Приложение Г (обязательное). Выращивание маточной культуры микроводоросли Chlorella vulgaris

Приложение Г
(обязательное)

Выращивание маточной культуры микроводоросли Chlorella vulgaris

Г.1 Исходную культуру микроводоросли Chlorella vulgaris с паспортом можно получить в учреждениях, специализирующихся на ведении культур микроводорослей. Далее в лаборатории выращивают маточную культуру микроводоросли на питательной среде Тамия согласно таблице Г.1 с добавлением микроэлементов (магния, цинка, молибдена, ванадия, меди), состав которых приведен в таблице Г.2.

Культуру микроводоросли выращивают на 25%-ной питательной среде Тамия, получаемой четырехкратным разбавлением 100%-ной среды Тамия.

Таблица Г.1 - Состав искусственной питательной среды Тамия

Компонент среды	Концентрация компонента в 100%-ной среде Тамия,	Концентрация компонента в 2%-ной среде Тамия,	Масса компонентов среды Тамия для приготовления концентрированных растворов в 200 дистиллированной воды, г	Объем концентрированных растворов для приготовления 100%-ной среды Тамия в 1 дистиллированной воды,
Калий азотнокислый	5,0	0,1	20	50
Магния сульфат 7-водный	2,5	0,05	10	50
Калия дигидрофосфат	1,25	0,025	5	50
Железо лимоннокислое	0,003	0,00012 (120 мкг)	0,6 (растворять при кипячении)	2

Таблица Г.2 - Состав растворов микроэлементов, добавляемых в питательную среду Тамия

Раствор микроэлементов	Компоненты растворов	Масса компонентов для приготовления концентрированных растворов микроэлементов в 250 дистиллированной воды, мг	Объем концентрированных растворов микроэлементов для приготовления 100%-ной среды Тамия в 1 дистиллированной воды,
А	Кислота борная	715	2
	Марганец хлористый 4-водный	453
	Цинка сульфат 7-водный	64
Б	Молибдена окись	4,41	2
	Метаванадат аммония	5,74
Примечание - Раствор Б готовят при нагревании. Затем отдельно каждый раствор стерилизуют кипячением 30 мин, охлаждают и хранят в холодильнике.

Г.2 Питательную среду Тамия и растворы всех микроэлементов готовят на основе дистиллированной воды. При регулярном использовании питательную среду удобнее готовить не из навесок, а из их концентрированных растворов (см. таблицы Г.1 и Г.2). При приготовлении 1 100%-ной питательной среды Тамия эти растворы последовательно вносят в указанном объеме в 0,5 дистиллированной воды. Затем добавляют заранее приготовленные растворы микроэлементов и лимоннокислого железа, а общий объем среды доводят дистиллированной водой до 1 . Растворы компонентов среды и микроэлементов, а также приготовленную питательную среду хранят в холодильнике при температуре от 2°С до 4°С не более 3 мес.

Засев микроводоросли в культиватор КВ-05 производят с начальной оптической плотностью (0,010+0,001) отн. ед. Для этого в 25%-ной питательной среды, приготовленной путем разбавления 100%-ной среды Тамия дистиллированной водой, вносят культуры микроводоросли с оптической плотностью отн. ед., профильтрованной через 4 слоя марли или вату. После ч культивирования оптическая плотность культуры микроводоросли должна достигнуть величины 1,200-1,500 отн. ед В этом состоянии культура микроводоросли имеет хорошую чувствительность к токсикантам. Измерения оптической плотности проводят после разбавления культуры. Для этого в пенициллиновый флакон вносят 1 выросшей культуры микроводоросли и 5 дистиллированной воды. Полученное значение оптической плотности умножают на 6, чтобы учесть проведенное разбавление культуры.

Маточную культуру микроводоросли поддерживают при регулярном пересеве (через каждые 2 сут) в свежую среду Тамия. Такой режим культивирования позволяет без соблюдения условий стерильности поддерживать альгологически чистую культуру микроводоросли. При перерывах в работе свежевыращенную культуру микроводоросли можно хранить в холодильнике при температуре от 2°С до 4°С до 4 мес.

При возобновлении работ по биотестированию хранящуюся культуру микроводоросли следует засеять указанным выше способом и использовать для биотестирования не ранее, чем через 2 сут выращивания в культиваторе КВ-05.