Методические указания МУК 4.1.3573-19 "Методика измерений массовой концентрации 4-(2,3-дихлорфенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты этилметилового эфира (фелодипин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 октября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.1.3573-19
"Методика измерений массовой концентрации 4-(2,3-дихлорфенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты этилметилового эфира (фелодипин) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 октября 2019 г.)

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 205-22/RA.RU.311787-2016/2016.

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации фелодипина в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,025-0,25 .

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий Роспотребнадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научных и других организаций, осуществляющих исследования содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

II. Характеристика вещества

2.1. Физико-химические свойства фелодипина.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 384,25.

Регистрационный номер CAS: 72509-76-3.

Фелодипин - белый или светло-желтый кристаллический порошок с температурой плавления 142-145°С, не гигроскопичен, практически нерастворим в воде, растворим в метаноле, дихлорметане, ацетоне, умеренно растворим в этаноле и диметилсульфоксиде.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика фелодипина:

- сердечно-сосудистое антигипертензивное средство, относится к группе антагонистов кальция ("блокаторы кальциевых каналов"), к подгруппе производных 1,4-дигидропиридина;

- умеренно опасен при поступлении внутрь, обладает общетоксическим действием при ингаляционном поступлении.

III. Метрологические характеристики

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации фелодипина метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики методики

Диапазон измерений массовой концентрации фелодипина,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,025-0,10 вкл.	18	4	6	11	15
Св. 0,10 до 0,25 вкл.	13	2	3	5,5	7

IV. Метод измерений

4.1. Измерение массовой концентрации фелодипина выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении фелодипина и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией фелодипина с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации фелодипина в анализируемой пробе.

Измерение проводят при длине волны 360 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое содержание фелодипина в анализируемом объеме пробы - 0,05 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации фелодипина в воздухе - 0,025 (при отборе 200 воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления лекарственных форм на основе фелодипина. Измерению не мешают вспомогательные вещества: лактозы моногидрат, целлюлоза микрокристаллическая, гипромеллоза, макрогола стеарат, повидон, магния стеарат, кремния диоксид коллоидный безводный, титана диоксид, тальк, пропиленгликоль.

V. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

5.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостный с ультрафиолетовым детектором, с термостатом колонки и соответствующей системой сбора данных
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале 1-100 мг, цена деления шкалы 1 мг, погрешность взвешивания по шкале мг	ГОСТ OIML R 76-1
Аспирационное устройство двухканальное с диапазоном расхода 2,0-20 и пределом допустимой погрешности	ТУ 4215-000-11696625
Колбы мерные, 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770
Пипетки, 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, П-2-10-14/23 ХС	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные, 3-500, 1-1000	ГОСТ 1770
Микрошприц для хроматографии вместимостью 0,10	ТУ 4215-002-84030495
Иономер лабораторный с пределом рН от -1 до +19 ед.	ГОСТ 22261

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.2. Реактивы

Фелодипин с содержанием основного вещества не менее 98,0% в пересчете на сухое вещество	НД П NO13870/01-291211
Метиловый спирт, х.ч.	ГОСТ 6995
Ацетонитрил, о.с.ч.	ТУ 6-09-14-2167
Калий фосфорнокислый однозамещенный, х.ч.	ГОСТ 4198
о-Фосфорная кислота, х.ч., 85% раствор, плотность	ГОСТ 6552
Вода дистиллированная	ГОСТ Р 58144
Вода, о.с.ч.	ТУ 6-09-2502

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая, размером 100 мм х 4,6 мм, заполненная сорбентом С18 с размером частиц 3,5 мкм
Аналитические аэрозольные фильтры гидрофобные на основе перхлорвинила с площадью рабочей поверхности 10	ТУ 95-1892
Фильтродержатели	ТУ 95 1021
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723
Бюксы стеклянные	ГОСТ 25336
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336
Воронки химические	ГОСТ 25336
Дистиллятор	ГОСТ Р 50444
Шкаф сушильный	ТУ 61-1-721
Ультразвуковая ванна	ТУ 25-7401

Примечание. Допускается применение оборудования, вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

VI. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов*.

VII. Требования к квалификации оператора

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

VIII. Требования к условиям измерений

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха	;
- атмосферное давление	(84-106) кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

IX. Подготовка к выполнению измерений

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

Приготовление растворов

9.2. Приготовление основного раствора фелодипина: основной раствор фелодипина с массовой концентрацией 500 готовят растворением г фелодипина в смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) в мерной колбе вместимостью 100 . Срок хранения раствора - в течение двух недель в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте, в холодильнике.

9.3. Приготовление рабочего раствора фелодипина N 1: рабочий раствор фелодипина N 1 с массовой концентрацией 100,0 готовят разбавлением 10,0 основного раствора фелодипина смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) в мерной колбе вместимостью 50 . Срок хранения раствора - в течение недели в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте, в холодильнике.

9.4. Приготовление рабочего раствора фелодипина N 2: рабочий раствор фелодипина N 2 с массовой концентрацией 20,0 готовят разбавлением 10,0 рабочего раствора фелодипина N 1 смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) в мерной колбе вместимостью 50 . Срок хранения раствора - в течение суток в хорошо укупоренной таре в защищенном от света месте, в холодильнике.

9.5. Приготовление смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1): в мерной колбе вместимостью 1000 смешивают 500 спирта метилового и 500 воды особо чистой с объемным соотношением (1:1). Срок хранения раствора - в течение месяца в холодильнике.

9.6. Приготовление фосфатного буферного раствора с Рн 3,0: в мерной колбе вместимостью 1000 растворяют 6,81 г калия фосфорнокислого однозамещенного в воде особо чистой, доводят объем водой особо чистой до метки и перемешивают. Устанавливают рН раствора равным путем прибавления концентрированной о-фосфорной кислоты с потенциометрическим контролем. Срок хранения раствора - в течение месяца в холодильнике.

9.7. Приготовление подвижной фазы: смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора с рН 3 с объемным соотношением (40:60). В мерной колбе вместимостью 1000 смешивают 400 ацетонитрила и 600 фосфатного буферного раствора с рН 3,0. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют, используя ультразвуковую ванну в течение 15 минут. Срок хранения раствора - в течение недели в хорошо укупоренной таре, в защищенном от света месте, в холодильнике.

Подготовка хроматографа

9.8. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Установление градуировочной характеристики

9.9. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания фелодипина в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора N 0 согласно табл. 2.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении фелодипина

Номер градуировочного раствора	Объем рабочего раствора N 1 с концентрацией фелодипина 100 ,	Объем рабочего раствора N 2 с концентрацией фелодипина 20 ,	Содержание фелодипина на фильтре, мкг	Массовая концентрация фелодипина в градуировочном растворе,	Содержание фелодипина в анализируемом объеме градуировочного раствора, мкг
0*	0,00	0,00	0,0	0,00	0,00
1	0,00	0,25	5,0	0,50	0,05
2	0,00	0,50	10,0	1,00	0,10
3	0,20	0,00	20,0	2,00	0,20
4	0,30	0,00	30,0	3,00	0.30
5	0,40	0,00	40,0	4,00	0,40
6	0,50	0,00	50,0	5,00	0,50
* - контрольный раствор. Градуировочные растворы используют свежеприготовленные

На аэрозольные фильтры, помещенные в бюксы, наносят пипеткой вместимостью 1 объемы рабочего раствора фелодипина N 1 с массовой концентрацией 100,0 и рабочего раствора фелодипина N 2 с массовой концентрацией 20,0 в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5,0 приливают по 5,0 смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 . Фильтры повторно обрабатывают 5,0 смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем до 10 смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1). Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Аналогично обрабатывают чистый аэрозольный фильтр (контрольный раствор).

Инжектируют в хроматограф по 0,1 каждого из градуировочных растворов (табл. 2) с помощью микрошприца.

По полученным данным методом абсолютной градуировки строят градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (приборные единицы) от содержания фелодипина в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

Условия хроматографирования градуировочных растворов и анализируемых проб

9.10. Условия хроматографирования градуировочных растворов и анализируемых проб:

- длина волны детектора	360 нм;
- объем вводимой пробы	0,1 ;
- температура колонки	40°С;
- расход подвижной фазы	1,0 ;

- подвижная фаза: смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора с рН 3 с объемным соотношением (40:60).

- время удерживания фелодипина

не менее мин.

Контроль стабильности градуировочной характеристики

9.11. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора). Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.9 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где (1)

, - значение площади пика (приборные единицы) фелодипина в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике, соответственно;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное хроматографирование этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна, условие (1) не выполняется для двух или более образцов градуировочных растворов, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов (табл. 2) для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики её устанавливают заново.

Отбор проб воздуха

Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и приложения 9 к Р 2.2.2006-05.

Одновременно отбирают две пробы. При отборе проб фиксируется температура воздуха и атмосферное давление.

Воздух с объемным расходом 20 аспирируют через аналитический аэрозольный фильтр с площадью рабочей поверхности 10 , помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации фелодипина на уровне 0,025 отбирают не менее 200 воздуха в течение 10 минут.

Срок хранения отобранных проб в бюксах - в течение суток в защищенном от света месте, в холодильнике.

X. Выполнение измерения

10.1. Аэрозольный фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, с помощью пипетки вместимостью 5 приливают 5 смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1), периодически помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 15 минут для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 . Фильтр повторно обрабатывают 5 смеси для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1), оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до 10 смесью для растворения: спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1). Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Хроматографический анализ проб выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой анализируемой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Устанавливают содержание фелодипина (в мкг) в анализируемом объеме пробы по градуировочной характеристике (п. 9.9).

Примечание. Фильтрование анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в смеси для растворения - спирт метиловый и вода особо чистая с объемным соотношением (1:1) - вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственных форм фелодипина.

XI. Вычисление результатов измерений

11.1. Массовую концентрацию фелодипина в воздухе рабочей зоны С, вычисляют по формуле:

, где (2)

а - содержание вещества в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем пробы, ;

б - анализируемый объем пробы, ;

- объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1 к настоящим методическим указаниям).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где (3)

, - результаты параллельных определений массовой концентрации фелодипина в воздухе рабочей зоны, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики.

XII. Оформление результатов измерений

12.1. Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, ;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация фелодипина менее 0,025 (более 0,25 )".

XIII. Контроль результатов измерений

Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сравнительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле (4):

, где (4)

, - средние значения массовой концентрации фелодипина, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднее арифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в п. 5.3.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

При разногласиях руководствуются п. 5.3.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

13.2. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6, ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показатель правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

______________________________

* ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова