Методические указания по бактериологической диагностике сальмонеллезов животных (Рекомендованы Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 30 декабря 1971 г.)

1. Общие положения

Сальмонеллезом болеют все виды животных, в том числе птица.

Возбудители сальмонеллезов относятся к роду Salmonella семейства Еnterobacteriaceae. По культурально-морфологическим свойствам сальмонеллы являются грамотрицательными палочками, хорошо красятся всеми анилиновыми красками, не образуют спор и капсул, обладают, как правило, выраженной подвижностью, за исключением некоторых серологических типов и их вариантов (S. gallinarum и др.), хорошо растут на обычных питательных средах при рН 7,0-7,4, оптимальная температура роста - 37°С.

На пластинчатом агаре сальмонеллы образуют серовато-белые с голубоватым оттенком колонии диаметром 1-3 мм S-, R- и промежуточной О (SR)-формы. Колонии S-формы гладкие, блестящие, куполообразные, с ровными краями. Колонии R-формы матовые, с неровными фестончатыми краями и плоской неровной поверхностью. Культуры в R-форме могут отличаться от культуры в S-форме также по биохимическим и серологическим свойствам.

Сальмонеллы характеризуются в целом следующими ферментативными свойствами: не ферментируют сахарозу, не разлагают адонит, подавляющее большинство не расщепляют салицин и не разлагают лактозу, не образуют индола, не расщепляют мочевину, не дают реакцию Фогеса-Проскауера, дают положительную реакцию с метиловым красным, большинство продуцируют сероводород. Глюкозу быстро ферментируют все типы сальмонелл с образованием газа, однако встречаются штаммы S. typhimurium, S. typhisuis, S. derby, S. abortus-equi, S. thompson, S. dublin, S. anatum, S. gallinarum, разлагающие глюкозу без образования газа. Подавляющее большинство сальмонелл ферментирует маннит.

Антигенная структура бактерий рода Salmonella очень разнообразна. У сальмонелл различают два основных антигенных комплекса: О-антиген - соматический, термостабильный и Н-антиген - жгутиковый, термолабильный. Последний имеет две фазы: первую и вторую.

В основу классификации сальмонелл положена их антигенная структура, представленная в схеме Кауфмана-Уайта, по которой определяют группу и серотип возбудителя. По данной схеме в настоящее время насчитывают более 1200 серотипов сальмонелл.

Возбудители сальмонеллезов у животных и птиц принадлежат преимущественно к серологическим группам В, , , , .

Среди крупного рогатого скота наиболее распространены S. dublin, S. typhimurium и др.

Свиньи являются резервуаром большого числа различных серологических типов сальмонелл, среди которых наиболее распространены S. choleraesuis, S. typhisuis, S. dublin, S. murnchen и др.

У овец главным образом обнаруживают S. abortusovis, S. typhimurium, у лошадей - S. abortusequi, у птиц - S. pullorum, S. gallinarum, S. typhimurium, S. anatum, S. Iondon и др., у пушных зверей - S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin.

У собак и кошек обнаруживают весьма разнообразные типы сальмонелл, но наиболее часто серотипы, встречающиеся у сельскохозяйственных животных.

У животных сальмонеллезы могут проявляться в виде трех основных форм: первичные сальмонеллезы, вторичные и бактерионосительство, которое протекает без видимых клинических признаков.

Первичные сальмонеллезы характеризуются клиническими признаками, свойственными определенному виду животных, и вызываются определенными видами сальмонелл.

Вторичные сальмонеллезы наслаиваются на основное заболевание и осложняют его (чума свиней, пастереллез и др.), при этом характерные для сальмонеллезов клинические признаки обычно слабо выражены или отсутствуют.

Бактерионосители сальмонелл - животные, которые, будучи внешне здоровыми, выделяют бактерии с фекалиями, мочой. Во внутренних органах таких животных возбудителя обнаруживают главным образом в печени (в желчи, слизистой желчного пузыря, в лимфатических узлах печени), в мезентериальных лимфатических узлах, а также в содержимом слепой кишки.

Бактерионосители являются основным резервуаром сальмонеллезной инфекции и представляют особую опасность как источник инфекции не только для молодняка сельскохозяйственных животных, но также и как источник токсикоинфекции для людей при употреблении в пищу продуктов от таких животных.

2. Материал для исследования

Для посмертной диагностики сальмонеллезов в лабораторию направляют свежие трупы мелких животных и птиц, от трупов крупных животных - паренхиматозные органы или части их (печень с желчным пузырем и лимфатическими узлами, селезенку, почку), мезентериальные лимфатические узлы, трубчатую кость; при подозрении на хроническую форму от свиней, кроме того, направляют слепую кишку с содержимым, и от телят - измененные участки легких; в случае аборта - свежий плод.

Материал для исследования следует брать в возможно более ранние сроки после гибели животного (не позднее 12 ч). Не рекомендуется брать материал от животных, подвергавшихся лечению антибиотиками.

Трупы направляют в лабораторию в водонепроницаемой таре. Пробы органов доставляют в чистой, по возможности стерильной посуде (кишечник отдельно от других органов) в свежем виде; при невозможности быстрой доставки материал консервируют 30%-ным водным раствором глицерина.

Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, кровь, истечения из матки при абортах, а для серологического исследования по РА - сыворотку крови.

Период бактериемии при сальмонеллезах очень короткий, поэтому кровь для прижизненной диагностики необходимо брать в наиболее ранние сроки заболевания (на 1-4-й день). Кровь берут стерильным шприцем из яремной вены больного животного (теленка) в количестве 5-10 мл. Посев на среды целесообразно проводить сразу же после взятия крови.

Для обнаружения сальмонелл пробы фекалий отбирают после дефекации из последней порции. При наличии в фекалиях крови, слизи, гноя, пленок их необходимо включить в пробу. Можно брать фекалии непосредственно из прямой кишки с помощью стерильной стеклянной ректальной трубки (трубки Цимана) или деревянной палочки с ватным или марлевым тампоном на конце. Отобранные пробы помещают в стерильную посуду.

При невозможности посева в течение 3-4 ч фекалии помещают в пробирку с консервирующим раствором. В качестве консерванта применяют глицериновую смесь или буферный раствор фосфорнокислых солей (рН 8,0). В пробирку наливают 5 мл консерванта, количество же помещенных фекалий должно составлять 1/3 объема консерванта (приготовление консервирующих растворов см. в приложении).

Исследование фекалий следует начинать в возможно более ранние сроки. Лишь в исключительных случаях допускается хранение материала не более суток в холодильнике при 2-6°С.

3. Ход исследования материала

Посмертная диагностика

Первый день исследования. Посевы на питательные среды делают из крови сердца, печени, желчного пузыря, селезенки, почки, измененных лимфатических узлов и костного мозга; при подозрении на хроническое течение болезни делают дополнительные посевы из легких - от телят, слепой кишки - от свиней, измененных желтков яичника - от кур. Патологический материал засевают на МПБ, чашки Петри с МПА и одной из дифференциальных сред (Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфитный агар). При подозрении на хроническое течение сальмонеллеза посевы обязательно проводят и на одну из сред накопления (селенитовая, Мюллера, Кауфмана, Киллиана).

Посев на чашки делают кусочком исследуемого органа. Для этого поверхность органа прижигают шпателем, а затем отрезают стерильными ножницами. На каждую чашку берут новую порцию любого посевного материала. На МПБ посев производят пастеровской пипеткой.

Посевы также можно делать из суспензии, для чего кусочки органов тщательно растирают в стерильной ступке (кишечник отдельно от других органов), заливают физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 1:4-1:5, полученную взвесь отстаивают 20-30 мин и из верхней части надосадочной жидкости делают посевы пастеровской пипеткой.

Засеянные пробирки и чашки помещают в термостат при температуре 37°С на 18-20 ч.

Наряду с высевом на питательные среды проводят микроскопическое исследование методами световой и люминесцентной микроскопии.

Для световой микроскопии мазки готовят из трупного материала и органов абортированных плодов и окрашивают по Граму.

Для исследования методом флуоресцирующих антител готовят мазки-отпечатки из патологического материала и обрабатывают их согласно "Наставлению по лабораторной диагностике рожи свиней, листериоза, вибриоза и сальмонеллезов сельскохозяйственных животных с помощью флуоресцирующих сывороток".

Второй день исследования. Через 18-24 ч просматривают посевы на плотных средах в чашках Петри и отбирают подозрительные колонии, а также делают высевы из жидких питательных сред на плотные дифференциальные среды.

Для отбора подозрительных колоний посевы на чашках со средами Эндо, Плоскирева и Левина просматривают невооруженным глазом с помощью лупы в проходящем дневном или искусственном свете; посевы на чашках с висмут-сульфитным агаром просматривают в падающем свете.

Сальмонеллы на среде Эндо растут в виде прозрачных, слегка голубоватых нежных колоний, иногда слегка розоватых. На среде Плоскирева они также бесцветны, но выглядят несколько более плотными и могут быть слегка мутноватыми. На среде Левина они прозрачные, иногда с небольшим фиолетовым оттенком. На висмут-сульфитном агаре почти все сальмонеллы растут в виде черных колоний с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют сальмонеллы из группы С, которые при росте на висмут-сульфитном агаре образуют светлые нежные зеленоватые колонии. Просмотр чашек с висмут-сульфитным агаром проводят через 24 и 48 ч после посева.

Рост на МПБ и МПА некоторых возбудителей сальмонеллезов животных имеет различия.

Возбудители сальмонеллезов телят, свиней и птиц на МПА в первые сутки роста образуют округлые колонии средней величины сероватого цвета с голубым оттенком в тонком слое среды. При длительном хранении культуры колонии становятся мутноватыми, отдельные образуют слизистые валы. МПБ мутнеет, впоследствии на дне пробирки образуется осадок, а на поверхности - часто пленка и пристеночное кольцо.

Возбудитель сальмонеллеза овец в отличие от других сальмонелл растет на питательных средах довольно скудно в виде просвечивающихся мелких колоний с приподнятым центром и радиальной исчерченностью без валика. На МПБ вызывает равномерное помутнение с незначительным осадком без пленки и пристеночного кольца. При добавлении к средам сыворотки крови (5-10%) или глюкозы (0,2%) рост улучшается.

Возбудитель сальмонеллезного аборта кобыл в МПБ образует равномерную муть со слизистым осадком, на МПА - серовато-белые колонии, легко снимающиеся петлей с поверхности агара, также могут образовываться и шероховатые, сухие, врастающие в среду колонии.

При обнаружении роста типичных или подозрительных колоний их исследование начинают с изучения морфологии в мазке, окрашенном по Граму. Все отобранные культуры переселяют на цветной ряд, состоящий из полужидких или жидких с поплавками сред Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, а также на МПБ или 1%-ную пептонную воду для определения образования индола и сероводорода. С этой целью под пробку в пробирку с бульоном или пептонной водой помещают две индикаторные бумажки. При наличии индола соответствующая бумажка краснеет, при выделении сероводорода - другая бумажка чернеет (приготовление индикаторных бумажек см. в приложении). Определение индола можно проводить и с помощью реакции Эрлиха. Для этого к 5 мл бульонной культуры приливают 2 мл эфира, встряхивают и дают отстояться. Затем под слой эфира пастеровской пипеткой подслаивают 0,5-1 мл реактива (парадиметиламидобензальдегида - 1,0 г спирта 96°-ного 100 мл, соляной кислоты х.ч. - 20 мл). Образование красного кольца на границе эфира и бульона указывает на наличие индола.

Подвижность сальмонелл определяют при посеве культуры уколом в полужидкий агар (0,2% агар-агара) или при посеве в полужидкие среды Гисса. Неподвижные микробы растут только по ходу укола, подвижные дают диффузный рост и помутнение всей среды.

Одновременно необходимо проводить реакцию агглютинации с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками.

В случае выявления типичных серологических свойств дают предварительный ответ на сальмонеллез.

Третий день исследования. Проводят идентификацию выделенных культур по биохимическим свойствам на цветном ряду, изучение антигенной структуры в реакции агглютинации на стекле с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками, просмотр чашек Петри с посевами из жидких питательных сред.

Если на цветном ряду обнаружены бактерии, не ферментирующие лактозу и сахарозу, ферментирующие глюкозу, не образующие индола, то такую культуру подвергают испытанию в реакции агглютинации на стекле с сальмонеллезными агглютинирующими поливалентными О-сыворотками групп В, , , , , а в случае необходимости и других (редких) групп.

Реакцию агглютинации ставят следующим образом: на обезжиренное предметное стекло наносят каплю сыворотки, затем петлей вносят 20-часовую агаровую культуру и тщательно растирают ее. О-агглютинация наступает немедленно, и агглютинат имеет вид плотных, с трудом разбивающихся комочков и зернышек.

При получении положительной реакции с одной из поливалентных О-сывороток ставят реакцию агглютинации раздельно с каждой из О-сывороток, входящих в поливалентную, для определения, к какой из групп по схеме Кауфмана-Уайта принадлежит культура.

После установления О-группы такую культуру испытывают с монорецепторными Н-сыворотками, сначала первой фазы, а затем - второй. При этом Н-сыворотки применяют в порядке, соответствующем распространению типов сальмонелл в данной местности. Н-агглютинация наступает быстро, и агглютинат имеет вид крупных, рыхлых, легко разбивающихся хлопьев.

Для агглютинации с О-сыворотками культуру следует брать с верхней части скошенного агара, для агглютинации с Н-сыворотками - с нижней части агара, где расположены наиболее подвижные особи.

В лаборатории нельзя готовить смеси из отдельных монорепторных О- и Н-сывороток, так как они не подлежат разведению.

Если выделенная культура обладает типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами и дает четкие результаты в реакции агглютинации с определенными монорецепторными сыворотками, дают ответ о выделении сальмонелл установленного серологического типа (характеристику биохимических и серологических свойств сальмонелл см. в приложении 3).

Если в первичных посевах на твердых питательных средах роста характерных колоний не получено, то при просмотре чашек с посевами из жидких питательных сред проводят отбор подозрительных колоний и исследуют в указанном выше порядке.

Если характерных и подозрительных колоний нет ни в чашках с прямыми посевами, ни в чашках с высевом из жидких питательных сред, дают ответ об отрицательном результате исследования.

Четвертый день исследования. Проводят учет ферментативной активности культур, пересеянных накануне на цветной ряд, и серологическое исследование их.

Прижизненная диагностика

1. Исследование фекалий

Первый день исследования (посев материала на питательные среды). Фекалии засевают в чашки Петри с плотными дифференциальными средами (Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфитный агар).

Так как не все серологические типы сальмонелл одинаково хорошо растут на упомянутых средах, посев следует проводить на две чашки с двумя различными средами. На каждую чашку следует брать новую порцию посевного материала в таком количестве, чтобы получить изолированный рост колоний.

Если фекалии доставлены в консерванте, то капли взвеси наносят пастеровской пипеткой на поверхность дифференциальных питательных сред у края чашки, тщательно растирают стеклянным шпателем на небольшой площади, а затем, оторвав шпатель от питательной среды, не прожигая его, делают посев на остальной поверхности среды.

Фекалии, доставленные без консерванта, суспендируют в физиологическом растворе в соотношении 1:10, отстаивают в течение 20-30 мин и сеют из верхнего слоя надосадочной жидкости, как указано выше.

Учитывая, что такие элективные среды, как среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, подавляют рост кишечных сапрофитов, целесообразно увеличить количество посевного материала на этих средах в 2-3 раза по сравнению со средами Эндо и Левина.

Необходимым условием для получения изолированных колоний является отсутствие конденсата на поверхности питательной среды, что достигается разливом среды, охлажденной до температуры 50°С, и ее подсушиванием. Готовить среду лучше накануне.

Одновременно проводят посев фекалий в среды обогащения (селенитовая, Кауфмана или Мюллера), при этом соблюдают соотношение посевного материала к среде 1:5.

Засеянные чашки и пробирки помещают в термостат при температуре 37°С на 18-20 ч.

Учитывая возможность неудачи первичного посева (отсутствие роста или сплошной рост), материал хранят в холодильнике, пока не будут просмотрены чашки с посевами.

Второй день исследования. Через 18-24 ч просматривают посевы на чашках Петри и отбирают подозрительные колонии, а также делают высев из сред обогащения на чашки Петри с плотными дифференциальными средами.

При обнаружении на чашках роста типичных колоний изучают 2-3 колонии, а при наличии подозрительных колоний изучают 3-5 колоний с каждой чашки. Изучаемые колонии снимают и пересевают в пробирки на трехуглеводную среду с мочевиной (рецепт среды см. в приложении) или короткий цветной ряд (среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом) и МПА. На трехуглеводную среду с мочевиной посев делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика.

Одновременно может быть проведена предварительная реакция агглютинации с сальмонеллезными агглютинирующими сыворотками.

Третий день исследования. Изучают выделенные культуры по биохимическим свойствам, просматривают чашки Петри с посевами из сред обогащения и отбирают подозрительные колонии, которые пересевают на трехуглеводную среду с мочевиной.

Если характерных и подозрительных колоний нет в чашках с прямыми посевами, а также в чашках с высевом из сред обогащения, дают ответ об отрицательном результате исследования.

Изучение выделенных культур начинают с учета их ферментативной активности на трехуглеводной среде с мочевиной (предварительно следует убедиться в чистоте культуры).

На этой среде при ферментации глюкозы изменяется цвет среды в столбике, при ферментации лактозы и сахарозы - в скошенной части агара. Если при ферментации сахаров, помимо кислоты, образуется газ - в среде появляются пузырьки. При расщеплении мочевины изменяется цвет всей среды.

Если культуры, засеянные на трехуглеводную среду с мочевиной, сбраживают лактозу, сахарозу, глюкозу с образованием газа (столбик и косяк - синие при применении среды с реактивом ВР), они принадлежат к разновидностям кишечной палочки. Если культура расщепляет мочевину (среда оранжевого цвета), она относится к роду протея.

Культуры, не расщепляющие лактозу, сахарозу и мочевину, но ферментирующие глюкозу (столбик зеленовато-голубоватого цвета, косяк - розовый), подозрительны на сальмонеллы. Такие культуры пересевают на цветной ряд, а для определения сероводорода и индола - на МПБ или 1%-ную пептонную воду.

Четвертый день исследования. Проводят учет ферментативной активности культур, пересеянных с трехуглеводной среды с мочевиной, и серологическое исследование их. Таким образом, на четвертый день заканчивают исследование культур, выделенных из первичного посева.

В тех случаях, когда сальмонелл из первичных посевов не выделено, проводят идентификацию культур, высеянных накануне на трехуглеводную среду с мочевиной, по ферментации лактозы, сахарозы, глюкозы и мочевины. При подозрении на наличие сальмонелл делают пересев на цветной ряд, а также МПБ или 1%-ную пептонную воду для определения сероводорода и индола.

Пятый день исследования. Проводят учет биохимических и серологических свойств культур, пересеянных накануне с трехуглеводной среды с мочевиной.

2. Исследование крови

Первый день исследования. Кровь засевают в 6-7 пробирок или 2-3 флакона МПБ с 10-20% бычьей желчи в соотношении посевного материала к среде 1:10. При отсутствии желчи кровь может быть засеяна в обычный МПБ.

Посев крови следует проводить сразу же после взятия. Для посева также можно использовать сгустки крови (после измельчения).

Засеянные пробирки или флаконы помещают в термостат при температуре 37°С на 18-24 ч.

Второй день исследования. Через 18-24 ч делают высев бульона с желчью или обычного МПБ на чашки Петри с плотными дифференциальными средами. Засеянные жидкие среды продолжают инкубировать.

Третий день исследования. Просматривают посевы на дифференциальных средах и отбирают подозрительные колонии, дальнейшее изучение которых проводят, как описано выше.

При отсутствии роста подозрительных колоний делают повторный высев из жидких сред на 2-, 5- и 7-е сут.

Дополнительные исследования. В случае выделения культур сальмонелл с отклонениями от типичных свойств для их окончательной идентификации проводят дополнительные исследования.

Эти отклонения могут быть следующими:

а) культура дает четкую реакцию агглютинации с О- и Н-сыворотками, но нетипична по ферментативным свойствам;

б) культура типична по ферментативным свойствам, но не агглютинирует или слабо реагирует с О- и Н-сальмонеллезными сыворотками.

В первом случае прежде всего необходимо убедиться в чистоте культуры, для чего проводят рассев ее на чашки Петри с МПА и одной из дифференциальных сред, затем отбирают 5-6 наиболее типичных колоний и изучают их биохимические свойства и серологическую характеристику.

Во втором случае необходимо проверить, не является ли культура одной из разновидностей бактерий из рода эшерихий с замедленной ферментативной активностью. Для этого проводят посев культуры в среды Гисса с лактозой и сахарозой, которые инкубируют в термостате при 37°С до 21 сут с ежедневным учетом результатов. Для более быстрого выявления ферментативной активности культур рекомендуется засевать их в среды Гисса с 4% лактозы и с 4% сахарозы. Необходимо также проверить отношение таких культур к салицину (сальмонеллы не ферментируют салицин). Следует иметь в виду, что S. typhisuis не ферментирует маннит.

В случае, когда культура типична по своим ферментативным свойствам, но не дает четкой агглютинации, рекомендуются повторные пассажи культуры (4-5) на 10%-ный желчный бульон и скошенный агар, после чего проводят рассев на чашку Петри с МПА с последующим отбором типичных колоний.

Если культура не агглютинируется О- и Н-сыворотками, ее следует испытать в отношении к сальмонеллезному О-фагу согласно инструкции по его применению (см. приложение). Чувствительность культуры к бактериофагу указывает на принадлежность ее к роду Salmonella.

При серологической идентификации сальмонелл иногда возникает трудность в определении жгутикового антигена или одной из его фаз, что может быть связано с угнетением или утратой Н-антигена (потери подвижности) либо с преобладанием в популяции какой-либо одной фазы. При этом следует помнить, что для некоторых сальмонелл характерно отсутствие подвижности (S. pullorum, S. gallinarum) или первой фазы (S. choleraesuis var. kunzendorf, S. typhimurium var. binus).

Для выявления специфической фазы жгутикового Н-антигена можно использовать феномен роения в чашках Петри по Свену-Гарду. Для чего исследуемую культуру в виде бляшки засевают в центр чашки с 0,8-1%-ным питательным агаром (см. приложение). К остуженному до 50°С агару (перед тем как заливают чашку) добавляют 2-3 капли агглютинирующей Н-сыворотки той фазы жгутикового антигена, которая была выявлена у данной культуры и которую желательно подавить. Через 24 ч инкубации при 37°С бактерии с искомой фазой Н-антигена оказываются на периферии макроколонии.

Если подозрительная на сальмонеллы культура имеющимися монорецепторными сыворотками не типируется, ее необходимо направить в вышестоящую лабораторию.

Следует отметить, что в идентификации культур, подозрительных на принадлежность к сальмонеллам, наиболее важное значение имеет подробное изучение биохимических свойств (ферментация дульцита, арабинозы, рамнозы, раффинозы, салицина, адонита, инозита; расщепление мочевины, рост на бульоне Штерна, реакция Фогеса-Проскауэра и с метиловым красным). Использование в целях идентификации культур только метода агглютинации подозрительных колоний на стекле прямо с чашки первичного посева или даже со среды Ресселя может явиться источником серьезных диагностических ошибок, так как ряд бактерий других родов семейства Enterobacteriaceae (например, родов Escherichia и др.) могут иметь общие антигены с сальмонеллами.

В необходимых случаях проводят биологическое исследование. Наиболее восприимчивыми лабораторными животными являются белые мыши (массой 15-18 г). Культуру вводят подкожно белым мышам в дозе 0,2-0,3 мл при концентрации 50-100 млн микробных тел в 1 мл. Животные гибнут в сроки от 3 до 10 сут.

Диагноз на сальмонеллез основывается на эпизоотологических, клинических, патолого-анатомических данных, а также результатах бактериологических и серологических исследований.