Инструкция по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (Организация-производитель: ОАО "Покровский завод биопрепаратов") (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору 30 июня 2006 г.)

I. Общие сведения

1. Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) предназначен для:

- обнаружения антител в сыворотке крови сельскохозяйственных, синантропных, диких и экзотических птиц к серологическим вариантам вируса гриппа H1-Н15 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

- определения напряженности поствакцинального иммунитета в РТГА;

- ретроспективной диагностики гриппа у всех видов птиц по приросту уровня специфических антител;

- серологической идентификации выделенных штаммов вируса гриппа птиц.

2. В состав набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) входят:

- инактивированные референтные штаммы вируса гриппа птиц с подтипами гемагглютинина Н1-Н15;

- моноспецифические гипериммунные сыворотки к 15 серологическим вариантам вируса гриппа птиц (H1-Н15);

- нормальная сыворотка, не содержащая антител к вирусу гриппа птиц.

В зависимости от эпизоотической ситуации по гриппу птиц Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) может быть укомплектован одним или несколькими антигенами вируса гриппа птиц с соответствующими специфическими и нормальной сыворотками.

3. По внешнему виду антигены и сыворотки представляют собой сухую однородную пористую массу желто-белого (антигены) или беловато-серого (сыворотки) цвета.

4. Антигены и сыворотки расфасовывают по 1 в стеклянные ампулы, или по 2 во флаконы соответствующей вместимости. Ампулы запаивают, а флаконы герметично укупоривают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.

5. Ампулы (флаконы) с компонентами набора маркируют с указанием:

- Антиген - краткого наименования организации-производителя, названия компонента, наименования штамма вируса гриппа птиц, подтипа гемагглютинина и нейраминидазы, объема в ампуле (флаконе), титра в РГА, номера серии и номера контроля, даты изготовления (число, месяц, год), срока годности (число, месяц, год);

- Специфическая сыворотка - краткого наименования организации-производителя, названия компонента, видовой принадлежности сыворотки, наименования штамма вируса гриппа, подтипов гемагглютинина и нейраминидазы, к которому она получена, титра в РТГА, объема в ампуле (флаконе), номера серии и контроля, даты изготовления;

- Нормальная сыворотка - краткого наименования организации-производителя, названия компонента, видовой принадлежности сыворотки, объема в ампуле (флаконе), номера серии и контроля, даты изготовления.

6. Ампулы (флаконы) с компонентами набора упаковывают в картонные или полистироловые коробки, обеспечивающие их неподвижность и целостность.

7. На коробки с наборами наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование организации-производителя, товарный знак, адрес и телефон, наименование набора, перечень компонентов и количество флаконов (ампул) каждого компонента в коробке, количество каждого компонента во флаконе (ампуле), , номер серии набора, номер контроля, дату комплектации (мес., год), срок годности (мес., год), условия хранения, обозначение СТО, штрих-код, знак соответствия.

К каждой коробке с набором антигенов и сывороток прилагают инструкцию по применению.

8. Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) хранят в сухом, темном месте при температуре не выше 8°С в течение 24 месяцев с даты комплектации.

9. Ампулы, флаконы без этикеток, с нарушением целостности или герметичности укупорки, с изменённым цветом или консистенцией, содержащие посторонние примеси, с истёкшим сроком годности, а также не использованные разведенные антигены, и сыворотки, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С в течение 3-х суток, а в замороженном состоянии 15 суток, выбраковывают и обезвреживают кипячением в течение 20 минут.

II. Принцип метода

10. Принцип РТГА основан на способности специфических антител, содержащихся в сыворотке крови, тормозить гемагглютинирующую активность вируса гриппа птиц соответствующего антигенного подтипа, что визуально определяется по оседанию или склеиванию эритроцитов.

III. Порядок применения

11. Исследования сыворотки крови птиц на наличие антител к вирусу гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

11.1. Подготовка к постановке реакции

11.1.1. Готовят один из следующих физиологических растворов - 0,1 М фосфатно-буферный раствор (ФБР) рН 7,0-7,2 или 0,9% раствор NaCI pH 7,0-7,2, который в дальнейшем используют на всех этапах постановки реакции.

11.1.2. Для получения сыворотки у птиц берут кровь из подкрыльцовой вены или путём скарификации гребня, в объеме 1,0-2,0 в чистые пробирки, предварительно увлажненные физиологическим раствором. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают 12-18 ч при комнатной температуре (18-20°С). Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки и исследуют в РТГА. При необходимости хранения сывороток более 3-х суток до начала исследований их консервируют азидом натрия в конечной концентрации 0,1 или мертиолятом (тиомерсалом) в соотношении 1:20 000 и помещают в холодильник при 2-8°С или замораживают.

11.1.3. Перед постановкой РТГА сыворотку крови разводят дистиллированной водой в соотношении 1:8. Для удаления термолабильных и термостабильных ингибиторов, разведенную сыворотку прогревают в водяной бане при температуре 58-60°С в течение 30 минут и обрабатывают углекислым газом в течение 2-3 минут. Затем образцы центрифугируют при 1500 об./мин (800 g) в течение 15-20 мин, декантируют и используют для постановки РТГА.

Допускается удаление термостабильных ингибиторов с помощью фильтрата нехолерного вибриона, периодата калия, сухого льда или др., рекомендуемых для этих целей реагентов.

11.1.4. Приготовление суспензии куриных эритроцитов.

Для получения взвеси эритроцитов используют СПФ-цыплят или коммерческих птиц, не имеющих антител к вирусу гриппа.

Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2-3% раствором лимоннокислого натрия, смешанным с физиологическим раствором в соотношении 1:2 (допускается использование раствора Альсвера в соотношении 1:1). Эритроциты трижды отмывают указанным раствором путем центрифугирования в течение 5-10 мин при 1500 об./мин (800 g).

Из осадка эритроцитов готовят 1% суспензию на физиологическом растворе, которую хранят в холодильнике (2-8°С) и используют до появления признаков гемолиза эритроцитов.

11.2. Постановка реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

РТГА проводят в три этапа:

- определение гемагглютинирующего титра вируса в реакции гемагглютинации (РГА);

- подготовка рабочей дозы антигена;

- определение титра антител в пробах сыворотки крови в РТГА.

11.2.1. Постановка РГА.

Антигены в ампулах (флаконах) восстанавливают до первоначального объема. Сухая масса должна раствориться полностью в течение 5 мин и представлять собой гомогенную взвесь без осадка.

Для постановки РГА используют пластиковые, одноразовые микропанели с U-образным дном и микропипетки с фиксируемым или варьируемым объемом не менее 0,025-0,05 .

Допускается повторное использование микропанелей, предварительно тщательно отмытых и обработанных 70% ректификованным спиртом.

Вначале готовят двукратные разведения антигенов. Для этого во все лунки микропанели вносят физиологический раствор в выбранном рабочем объеме (0,025 или 0,05 ). В первую лунку добавляют подготовленный антиген вируса гриппа птиц в рабочем объёме, трехкратно пипетируют и переносят рабочий объём во вторую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования рабочий объём испытуемого материала удаляют в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный дезинфектант.

Затем во все лунки микропанели с раститрованным антигеном добавляют рабочий объём физиологического раствора и вносят в таком же объеме 1% суспензию куриных эритроцитов.

Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18-22°С) на 40 мин. Если комнатная температура выше указанной, микропанели оставляют при 4°С на 60 мин.

Для контроля эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации и определения времени учета в две лунки микропанели с двойным рабочим объемом физиологического раствора (0,05 см3 или 0,1 ) добавляют по 0,025 или 0,05 1% суспензии куриных эритроцитов.

Реакцию учитывают при полном оседании эритроцитов в виде "пуговки" в контрольных лунках.

РГА оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде "зонтика", отрицательно - в виде "пуговки" при отсутствии агглютинации во всех контрольных лунках.

За титр антигена принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде "зонтика", что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ).

11.2.2. Подготовка рабочей дозы антигена.

Для постановки РТГА готовят рабочую дозу антигена - 4 ГАЕ, исходя из его титра, установленного в РГА (п. 11.2.1.). Для этого антиген разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления его титра на 4.

Например: титр антигена, определенный в РГА равен 1:256. Для приготовления рабочего разведения (4 ГАЕ) необходимо взять 63,0 физиологического раствора и 1 исходного антигена (256 : 4 = 64).

Рабочую дозу антигена готовят непосредственно перед постановкой реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ. Для этого в 4 лунки разливают физиологический раствор в объеме, выбранном для постановки реакции. В первую добавляют равный объем подготовленной рабочей дозы антигена и готовят двукратные разведения согласно п. 11.2.1.

При правильном выборе рабочей дозы в первой и второй лунках, содержащих 2 и 1 ГАЕ, должна быть полная агглютинация ("зонтик"), в третьей лунке, содержащей 1/2 ГАЕ, - частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации ("пуговка").

Корректирование рабочей дозы антигена (увеличение или уменьшение) проводят добавлением антигена или физиологического раствора с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.

Допускается использование 8 ГАЕ антигена.

11.2.3. Определение титра антител в пробах сыворотки крови.

Для постановки РТГА во все лунки микропанели вносят физиологический раствор в рабочем объеме (0,025 или 0,05 ). После этого в первую лунку добавляют равный объем испытуемой сыворотки, подготовленной по п. 11.1.3., трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разведений с 1:16 до 1:512. Последнюю лунку каждого ряда микропанели используют для контроля сыворотки на отсутствие изоагглютинации.

При необходимости определения антител одновременно к нескольким подтипам гемагглютинина вируса, из каждой испытуемой сыворотки готовят ряд последовательных двукратных разведений (титруют) в соответствующих повторностях.

Затем, во все лунки вносят рабочее разведение антигена в рабочем объеме по 0,025 или 0,05 , осторожно встряхивают и оставляют на контакт в течение 30 мин при комнатной температуре (18-22°С) или 60 мин - при температуре 2-8°С.

После истечения времени контакта, в каждую лунку добавляют рабочий объём 1% суспензии куриных эритроцитов.

Одновременно ставят контроли:

- на отсутствие изоагглютинации сывороток - в лунку вносят рабочий объём физиологического раствора, добавляют равный объём испытуемой сыворотки и 1% суспензии куриных эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать;

- на спонтанную агглютинацию эритроцитов - к двойному рабочему объему физиологического раствора добавляют рабочий объём 1% суспензии куриных эритроцитов. Агглютинация должна отсутствовать.

Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18-22°С) на 40 мин. Если комнатная температура выше указанной микропанели оставляют при 2-8°С на 60 мин.

В случае проявления феномена изоагглютинации к 0,05 сыворотки добавляют 0,025 осадка отмытых эритроцитов, тщательно встряхивают и выдерживают не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об./мин (800 g) в течение 3-5 мин. Сыворотку декантируют и используют для повторной постановки реакции.

При наличии спонтанной агглютинации эритроцитов их необходимо заменить.

Учет реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде "пуговки").

Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса гриппа.

Результат исследования считается положительным, если титр сыворотки составляет 4,0 log2 (1:16) и выше. При использовании в реакции 8 ГАЕ результат исследования считается положительным, если титр сыворотки 3,0 (1:8) и выше.

12. Ретроспективная диагностика гриппа птиц.

Ретроспективную диагностику гриппа птиц проводят по приросту уровня антител к вирусу гриппа птиц (Н1-Н15) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Парные сыворотки отбирают в количестве не менее 25 проб из обследуемой партии птиц: первый раз - при возникновении подозрения на заболевание птиц гриппом или проявлении первых клинических признаков заболевания, второй раз - через 14 суток.

12.1. Получение, подготовку сывороток для исследования и постановку РТГА по п. 11.1.1-11.1.4; 11.2.1-11.2.3.

12.2. Обработка результатов.

Диагноз на грипп птиц считается установленным при обнаружении 4-х и более кратного прироста уровня специфических антител в парных пробах сыворотки.

13. Серологическая идентификация выделенных штаммов вируса гриппа птиц.

13.1. Для идентификации используют гемагглютинирующие изоляты вирусов с титром в РГА не ниже 1:8.

13.2. Определение гемагглютинирующего титра вирусного изолята (экстраэмбриональная жидкость куриных эмбрионов) в РГА и расчет рабочей дозы проводят по п. 11.1.1-11.1.4; 11.2.1-11.2.3.

13.3. Специфические и нормальную сыворотки из набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц восстанавливают до первоначального объёма дистиллированной водой. Сухая масса должна раствориться полностью в течение 5 мин и представлять собой гомогенную взвесь без осадка.

13.4. Подготовку сывороток из набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц для исследования и постановку РТГА проводят по п. 11.1.1-11.1.4; 11.2.1-11.2.3.

13.5. Интерпретация результатов.

При обнаружении положительной РТГА с одной из специфических сывороток ее дополнительно исследуют с 4 ГАЕ гомологичного антигена.

Штаммовая принадлежность выделенного вируса считается установленной, если известная сыворотка из диагностического набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц положительно реагирует с ним в титре не ниже одного разведения, установленного с гомологичным антигеном.

При этом положительная реакция идентифицируемого вируса с другими специфическими и нормальной сыворотками входящими в состав диагностического набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц, должна отсутствовать.

14. При получении отрицательных результатов РТГА со всеми входящими в диагностический набор сыворотками выделенный вирусный изолят направляют на дополнительную идентификацию в ЦВЛ или научно-исследовательское учреждение страны вирусологического профиля.

IV. Меры личной профилактики

15. Работа с набором не требует специальных мер предосторожности. При подготовке ингредиентов и их использовании следует строго соблюдать меры личной гигиены и техники безопасности.

16. Хранить набор следует в местах, недоступных для детей.

Инструкция разработана ОАО "Покровский завод биопрепаратов.

Организация-производитель: 601125, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский ОАО "Покровский завод биопрепаратов" Тел./факс 8 (492) 43-71 110.

Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ "ВГНКИ"

Регистрационный номер: ПВР-1-2.6/01685

Заместитель Руководителя Россельхознадзора

Е.А. Непоклонов