Приложение 1. Рецепты рекомендуемых консервирующих смесей, питательных сред и индикаторов

Приложение 1

Рецепты рекомендуемых консервирующих смесей, питательных сред и индикаторов

1. Консервирующие смеси

Глицериновая смесь. К 1 л физиологического раствора добавляют 0,5 л х.ч. нейтрального глицерина и устанавливают рН 8,0, добавляя 20% раствора фосфорнокислого натрия .

Смесь стерилизуют в течение 15 мин при температуре 112°С. После стерилизации рН должен быть равен 7,6-7,8.

Фосфатная буферная смесь. На 1 л дистиллированной воды добавляют фосфорнокислого однозамещенного калия 0,45 г и фосфорнокислого двузамещенного (выветренного) натрия 5,34 г. Смесь разливают и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин.

2. Среды обогащения

Селенитовая среда. Состав среды (г): натрий кислый селенистокислый (без примеси теллура) - 4, пептон - 5, натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный - 7, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 3, лактоза (химически чистая) - 4, дистиллированная вода - 1000.

Приготовление среды. Среду готовят из двух основных растворов. Сначала экспериментально определяют точную пропорцию и , которая с используемыми образцами пептона и кислого селенистокислого натрия давала бы рН не выше 7,0, что регулируется изменением соотношения фосфатов. Такую предварительную подтитровку необходимо делать всякий раз, когда меняется серия любого из входящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты). Когда такое соотношение установлено, к приготовленному раствору фосфатов добавляют пептон и лактозу.

Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в течение 2 дн. по 30 мин или при температуре 112°С в течение 30 мин.

Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10%-ный раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы на каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора кислого селенистокислого натрия. Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл и закрывают плотно пригнанными пробками. Стерилизация готовой среды не допускается.

Основной раствор среды может храниться в холодильнике в течение 1-2 мес. Раствор кислого селенистокислого натрия готовят ex tempore.

При использовании селенитовой среды для исследования мочи и молока среду следует готовить с удвоенным количеством входящих в нее ингредиентов, и исследуемый материал засевают в соотношении к среде 1:1.

Примечание. При использовании фосфатов с кристаллизационной водой количество их соответственно должно быть изменено.

Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром. Наливают в каждый флакон по 90 мл бульона и стерилизуют при 1 атм в течение 30 мин. В каждый флакон в асептических условиях ex tempore добавляют по 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора гипосульфита (серноватистокислого натрия - ).

Для приготовления среды Мюллера используют бульон из перевара Хоттингера, содержащий 130-150 мг% аминного азота. Очень важное значение имеет рН среды. В связи с тем что некоторые сорта мела вызывают довольно значительные изменения рН бульона после автоклавирования, следует обязательно проверить реакцию каждой новой партии среды после стерилизации для установления рН 7,2-7,4.

С этой целью достаточно провести проверку в одном из флаконов и определить необходимый для подтитровки данного количества среды объем кислоты (или щелочи).

Раствор Люголя: 100 мл дистиллированной воды, 20 г йодистого калия и 25 г йода.

Раствор гипосульфита: в измерительный цилиндр насыпают 50 г серноватистокислого натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.

Среда Кауфмана. К 500 мл стерильной среды Мюллера добавляют 25 мл стерильной бычьей желчи и 5 мл 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают в стерильные пробирки с соблюдением правил асептики. Стерилизовать не нужно.

Среда Киллиана. К 100 мл стерильного МПБ (рН 6,7-6,9, не выше 7,3) прибавляют 1 мл 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого и разливают по пробиркам.

Желчный бульон. К 800 мл МПБ добавляют 200 мл нативной желчи крупного рогатого скота, разливают, стерилизуют текучим паром 2 раза по 30 мин, рН готового бульона 7,5-7,6.

3. Дифференциальные питательные среды

Среды Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфит-агар, а также среды с индикатором ВР и сахарами (глюкозой, лактозой, сахарозой или маннитом) выпускаются сухими, и их готовят по прописи, указанной на этикетке.

Трехуглеводная среда с мочевиной. Сухого препарата с лактозой и индикатором ВР берут 45 г, глюкозы х.ч. - 1,1, сахарозы х.ч. - 10, мочевины - 10 г, воды дистиллированной - 1 л. Смесь растворяют при нагревании до кипения и разливают в стерильные пробирки по 5-6 мл. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин (загружать в горячий автоклав). Среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см высотой).

4. Дополнительные питательные среды

Среда с повышенным содержанием лактозы. Состав среды: воды дистиллированной - 100 мл, пептона - 0,5%, хлористого натрия - 0,5, реактива Андрадэ - 1, лактозы - 4%.

Смесь растворяют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин или текучим паром 3 дня подряд по 20 мин.

Среду с повышенным содержанием сахарозы готовят аналогично.

Среда для посева по Свену-Гарду: бульона мясо-пептонного или перевара Хоттингера - 100 мл, агар-агара - 0,5-0,8%.

Отмытый и отжатый агар-агар добавляют в бульон, кипятят до расплавления агар-агара, проверяют рН (7,2-7,4). Фильтруют через бумажный фильтр, разливают в стерильные большие пробирки по 20 мл. Стерилизуют при 1 атм в течение 30 мин.

Среда Штерна (глицерин-фуксин-бульон). К 100 мл МПБ (рН 7,2-7,4) добавляют 5-6 капель насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 2 мл свежеприготовленного 10%-ного водного раствора невыветрившего сульфита натрия и 1 мл глицерина. Бульон разливают в пробирки и дробно стерилизуют. Среда имеет золотисто-желтый цвет, ее хранят в темноте не более 10-12 дн.

Среда Биттера с рамнозой. В 1 л дистиллированной воды растворяют 0,5 г трехосновного лимоннокислого натрия, 5 г хлористого натрия, 0,05 г пептона и 5 г рамнозы (изодульцит). Жидкость кипятят, фильтруют, разливают в пробирки и дробно стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.

Засевают среды с помощью пастеровской пипетки одной каплей смыва (физиологическим раствором) суточной агаровой культуры. При добавлении к суточной культуре бактерий на среде Биттера с рамнозой 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилрота она немедленно приобретает окраску: красную - при максимально возможной кислотности, розовую или оранжевую - при меньшей кислотности, желтую - при рН, близкой к 7.

Среду Биттера с арабинозой готовят аналогично с добавлением соответствующего сахара.

5. Приготовление индикаторных бумажек

На индол. Смешивают парадиметиламидобензальдегид (3-5 г), этиловый спирт 96°-ный (50 мл), фосфорную кислоту (очищенную концентрированную) (10 мл).

Затем дают раствориться порошку. Полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками.

Цвет бумажки - желтый. При наличии индола цвет бумажки меняется от сиренево-розового до интенсивно малинового. Появление других цветов на индикаторной бумаге не учитывают.

На сероводород. Лист фильтровальной бумаги смачивают в следующем растворе: дистиллированной воды - 100 мл, уксуснокислого свинца - 20 мл, двууглекислой соды - 1 г.

Бумагу высушивают, нарезают полосками. После обработки бумага остается белой, при наличии сероводорода - чернеет.