Приложение Е (справочное). Измерение воздействия наночастиц на кожные покровы

Приложение Е
(справочное)

Измерение воздействия наночастиц на кожные покровы

Е.1 Общие положения

Основной целью измерения воздействия наночастиц на кожу является сохранение их размеров и свойств во время отбора проб, чтобы можно было оценить риск. Существуют различные методы отбора проб на коже, которые выбираются в зависимости от природы вещества, и обстоятельств, при которых происходит воздействие. Они обычно разбиваются на три отдельные категории процедур отбора проб в соответствии с CEN/TS 15279 и ISO/TR 14294, т.е. путем перехвата, удаления и методом in situ.

Е.2 Перенос

Определенные пробоотборные среды используют для перехвата частиц порошков или суспензий на пути к открытым участкам кожных покровов. При этом на руку или другую защитную перчатку надевают перчатку из ткани или пластика либо на кожу или верхнюю одежду накладывают лоскут ткани или другого материала. Частицы, твердые вещества или жидкие суспензии собирают на пробоотборную среду в течение периода отбора проб. Как правило, их анализируют по массе путем восстановления с носителя, и физическая форма при отборе не имеет значения, если она сохранена на носителе. Наночастицам при отборе проб не требуется сохранять обычное физическое состояние (перемещаться, агломерировать, распадаться и т.д.), как это было бы на пути к кожным покровам. Существуют различия в электростатических свойствах между кожными покровами и пробоотборной средой. Восстановление из носителя после отбора является вторым шагом к обнаружению, и это также может изменить внутренние свойства наночастиц и их распределение по размерам. Однако, чтобы не сместить слой наночастиц после улавливания, используют двухстороннюю клейкую углеродную ленту для электронной микроскопии (которая является проводящей и испускает низкий уровень летучих органических соединений) или ее аналог, с последующим СЭМ. Метод применим только к порошкам, так как суспензии фиксироваться таким образом не будут. Тип используемой клейкой ленты должен быть подходящим для СЭМ. Проводимость ленты является критическим фактором, потому что от электронного луча могут быть образованы ореолы, особенно в высоком вакууме, если заряд не рассеивается.

Е.3 Удаление

Наночастицы переводят в жидкую суспензию либо непосредственно с кожных покровов (ручная смывка), либо с подложек, перчаток или клейкой ленты (как указано выше для пробоотборников), либо с салфеток для кожи. Для нерастворимых наночастиц полученная жидкая суспензия может быть измерена с помощью лазерной дифракции. Этот метод использован для определения распределения размеров суспензий наночастиц (см. [45]) с указанием диаметров вплоть до 90 нм. Вместе с тем, процесс суспендирования, безусловно, изменит характеристики наночастиц по сравнению с теми, какие были бы при отборе проб на кожные покровы или пробоотборные среды. Различная эффективность удаления агломератов и отдельных наночастиц при смывании может существенно влиять на распределение наночастиц по размерам. Для растворимых наночастиц полное расщепление или растворение известным объемом растворителя, таким как вода или кислота, с последующим анализом массовой концентрации позволит определить массу, как при традиционных измерениях (т.е. не NOAA) воздействия на кожные покровы. Однако при этом оно не дает информации о поверхности или размерах частиц.

Для того чтобы извлечь (снять) частицы пыли с кожи и с поверхностей, для определения массы используют клейкие ленты, они также могут быть исследованы при помощи СЭМ без дальнейшего (преднамеренного) нарушения слоя. Основания полагать, что клейкие ленты не могут извлечь (выделить) наночастицы, а также более крупные частицы пыли с поверхности кожных покровов, отсутствуют, но могут быть технические трудности с извлечением наночастиц в представительных пропорциях, в частности с кожи. Это может быть связано с адгезией наночастиц к коже, методом отрыва ленты, типом используемой ленты или конкретными условиями сканирующего электронного микроскопа. При отрыве ленты также захватываются самые верхние фрагменты кожи. Глубина кожи, захваченной на ленте, будет варьироваться в зависимости от адгезионных свойств, применяемого давления и площади ленты, используемой для любой конкретной области [46].

Е.4 Метод in situ

Вещество визуализируют непосредственно на коже, через флуоресценцию самого вещества под длинноволновым ультрафиолетовым светом (УФ-анализ). Это существенно ограничивает тип частиц, которые могут быть обнаружены, потому что многие вещества не флуоресцируют, а методы мониторинга флуоресценции предназначены для исследования моделей воздействия, а не для повседневного мониторинга рабочего места. Данный метод не позволяет увидеть отдельные наночастицы на коже, но макроматериалы заметны, и не может определить размер частиц, так как он представляет собой широкомасштабную визуализацию кожи. Преимущество метода in situ заключается в том, что наблюдаются объемные наночастицы на том участке коже, на котором они локализованы и каким образом взаимодействуют (собираются, агломерируют, распадаются и т.д.) точно так же, как во время воздействия на рабочем месте.

Количественное определение на коже по массе затруднено, поскольку флуоресценция кожи влияет на флуоресцентную реакцию поверхностного загрязнения. Но если опасность, создаваемая наночастицами при контакте с кожей, пропорциональна площади загрязненной кожи, гораздо более простым методом оценки флуоресценции будет измерение площади поверхности загрязненной кожи, а не площади поверхности наночастиц или массы на коже. Первоочередным вопросом является решение относительно наличия/отсутствия загрязнения кожи, что является критической проблемой, возникающей в результате анализа изображений, как правило, нуждающихся в четком разграничении между загрязненной и незагрязненной кожей.

В соответствии с [47] необходимо, чтобы будущие методы анализа воздействия на кожные покровы были способны количественно определять площадь загрязненной поверхности, а также само загрязнение и таким образом создавать контурную диаграмму поверхностной нагрузки по отношению к площади поверхности, с помощью которой можно было бы качественнее оценить последствия воздействия на кожу. Это будет применяться, в частности, к наночастицам, потому что площадь поверхности загрязненной кожи (в отличие от площади поверхности наночастиц) является важным фактором при определении опасности, которую представляют наночастицы.

Методы количественного определения загрязнения по массе варьируются в зависимости от программного обеспечения и подхода любой системы мониторинга флуоресценции. При этом используют два метода:

- откалибрована поверхностная нагрузка (масса на единицу площади). Среднюю флуоресцентную яркость измеряют по изображению с учетом известной поверхностной нагрузки, которая достигается равномерным распределением определенной массы по известным участкам кожи [48]. Предполагается, что метод количественного определения зависит от поверхностного загрязнения нелинейным образом, причем увеличение яркости снижается из-за маскирующих эффектов последовательных наложенных частиц вещества. Общую массу рассчитывают путем суммирования поверхностных изображений;

- откалибрована общая масса. Общую яркость флуоресцентного изображения суммируют по всей области изображения, имеющую известную общую массу, которая достигается путем распределения определенной массы по коже. Это известно как метод "сумма пикселей" [49]-[51].

Проведена предварительная работа по изучению эффективности всех трех методов. Подробности представлены в отчете о предварительной нормативной работе [4]. Краткое описание экспериментальной установки и полученных результатов представлено следующим образом: в качестве нанопорошка использована пыль Р25TiO2 с условным диаметром приблизительно 50 нм. Кроме того, только для работы на месте применен коммерческий солнцезащитный крем, содержащий наночастицы TiO ₂ неизвестного диаметра. Использованы различные клейкие ленты и носители, а именно: ISA ТАРЕ 2000 (ленты судебной экспертизы), съемная лента Scotch "Magic" (лента для черчения), клейкая лента на медной основе (сдерживающая лента), а также лента Agar Scientific G3348 (подходит для отбора проб и идентификации асбеста с использованием СЭМ) ¹⁾.

------------------------------

¹⁾_{Наименования продуктов являются примерами доступных на рынке подходящих продуктов. Данная информация предоставлена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой СЕН или ИСО этих продуктов.}

------------------------------

Различные клейкие ленты подвергнуты воздействию аэрозоля Р25TiO ₂ в камере (прямое осаждение). Полученные пробы просматривают в условиях высокого вакуума при помощи СЭМ в лаборатории здравоохранения и безопасности (HSL). При использовании метода удаления участок брюшка свиной кожи, полученный в течение суток после убоя, также подвергают воздействию пыли Р25TiO2 в камере, затем кожу обрабатывают с помощью различных клейких лент и просматривают при помощи СЭМ в HSL. На коже предплечья человека наблюдалась пыль после загрузки рассеивающего пыль источника испытуемым порошком над камерой. Далее отбирают две небольшие пробы посредством углеродных липких полосок и просматривают при помощи СЭМ. При использовании метода in situ пыль TiO ₂ и солнцезащитный крем для загара наносят на свиную кожу и распределяют пальцем в перчатке достаточно тонким слоем таким образом, чтобы этот слой был невидим для глаза при дневном свете. Затем кожу фотографируют в длинноволновом УФ, который выявляет области, покрытые TiO ₂, в виде более темных пятен, и при помощи программного обеспечения для анализа изображений флуоресцентного монитора SMF3 в HSL идентифицируют и измеряют загрязненные участки поверхности на различных уровнях порогового значения. Программное обеспечение FIVES измеряет яркость и не подходит для измерения "темноты", при этом простое инвертирование изображения превращает темные области в более яркие, имитирующие флуоресценцию. Установлена линейная калибровка, приравнивающая нагрузку поверхности к яркости изображения. Изменение порога при сохранении аналогичной общей демаркированной области позволило выделить последующие участки кожи, которые превысили этот порог. Изменение площади проведено для двух типов загрязнения.

Первые три из указанных выше лент пострадали от коронных разрядов в СЭМ. Медная лента в этом отношении показывает себя как пластиковые ленты, так как заряд не проводит именно клей. Углеродный носитель, с другой стороны, не повредился от заряда, и получены качественные изображения частиц. Хотя предварительная обработка, например покрытие платиной, может предотвратить зарядные эффекты в СЭМ для лент [52], имеющих непроводящий слой, предпочтительно использовать ленты, не требующие предварительной обработки. С этих позиций соответствующими являются углеродные ленты.

Малый срок хранения проб также влияет на качество изображения СЭМ. Пробы после хранения исследовали другим, более современным, микроскопом, обладающим большей резкостью и разрешающей способностью. При этом клетки кожи были нечеткими. Например, было бы трудно определить распределение размера по очень морщинистой области кожи.

Давление отбора проб также оказывает влияние на отбор пробы. Специалист по промышленной гигиене, отбирающий пробу, должен нанести липкую ленту на кожу, а затем удалить ее вместе с загрязнением. Равномерное давление является важным фактором, влияющим на количество удаляемых наночастиц и кожи. По изображениям СЭМ невозможно определить, все ли наночастицы были удалены с кожи.

Для пыли критическую загрязненную площадь поверхности (ярче, чем фон кожи) трудно определить из-за естественных изменений флуоресценции кожи. Край области пыли постепенно смешивается с чистой кожей, что затрудняет разграничение загрязненной поверхности. Для крема критическая загрязненная площадь поверхности (более яркая, чем фон кожи) была лучше очерчена по краям и ее легче идентифицировать. В характеристической кривой зависимости площади поверхности от яркости в таких случаях происходит характерное "выравнивание". Площадь поверхности незначительна по сравнению с пороговыми значениями, охватывающими загрязненную зону.

Е.5 Возможное осуществление методов

Е.5.1 Возможность метода перехвата: клейкие ленты

Простым, эффективным, практичным и удобным пробоотборникам наиболее соответствуют двусторонние клейкие углеродные ленты, закрепленные на одежде или непосредственно на коже.

С их помощью проводят отбор объемных и дисперсных порошков способом, подходящим для непосредственного анализа СЭМ без предварительной обработки покрытия. Они позволяют определить распределение частиц по размерам, но не подойдут для кремов или суспензий, а также для порошков, контактирующих с кожей через "прямой контакт" [12]. При работе с ними следует избегать случайных контактов, поэтому требуется значительное экранирование подобно тому, что устроено в пассивных электростатических пробоотборниках для пыли [53].

Низкая проводимость других пробоотборных лент привела к проблемам анализа при помощи СЭМ. До сих пор проводимость углеродных лент не сравнивалась с проводимостью кожи человека, но, если бы она была аналогичной, это стало бы эффективным пробоотборником и заменителем кожи.

Е.5.2 Возможность метода удаления: отрыв ленты

Углеродные ленты также оказались очень эффективными пробоотборниками для удаления сыпучих и дисперсных порошков, пригодными для просмотра в условиях высокого вакуума при помощи СЭМ. Образцы свиной кожи являются неудачным заменителем кожных покровов человека. В процессе промывания свиной туши после убоя можно удалить все поверхностные слои мертвых клеток, которые оставались на месте при естественном росте клеток и отслаивании чешуек кожи, что делает такие пробы непохожими на пробы, взятые у живого субъекта.

Наиболее критическим фактором, по-видимому, является давление при отборе проб, при котором происходит удаление клеток кожи под загрязнением, скрывая их от обзора при СЭМ. Легкий нажим при этом удаляет частицы загрязнения, но оставляет слой кожи под ними. Таким образом, надежность метода последовательного удаления частиц еще не известна. Пробы для анализа при помощи СЭМ можно использовать при проверке наличия загрязнений для идентификации опасности, но они не доказали свою пригодность в качестве средства количественной оценки этой опасности. Отсутствие частиц загрязнения в пробе не означает их отсутствия у субъекта.

Е.5.3 Возможность измерений in situ

Описанный метод in situ позволяет измерять площадь кожи, если используется флуоресцентное или УФ-поглощающее вещество. Практические возможности метода продемонстрированы с помощью одного конкретного устройства, но метод подходит для нескольких форм мониторинга флуоресценции in situ, даже для простых устройств, таких как УФ-боксы, для того чтобы фотографически исследовать только область кистей рук с оценкой изображений через пороговое значение. Количественная оценка поверхностной нагрузки, однако, ограничена применением специализированного оборудования. Для УФ-поглощающих материалов динамический диапазон ограничен яркостью естественной флуоресценции кожи. С флуоресцентными веществами динамический диапазон во много раз превышает естественную флуоресценцию кожи. Точность порогового значения существенно зависит от изменения флуоресценции кожных покровов под нанесенным веществом, что доказывают примеры с порошком и кремом. Втираемый крем оставляет более заметный след на загрязненном участке, чем втираемая пыль.

Общую дозу измеряют посредством калибровки суммы пикселей или поверхностной нагрузки, как правило, в виде массы на этой площади поверхности. Следует рассмотреть возможность проведения градуировки по площади поверхности частиц, а не по массе. Для этого монодисперсные наноаэрозоли могут быть нанесены на кожные покровы, сфотографированы для определения величины флуоресценции и восстановлены для определения массовой нагрузки, которая может быть преобразована в площадь поверхности частиц, предполагающую наличие монодисперсного осадка. Затем значение флуоресценции можно было бы откалибровать для областей (скорее условных) поверхности частиц, что выходит за рамки настоящего стандарта, но вполне осуществимо и предлагается в качестве возможного направления развития. Однако применимость этого метода для измерения загрязненных участков кожи ограничена исследованиями, при проведении которых могут быть устранены другие загрязнители, которые могут повлиять на флуоресценцию кожи, поэтому данный метод наиболее соответствует при измерениях на рабочем месте.