие не менее 15 беременных самок на группу	20-й день беременности
Визуальное исследование матки, плаценты, плодов: выявление живых и мертвых плодов, подсчет количества желтых тел, мест имплантации. количество резорбций по правому и левому рогу матки (с последующим вычислением пред- и постимплантационной гибели)
Оценка развития плодов: макроскопический осмотр, определение массы и краниокаудального размера плодов. После осмотра, измерения и взвешивания плоды каждого помета необходимо разделить на три равные группы: одна группа предназначена для вскрытия, выделения и взвешивания внутренних органов (печени, почек, сердца, легких); плоды второй группы фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения внутренних органов по методу Вильсона; плоды третьей группы фиксируют в 96° этаноле и используют для изучения состояния скелета по методу Доусона

Таблица 15

Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства

Изучаемые показатели [5, 19, 20]	Сроки сбора данных
Контроль рождения потомства	самки поколения , 22-25-й дни беременности
Определение средней величины помета, подсчет количества живых и мертвых крысят, подсчет особей разного пола, выявление внешних уродств	1-й день жизни крысят поколения
Измерение массы тела и роста (краниокаудального размера) крысят поколения	2, 5, 10, 15, 20 и 25 дни жизни крысят поколения
Учет показателей физиологического развития крысят: срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников, открытие влагалища	1-35 дни жизни крысят поколения
Вычисление выживаемости потомства с 1-го по 5-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 5-го дня, к числу родившихся живыми) и с 6-го по 25-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня), выраженное в процентах.	1-25 дни жизни крысят поколения
Определение соотношения самцов и самок в пометах	1-10 дни жизни крысят поколения

В раздел отчета по результатам изучения репродуктивной токсичности и токсичности ГМО животного происхождения рекомендуется включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на интегральные, физиолого-биохимические показатели состояния здоровья, репродуктивную функцию и развитие потомства подопытных животных.

3.1.5.6. Иммунологические исследования ГМО животного происхождения проводятся в эксперименте на мышах линий СВА и С57В1/6# и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:

- действие на гуморальное звено иммунитета - в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

- действие на клеточное звено иммунитета - в реакции гиперчувствительности замедленного типа (далее - ГЗТ) к эритроцитам барана;

- действие как сенсибилизирующего агента - в тесте чувствительности к гистамину;

- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

В таблице 16 представлены сравнительные характеристики мышей линий СВА и С57В1/6.# Схема проведения эксперимента представлена в таблице 17.

Таблица 16

Характеристики мышей линий СВА и С57В1/6

Действующий фактор	Линия мышей
	СВА	C57B1/6#
Эритроциты барана	высокочувствительны	низкочувствительны
Гистамин	не чувствительны	чувствительны
Salmonella typhimurium	не чувствительны	чувствительны

Таблица 17

Схема проведения эксперимента

Ключевые элементы системы планирования эксперимента	Рекомендуемые условия
Вид животных	Мыши линий СВА и С57В1/6
Пол	Самцы
Возраст	Половозрелые
Исходная масса тела	18-20 г
Количество животных в группе в начале эксперимента	Не менее 120 мышей линий СВА в каждой группе Не менее 120 мышей линий С57В1/6 в каждой группе
Распределение по группам	Животных каждой линии делят на 2 группы: Группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; Группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО
Рацион*	Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных
Карантин	Не менее 7 дней
Условия содержания	Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении
* состав базового рациона приведен в таблице 2

Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента проводят наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных.

3.1.5.6.1. Влияние ГМО животного происхождения на гуморальный иммунный ответ оценивают на основании титров антител после иммунизации эритроцитами барана мышей высокоотвечающей (СВА) и низкоотвечающей (C57BL/6) линий. Для иммунизации животных следует использовать минимальные дозы антигена.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (10 млн клеток/мл). Отбор крови для исследований проводят на 7-й, 10-й и 14-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют общепринятым методом в реакции гемагглютинации [19]. Реакция основана на способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, склеивать (агглютинировать) эритроциты барана. В 96-луночных плоскодонных планшетах готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10. В контрольную лунку вносят 0,5 мл физиологического раствора. Ко всем лункам добавляют 0,5 мл 1% эритроцитов барана. Учет реакции ведется после инкубации планшетов в термостате в течение 2 ч при 37°С. При положительном результате эритроциты оседают на дне лунки планшета в виде зонтика, при отрицательном - в виде пуговки. За титр принимают то последнее разведение исследуемой сыворотки, при которой еще наблюдается положительный результат. Контрольная лунка должна быть отрицательной. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде , где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка.

3.1.5.6.2. Влияние ГМО животного происхождения на клеточный иммунный ответ оценивают на основании реакции гиперчувствительности замедленного типа. При выполнении теста антиген вводят двукратно: для сенсибилизации и для разрешения.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана - 0,02 мл (100 млн клеток/мышь); в контрлатеральную лапу - 0,02 мл 0,95%-го раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18-20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции [19].

3.1.5.6.3. Действие ГМО животного происхождения как сенсибилизирующего агента оценивают в тесте чувствительности к гистамину.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей [25].

3.1.5.6.4. Влияние ГМО животного происхождения на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium оценивают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами Salmonella typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1 000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют , а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов [2].

3.1.5.7. Аллергологические исследования ГМО животного происхождения проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровень циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (далее - в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (далее - ОВА) с последующим введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка [32]. Схема проведения эксперимента представлена в таблице 18.

Таблица 18

Схема проведения эксперимента

Ключевые элементы системы планирования эксперимента	Рекомендуемые условия
Вид животных	Крысы линии Вистар
Пол	Самцы
Возраст	Половозрелые
Исходная масса тела	150-180 г
Количество животных в группе в начале эксперимента	Не менее 25 особей в каждой группе
Распределение по группам	Животных делят на 2 группы: группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО
Рацион (состав базового рациона представлен в табл. 19)	Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Рацион не содержит яичного белка
Карантин	Не менее 7-ми дней
Условия содержания	Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении
Продолжительность эксперимента	29 дней
Отбор материала для исследований	На 29-й день эксперимента

Таблица 19

Стандартный рацион вивария

Ингредиент	Масса, г на 1 крысу в день
Крупа овсяная	2,5
Зерновая смесь	14,0
Хлеб 2 сорт	4,0
Творог	2,0
Рыбная мука	0,5
Мясо 2 категория	4,0
Морковь	8,0
Зелень	8,0
Рыбий жир	0,1
Дрожжи	0,1
NaCl	0,15
Основные нутриенты
Белок	3,69
Жир	1,28
Углеводы	12,42
Энергия, ккал	76,0

На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса [35]. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1-0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.

Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА проводят согласно по протоколу, описанному в статье Гмошинского И.В. и др., 1994 [3]. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Манна-Уитни.

Библиографические ссылки

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.

2. Ведомости фармакологического комитета. 1999. N 1. С. 31-36.

3. Гмошинский И.В., Кржечковская В.В., Пятницкий Н.Н.//Вопросы питания. 1994. N 1, 2. С. 30-33.

4. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир. 1980, 344 с.

5. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. 3-е изд. Киев: Вища школа, 1983. 383 с.

6. Киселева А.Ф. и др. Морфофункциональные методы исследования в норме и при патологии. К.: Здоров'я, 1983. 163 с.

7. Костюк В.А., Потапович А.И.//Вопр. мед. химии. 1987. N 3. С. 115-118.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

9. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. 272 с.

10. Луппа X. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980. 343 с.

11. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В.//Вопр. мед. химии. 1994. N 2. С. 56-58.

12. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А.//Вопр. мед. химии. 1994. N 2. С. 59-61.

13. Меньшиков В.В. (Ред.) Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.

14. Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова М.: Медицина, 1996, 544 с.

15. Ноздрачёв А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. С.-Пб.: Лань, 2001. 464 с.

16. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т. М.: Медицина, 2000. 1944 с.

17. Полак Д., Норден С.В. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. 74 с.

18. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. М., 2006. 27 с.

19. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств/Под ред. Миронова А.Н. Ч. 1. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.

20. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под ред. Хабриева Р.У. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. 832 с.

21. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 1993. 688 с.

22. Burchell В., Weatherill P.//Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169-176.

23. Burke M.D., Mayer R.T.//Chem.-Biol. Interact. 1983. Vol. 45. P. 243-258.

24. Ernster L., Nordenbrandt K.//In Methods in Enzymology. Oxidation and phosphorilation. Estabrook R.W., Pullman M.E., eds., Ac. Press N.Y. 1967. Vol. 10. P. 574-580.

25. FАО/WHO Protein quality evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation Held in Bethesda, Md, USA, 4-8 December, 1989, FAO Rome. 2 p.

26. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B.//J. Biol. Chem. 1974. Vol. 294. P. 7130-7139.

27. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980.//Biochem. Med. Vol. 23, Issue 3, P. 302-311.

28. Mills G.C.//J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. N 3. P. 502-506.

29. Niashikimi M., Rao N., Jagi K.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46. P. 849-854.

30. Omura Т., Sato R.//Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 2370-2378.

31. Oshino N., Chance B.//Arch. Biochem. Biophys. 1973. Vol. 154. N 1. P. 117-131.

32. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity. Food allergy and intolerance. London. 1987. P. 286-300.

33. Tillotson J.A., Sauberlich H.E.//J. Nutrition. 1971. Vol. 101. P. 1459-1466.

34. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al.//Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. P. 345-351.

35. Weigle W., Cochrane C., Dixon F.//J. Immunology. 1960. Vol. 85. P. 469-477.

36. Weingard K., Brown G., Hall R. et al.//Fundamental and applied toxicology. 1996. Vol. 29. P. 198-201.

______________________________

* Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) и/или соответствующих технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции

** Например. Protein Information Resource (PIR), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Universal Protein Resource (SwissProt), International Nucleotide Sequence Database Collaboration (GenBank) и др.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова