Методические указания МУК 4.1.3570-19 "Методика измерений массовой концентрации 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты (лимонная кислота, лимонная кислота безводная) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 октября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.1.3570-19
"Методика измерений массовой концентрации 2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты (лимонная кислота, лимонная кислота безводная) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 октября 2019 г.)

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 205-31/RA.RU.311787-2016/2016.

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,5-10,0 .

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий Роспотребнадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научных и других организаций, осуществляющих исследования содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

II. Характеристика вещества

2.1. Физико-химические свойства лимонной кислоты.

Структурная формула:

Эмпирическая формула .

Молекулярная масса 192,13.

Регистрационный номер CAS: 77-92-9.

Лимонная кислота - белое кристаллическое вещество, без запаха, температура плавления 153°С, хорошо растворима в воде, спирте этиловом.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика лимонной кислоты:

- применяют в пищевой и фармацевтической промышленности в качестве регулятора кислотности, антиокислителя и комплексообразователя;

- при поступлении внутрь относится к умеренно опасным веществам, вызывает раздражение слизистых оболочек и кожных покровов.

III. Метрологические характеристики

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации лимонной кислоты метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики методики

Диапазон измерений массовой концентрации лимонной кислоты,	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости, r, %, P = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, , %
От 0,5 до 2,5 вкл.	22	5	8	14	20
Св. 2,5 до 10 вкл.	14	3	5	8	13

IV. Метод измерений

4.1. Измерение массовой концентрации лимонной кислоты выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении лимонной кислоты и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией лимонной кислоты с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации лимонной кислоты.

Измерение проводят при длине волны 210 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на бумажные обеззоленные плотные фильтры.

Минимально определяемое содержание лимонной кислоты в анализируемом объеме пробы - 0,25 мкг.

Нижний предел измерений массовой концентрации лимонной кислоты в воздухе - 0,5 (при отборе 500 воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе лимонной кислоты. Измерению не мешают вспомогательные вещества: метакриловой кислоты и этилакрилата сополимер (1:1), тальк, сахароза, сахар, гипролоза, гипромеллоза, триэтилцитрат, магния стеарат, глицерола моностеарат, полисорбат 80, декстроза, кросповидон, ксантановая камедь, краситель оксид железа желтый.

V. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

5.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостной с градиентной системой элюирования, ультрафиолетовым детектором, с термостатом колонки и соответствующей системой сбора данных
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале 1-100 мг, цена деления шкалы 1 мг, погрешность взвешивания по шкале мг	ГОСТ OIML R 76-1
Аспирационное устройство трехканальное с диапазоном расхода 40-200 и пределом допустимой погрешности	ТУ 4215-000-11696625
Колбы мерные, 2-50-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770
Пипетки, 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5, 1-1-2-10	ГОСТ 29227
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, П-2-10-14/23 ХС	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные, 3-500	ГОСТ 1770
Микрошприц для хроматографии вместимостью 0,01	ТУ 4215-002-84030495
Иономер лабораторный с пределом рН от -1 до +19 ед.	ГОСТ 22261

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Реактивы

Лимонная кислота безводная, с содержанием основного вещества не менее 99,5% в пересчете на сухое вещество	ГОСТ Р 53040
Ацетонитрил, осч	ТУ 6-09-14-2167
Калий фосфорнокислый двузамещенный безводный	ГОСТ 2493
Кислота ортофосфорная, 85%, чда, плотность 1,69	ГОСТ 6552
Вода дистиллированная	ГОСТ Р 58144
Вода, осч	ТУ 6-09-2502

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая, размером 250 мм х 4,6 мм, заполненная сорбентом С 18 с размером частиц 5,0 мкм
Фильтры бумажные обеззоленные плотные, диаметр 7 см	ТУ 6-09-1678
Фильтродержатели	ТУ 95 1021
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723
Бюксы стеклянные	ГОСТ 25336
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336
Воронки химические	ГОСТ 25336
Мешалка магнитная	ТУ 25-11.834
Дистиллятор	ГОСТ Р 50444
Шкаф сушильный	ТУ 61-1-721

Примечание. Допускается применение оборудования, вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

VI. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов*.

VII. Требования к квалификации оператора

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

VIII. Требования к условиям измерений

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха	;
- атмосферное давление	(84-106) кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80%.

8.2. Выполнение измерений на спектрофотометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

IX. Подготовка к выполнению измерений

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, контроль стабильности градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

Приготовление растворов

9.2. Приготовление основного раствора лимонной кислоты: основной раствор лимонной кислоты с массовой концентрацией 5 000 готовят растворением г лимонной кислоты в воде в мерной колбе вместимостью 50 . Срок хранения раствора - в течение семи суток в холодильнике.

9.3. Приготовление 0,1 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного безводного (элюент А): 13,6 г калия фосфорнокислого двузамещенного безводного помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 и растворяют в 1 000 воды особо чистой при перемешивании на магнитной мешалке. Затем по каплям добавляют концентрированную ортофосфорную кислоту, доводят рН раствора до 2,5-2,6 (рН устанавливают с помощью иономера). Полученный раствор дегазируют и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Срок хранения готового буферного раствора в герметичной стеклянной посуде - в течение двух недель в холодильнике.

9.4. Ацетонитрил (элюент Б).

9.5. Приготовление подвижной фазы: смесь 0,1 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного безводного (элюент А) и ацетонитрила (элюент Б) с объемным соотношением элюент А: элюент Б (99,9:0,1). В мерную колбу вместимостью 1 000 наливают 999 элюента А и 1 элюента Б и перемешивают. Срок хранения раствора в герметичной стеклянной посуде - в течение месяца в холодильнике.

Подготовка хроматографа

9.6. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Установление градуировочной характеристики

9.7. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания лимонной кислоты в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора N 0 согласно табл. 2.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении лимонной кислоты

N градуировочного раствора	Объем основного раствора с концентрацией лимонной кислоты 5 000 ,	Содержание лимонной кислоты на фильтре, мкг	Массовая концентрация лимонной кислоты в градуировочном растворе,	Содержание лимонной кислоты в анализируемом объеме градуировочных растворов, мкг
0*	0,00	0,0	0,0	0,00
1	0,05	250,0	25,0	0,25
2	0,10	500,0	50,0	0,50
3	0,20	1000,0	100,0	1,00
4	0,40	2000,0	200,0	2,00
5	0,60	3000,0	300,0	3,00
6	1,00	5000,0	500,0	5,00
* - контрольный раствор. Срок хранения градуировочных растворов - в течение трех дней в холодильнике

На бумажные обеззоленные плотные фильтры, помещенные в бюксы, пипеткой вместимостью 1 наносят основной раствор лимонной кислоты с массовой концентрацией 5 000 в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5 приливают по 5 воды особо чистой и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 . Фильтры повторно обрабатывают 5,0 воды особо чистой и оставляют на 15 минут периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют.

Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем раствора до 10,0 водой особо чистой. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Аналогично обрабатывается чистый аэрозольный фильтр (контрольный раствор).

Инжектируют в хроматограф по 0,01 каждого из градуировочных растворов (табл. 2) с помощью микрошприца.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания лимонной кислоты в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

Условия хроматографирования

9.8. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб.

- Длина волны детектора	210 нм;
- Объем вводимой пробы	0,01 ;
- Температура термостата колонки	20°С;
- Расход подвижной фазы	1,0 ;

- Подвижная фаза: смесь 0,1 М раствора калия фосфорнокислого двузамещенного безводного (элюент А) и ацетонитрила (элюент Б) с объемным соотношением (99,9:0,1).

- Время удерживания лимонной кислоты минуты

Контроль стабильности градуировочной характеристики

9.9. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора). Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.7 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где (1)

, - значение площади пика (приборные единицы) лимонной кислоты в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное хроматографирование этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна, условие (1) не выполняется для двух или более образцов градуировочных растворов, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов (табл. 2) для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой.

При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики её устанавливают заново.

Отбор проб воздуха

9.10. Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и приложения 9 к Р 2.2.2006-05.

Одновременно отбирают две пробы. При отборе проб фиксируется температура воздуха и атмосферное давление.

Воздух аспирируют через бумажный обеззоленный плотный фильтр диаметром 7 см, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации лимонной кислоты на уровне 0,5 (1/2 ПДК) необходимо отобрать не менее 500 воздуха в течение 12,5 минут.

Срок хранения отобранных проб в бюксах - 1 неделя в холодильнике.

X. Выполнение измерения

10.1. Бумажный обеззоленный плотный фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс и с помощью пипетки вместимостью 5 приливают 5,0 воды особо чистой, оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 . Фильтр повторно обрабатывают 5,0 воды особо чистой, оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до 10 водой особо чистой. Далее раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Хроматографический анализ проб выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой анализируемой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Устанавливают содержание лимонной кислоты (в мкг) в анализируемом объеме пробы по градуировочной характеристике (п. 9.7).

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в воде вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм лимонной кислоты.

XI. Вычисление результатов измерений

11.1. Массовую концентрацию лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны С, , вычисляют по формуле:

, где (2)

а - содержание лимонной кислоты в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

В - общий объем пробы, ;

б - анализируемый объем пробы, ;

- объем воздуха, отобранный для анализа () и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1 к настоящим методическим указаниям).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, где (3)

, - результаты параллельных определений массовой концентрации лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны, ;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

XII. Оформление результатов измерений

12.1. Результат количественного химического анализа представляют в виде:

, при P = 0,95, где

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, ;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация лимонной кислоты менее 0,5 (более 10,0 )".

XIII. Контроль результатов измерений

Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сравнительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью по формуле:

, где (4)

, - средние значения массовой концентрации лимонной кислоты, полученные в первой и второй лабораториях, ;

- значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднее арифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в п. 5.3.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

При разногласиях руководствуются п. 5.3.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории

13.2. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6, ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показатель правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

______________________________

* ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова