Методические указания МУК 4.2.3586-19 "Идентификация и количественное определение новых линий ГМ кукурузы (DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG) и сои (MON87708) в пищевых продуктах по технологии TaqMan" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 ноября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.2.3586-19
"Идентификация и количественное определение новых линий ГМ кукурузы (DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG) и сои (MON87708) в пищевых продуктах по технологии TaqMan"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 ноября 2019 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий генно-инженерно-модифицированной (далее - ГМ) кукурузы DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG и сои MON87708 (ГМ-специфичной ДНК).

1.2. Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее - ПЦР-РВ) по технологии TaqMan*(1), и могут быть использованы для контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами (далее - ГМО) в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения). Поскольку возможность проведения ПЦР-РВ напрямую зависит от количества и качества ДНК, выделяемой из анализируемого продукта, при выборе метода экстракции ДНК следует руководствоваться требованиями ГОСТ Р ИСО 21571. Количество и качество выделенной ДНК может быть определено согласно ГОСТ Р 53244.

1.3. Для интерпретации результатов ПЦР-РВ и расчета содержания ГМО применен метод относительного анализа по двум калибровочным кривым.

1.4. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.5. Методические указания носят рекомендательный характер.

II. Принцип идентификации и количественного определения ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым

2.1. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:

- одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);

- другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).

2.2. Для построения калибровочных кривых должны быть использованы соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее - ССО) с известным содержанием ДНК*(2).

Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) - по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.

2.3. Количество ГМ-специфичной ДНК (рис. 2.1) и таксон-специфичной ДНК (рис. 2.2) в пробах определяется путём линейной интерполяции по соответствующим калибровочным кривым.

2.4. Содержание ГМО в пробе представляет собой отношение ГМ-специфичной ДНК к таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах. Расчет производят по формуле:

III. Методы идентификации и количественного определения линий ГМ кукурузы

3.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии DAS-40278-9 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события DAS-40278-9, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген hmg, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (high mobility group, HMG).

3.1.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 200 нг ДНК кукурузы.

3.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.1-3.4.

Примечание. Для определения кукурузы линии DAS-40278-9 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

Таблица 3.1

Количество геномных копий ГМ-кукурузы*(3) в растворах ДНК, используемых для построения калибровочных кривых

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1, 10% (получен из 10% ССО*)	Раствор 2, (получен путем 5-кратного разбавления Раствора 1)	Раствор 3, (получен путем 5-кратного разбавления Раствора 2)	Раствор 4, (получен путем 5-кратного разбавления Раствора 3)
Общее содержание ДНК в реакции, нг	200	40	8	1,33
Референсный ген кукурузы hmg, копии	73394	14679	2936	489
Трансформационное событие DAS-40278-9, копии	7339	1468	294	49

______________________________

* Для приготовления раствора может быть использован 10% ССО, кат. N ERM-BF433d.

Таблица 3.2

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие DAS-40278-9
Прямой праймер	DAS-40278-9_5'-fl	5' CAC GAA CCA TTG AGT TAC AAT C 3'	22
Обратный праймер	DAS-40278-9_5'-r3	5' TGG TTC ATT GTA TTC TGG CTT TG 3'	23
TaqMan-зонд	DAS-40278-9_5'-S2	5' 6FAM-CGT AGC TAA CCT TCA TTG TAT TCC G -TAMRA 3'	25
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы hmg
Прямой праймер	MaiJ-F	5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA 3'	23
Обратный праймер	mhmg-R	5' GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС Т 3'	22
TaqMan-зонд	mhmg-P	5' 6FAM-CAA ТСС АСА САА ACG CAC GCG TA-TAMRA 3'	23

Таблица 3.3

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК, DAS-40278-9
Реакционная смесь*	1х	12,50
Праймер DAS-40278-9_5'-f1 (10 мкМ)	350 нМ	0,875
Праймер DAS-40278-9_5'-r3 (10 мкМ)	350 нМ	0,875
Зонд DAS-40278-9_5'-S2 (10 мкМ)	150 нМ	0,375
Вода деионизированная	-	5,375
Образец ДНК	-	5
Итого:		25 мкл
Таксон-специфичная ДНК, hmg
Реакционная смесь*	1х	12,50
Праймер MaiJ-F (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер mhmg-R (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд mhmg-P (10 мкМ)	180 нМ	0,45
Вода деионизированная	-	5,55
Образец ДНК	-	5
Итого:		25 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу Joint Research Centre (Объединённый Научный Центр Европейского Союза, далее - JRC), для количественного определения трансформационного события DAS-40278-9. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 3.4

Температурно-временной режим амплификации*(4)

Стадия	Температура, °С	Время, с	Детекция	Циклы
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	45
	60	60	да

3.2. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MZIR098 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MZIR098, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген adhl, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1.

3.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 200 нг ДНК кукурузы.

3.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.5-3.8.

Примечание. Для определения кукурузы линии MZIR098 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

Таблица 3.5

Количество геномных копий ГМ-кукурузы*(5) в растворах ДНК, используемых для построения калибровочных кривых

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1, 10%	Раствор 2, 5%	Раствор 3, 1%	Раствор 4, 0,5%	Раствор 5, 0,07%
1	2	3	4	5	6
Общее содержание ДНК, нг	250	250	250	250	250
Содержание ДНК трансформационного события MZIR098, нг	25	12,5	2,5	1,25	0,175
Содержание немодифицированной ДНК, нг	225	237,5	247,5	248,75	249,825
Количество геномных копий кукурузы, копии	100000	100000	100000	100000	100000
Содержание ДНК трансформационного события MZIR098, копии	10000	5000	1000	500	70
Содержание ДНК трансформационного события MZIR098, %	10	5	1	0,5	0,07

______________________________

* Для приготовления раствора может быть использован 99% ССО, кат. N AOCS 1114-B.

Таблица 3.6

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MZIR098
Прямой праймер	MZIR098-f	ATCTCAGACACCAAACCGAGATC	23
Обратный праймер	MZIR098-r	ACACCGTTAGGCTAGTGCCAGT	22
TaqMan-зонд	MZlR098-p	6-FAM-CAAGTGACAGCGAAC GGAGCTGGTTT-BHQ-1	26
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы adh1
Прямой праймер	Zm adhl-F	CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC	23
Обратный праймер	Zm adhl-R	CCACTCCGAGACCCTCAGTC	20
TaqMan-зонд	Zm adhl-P	FAM-AATCAGGGCTCATTT TCTCGCTCCTCA - RTQ-1	27

Таблица 3.7

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер MZIR098-f (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер MZlR098-r (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд MZIR098-p (10 мкМ)	100 нМ	0,25
Вода деионизированная	-	5,75
Образец ДНК	-	5
Итого:		25 мкл
Таксон-специфичная ДНК
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер Zm adhl-F	300 нМ	0,75
Праймер Zm adhl-R	300 нМ	0,75
Зонд Zm adhl-P	200 нМ	0,50
Вода деионизированная	-	5,50
Образец ДНК	-	5
Итого:		25 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZIR098. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 3.8

Температурно-временной режим амплификации*(6)

Стадия	Температура, °С	Время, с	Детекция	Циклы
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	40
	60	60	да

3.3. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MZHG0JG основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MZHG0JG, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген adhl, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1.

3.3.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,01% в 250 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 250 нг ДНК кукурузы.

3.3.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.9-3.12.

Примечание. Для определения кукурузы линии MZHG0JG допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

Таблица 3.9

Количество геномных копий ГМ-кукурузы*(7) в растворах ДНК, используемых для построения калибровочных кривых

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1, 10% (получен из 10% ССО)	Раствор 2, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 1)	Раствор 3, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 2)	Раствор 4, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 3)	Раствор 5, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 4)
Общее содержание ДНК кукурузы в реакции, нг	250	62,5	15,6	3,9	1,0
Количество копий гаплоидного генома кукурузы, копии	91575	22894	5723	1431	358
Трансформационное событие MZHG0JG, копии	9158	2289	572	143	36

______________________________

* Для приготовления раствора может быть использован 100% ССО, кат. N AOCS 1114-С.

Таблица 3.10

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MZHG0JG
Прямой праймер	MZHG0JG forward primer	CAA СТА GCT AGA TTA ATT AAC GCA АТС TG	29
Обратный праймер	MZHG0JG reverse primer	ATT TGT TTG CAA GGT GTG GGA	21
TaqMan-зонд	MZHG0JG probe	FAM-TTA AGT TGT СТА AGC GTC AAT TTG-BHQ	24
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы adhl
Прямой праймер	Zm adhl primer F	CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC	23
Обратный праймер	Zm adhl primer R	CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC	20
TaqMan-зонд	Zm adhl probe	VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA	27

Таблица 3.11

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер MZHG0JG forward prime (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер MZHG0JG reverse primer (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд MZHG0JG probe (10 мкМ)	100 нМ	0,25
Вода деионизированная	-	5,75
Образец ДНК	-	5
Итого:		25 мкл
Таксон-специфичная ДНК
Реакционная смесь*	1х	12,5
Праймер Zm adhl primer F (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Праймер Zm adhl primer R (10 мкМ)	300 нМ	0,75
Зонд Zm adhl probe (10 мкМ)	200 нМ	0,50
Вода деионизированная	-	5,5
Образец ДНК	-	5
Итого:		25 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZHG0JG. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 3.12

Температурно-временной режим амплификации*(8)

Стадия	Температура, °С	Время, с	Детекция	Циклы
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	40
	60	60	да

IV. Метод идентификации и количественного определения ГМ сои линии MON87708

4.1. Метод идентификации и количественного определения сои линии MON87708 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87708, расположенная на границе геномной ДНК сои и генно-инженерной генетической конструкции;

- таксон-специфичная для сои целевая последовательность - ген lel, кодирующий лектин.

4.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК сои; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,085% в 200 нг ДНК сои.

4.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 4.1-4.4.

4.2.3. Для определения сои линии MON87708 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.

Таблица 4.1

Количество геномных копий ГМ-сои*(9) в растворах ДНК, используемых для построения калибровочных кривых

Показатель	Концентрация ДНК в растворе
	Раствор 1, 10% (получен из 10% ССО)	Раствор 2, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 1)	Раствор 3, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 2)	Раствор 4, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 3)	Раствор 5, (получен путем 4-кратного разбавления Раствора 4)
Общее содержание ДНК в реакции, нг	200	50	12,52	3,13	1,04
Референсный ген сои lel, копии	176991	44248	11062	2765	922
Трансформационное событие MON 87708, копии	17699	4425	1106	277	92

______________________________

* Для приготовления раствора может быть использован 100% ССО, кат. N AOCS 0311-A.

Таблица 4.2

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов

Олигонуклеотиды	Название	Последовательность (5'-3')	Длина, н.п.
Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MON87708
Прямой праймер	MON87708 primer 1	5' - TCA TAC TCA TTG CTG АТС CAT GTA G - 3'	25
Обратный праймер	MON87708 primer 2	5' - AGА АСА AAT TAA CGA AAA GAC AGA ACG - 3'	27
TaqMan-зонд	MON 87708 probe	6-FAM 5' - TCC CGG ACT TTA GCT CAA AAT GCA TGT A - 3' TAMRA	28
Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген сои lel
Прямой праймер	lec F	5' - CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC - 3'	20
Обратный праймер	lec R	5' - GAA GGC AAG CCC АТС TGC AAG CC - 3'	23
TaqMan-зонд	lec P probe	6-FAM 5' - CTT СAC CTT СТА TGC CCC TGA СAC - 3' TAMRA	24

Таблица 4.3

Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)

Компонент	Конечная концентрация	Объем, мкл/реакция
ГМ-специфичная ДНК
Реакционная смесь*	1х	25
Праймер MON87708 primer 1 (10 мкМ)	300 нМ	1,5
Праймер MON87708 primer 2 (10 мкМ)	300 нМ	1,5
Зонд MON87708 probe (5 мкМ)	150 нМ	1,5
Вода деионизированная	-	16,5
Образец ДНК (не более 200 нг*)	-	4
Итого:		50 мкл
Таксон-специфичная ДНК
Реакционная смесь*	1х	25
Праймер lec F (10 мкМ)	150 нМ	0,75
Праймер lec R (10 мкМ)	150 нМ	0,75
Зонд lec P probe (5 мкМ)	50 нМ	0,50
Вода деионизированная	-	19
Образец ДНК (не более 200 нг)	-	4
Итого:		50 мкл

______________________________

* Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MON87708. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 4.4

Температурно-временной режим амплификации*(10)

Стадия	Температура, °С	Время, с	Детекция	Циклы
Активация урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ)	50	120	нет	1
Предварительная денатурация	95	600	нет	1
Амплификация	95	15	нет	45
	60	60	да

Библиографические ссылки

1. ГОСТ Р 53244 (ИСО 21570). Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот. М.: Стандартинформ, 2009. 60 с.

2. ГОСТ Р ИСО 21571. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот.

3. Arumuganathan К., Earle E.D., 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9: 208-218.

4. Event-specific Method for the Quantification of maize DAS-40278-9 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/2012-08-15_EURL-VL-10-10%20VM_JRC76621.pdf

5. Event-specific Method for the Quantification of maize MZHG0JG by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-04-16-VM.pdf

6. Event-specific Method for the Quantification of maize MZIR098 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx

7. Event-specific Method for the Quantification of soybean MON87708 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02-11_VM.pdf

8. Seifi M., Ghasemi A., Heidarzadeh S., Khosravi M., Namipashaki A., Soofiany V.M. et al. Overview of real-time PCR principles. In: Polymerase chain reaction/ed. by Hernandez-Rodriguez P. Rijeka, Croatia: InTech, 2012. 566 р.

______________________________

*(1) Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченого флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы; при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.

*(2) Могут использоваться ССО Института контрольных материалов и измерений (Institute for Reference Materials and Measurements (JRC-IRMM), ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (American Oil Chemists Society; AOCS) или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.

*(3) Из расчета массы генома кукурузы, равной 2,725 пкг.

*(4) Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события DAS-40278-9. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

*(5) Из расчета массы генома кукурузы, равной 2,5 пкг.

*(6) Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZIR098. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

*(7) Из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг.

*(8) Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZHG0JG. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

*(9) Из расчета массы генома сои, равной 1,13 пкг

*(10) Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MON87708. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова