Методические указания МУ 1.2.3699-21 "Подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию предельно допустимых концентраций наночастиц в воздухе рабочей зоны" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 августа 2021 г.)

Методические указания МУ 1.2.3699-21
"Подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию предельно допустимых концентраций наночастиц в воздухе рабочей зоны"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 августа 2021 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) определяют подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию предельно допустимых концентраций (далее - ПДК) наночастиц (далее - НЧ) в воздухе рабочей зоны.

1.2. МУ предназначены для специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научными организациями, проводящими экспериментально-токсикологическое обоснование ПДК НЧ в воздухе рабочей зоны.

II. Общие положения

2.1. Унификация подходов к экспериментально-токсикологическому обоснованию ПДК НЧ в воздухе рабочей зоны требуется как в связи с производством и использованием искусственных наноматериалов с заданными свойствами, так и потому, что аэрозольное загрязнение воздуха рабочей зоны существующими технологическими процессами (металлургии сталей, ферросплавов, цветных металлов и их сплавов, а также электродуговой сварки, лазерной обработки металлов и др.) включает значительную фракцию частиц наноразмерного диапазона.

2.2. Накопленные научные данные о биологической активности наноразмерных частиц свидетельствуют о существенных количественных и качественных особенностях токсического действия НЧ по сравнению с микрометровыми частицами.

2.3. Проведению токсикологических исследований предшествует изучение химического состава и размерных характеристик изучаемых НЧ, кинетики их агрегации, растворимости в различных биосредах (например, в надосадочной жидкости бронхоальвеолярного лаважа и стерильной бычьей сыворотке или ее аналоге).

III. Экспериментальные модели по обоснованию предельно допустимых концентраций наночастиц в воздухе рабочей зоны

Экспериментальные модели

3.1. В рамках каждой экспериментальной модели, рассматриваемой в данных МУ, сравниваемые группы животных формируются рандомизированной выборкой из общего стада и содержатся в одинаковых контролируемых условиях, а исследования на них проводятся параллельно. Для оценки сдвигов состояния организма и отдельных его систем, вызванных интоксикацией, служит сравнение с величинами, измеренными в группе контрольных животных.

Для исследования необходимо использовать молодых здоровых особей, предпочтительно крыс. В случае использования других видов лабораторных животных необходимо привести обоснование. Основные правила содержания и ухода определены в ГОСТ 33215, а также должны согласовываться с этическим комитетом организации (учреждения).

Математическая оценка статистической значимости межгрупповых различий проводится с поправкой на множественность сравнения.

Ускоренные подходы, основанные на неингаляционных токсикологических экспериментах

3.2. Для сравнительной оценки действия на организм НЧ и микроразмерных частиц (далее - МЧ) должны использоваться как минимум две экспериментальные модели.

3.2.1. Первая модель даёт количественную характеристику реакции глубоких дыхательных путей на одноразовое отложение частиц по цитологическим и биохимическим показателям жидкости, получаемой при бронхо-альвеолярном лаваже (далее - БАЛЖ) через 24 часа после интратрахеальной инстилляции 1 мл свежеприготовленной суспензии, содержащей 0,2-0,5 мг НЧ или МЧ в стерильной деионизированной воде, или 1 мл той же воды без частиц (контроль). Информативными показателями указанной реакции при световой микроскопии отцентрифугированного осадка БАЛЖ служат увеличение показателей общей клеточности, числа эозинофилов, альвеолярных макрофагов (далее - АМ) и нейтрофильных лейкоцитов (далее - НЛ) и особенно соотношения между ними (НЛ/АМ), а при биохимическом анализе - увеличение концентрации белка и некоторых ферментов (например, лактатдегидрогеназы, гамма-глютамилтранспептидазы, амилазы).

3.2.2. Вторая модель основана на развитии субхронической интоксикации при повторных введениях (внутрижелудочных или парентеральных) малых доз тех же суспензий. Рекомендуемый способ введения - внутрибрюшинный. Разовая доза подбирается по имеющимся литературным данным или в пилотном эксперименте при однократном введении, после которого состояние организма, оцененное по сдвигам базовых функциональных показателей, не складывается в клиническую картину тяжёлой интоксикации. В основном эксперименте инъекции повторяются 3 раза в неделю на протяжении 4-6 недель и умерщвление животных перерезкой шейного сосудистого пучка производится через сутки после завершающей инъекции.

3.3. Для оценки сдвигов состояния организма и отдельных его систем, вызванных интоксикацией, служит сравнение с контрольными величинами, измеренными в группе животных, получавших инъекции той же стерильной деионизированной воды, на которой готовятся суспензии. Используется обычный набор интегральных показателей развития экспериментальной интоксикации, а при наличии в составе частиц химических элементов с известным токсическим действием также и соответствующие специфические показатели (например, нарушения порфиринового синтеза и кроветворения при действии свинецсодержащих НЧ). Следует учитывать не только химически обусловленную специфичность, но и эффекты, особо выраженные при действии именно НЧ (но менее выраженные или вообще не выявляемые при действии их химических МЧ-аналогов). Прежде всего это показатели гепатотоксичности, спленотоксичности и нефротоксичности, а также полиорганной генотоксичности, которые присущи практически всем изученным НЧ.

Также должно быть исследовано содержание НЧ (или соответствующего химического элемента) в основных органах вторичного накопления любых НЧ, проникших в кровоток (печень, селезёнка), в почках как органе выделения растворившихся НЧ; а также в тех органах, токсическое поражение которых специфично для рассматриваемого НЧ - образующего химического элемента. На завершающем этапе исследования проводится описательная и морфометрическая характеристика гистопатологических нарушений в перечисленных органах, выявляемых при световой и желательно электронной микроскопии.

Все определения осуществляются с применением аттестованных методов, а при их отсутствии - со ссылкой на авторитетные литературные источники.

3.4. Для тех НЧ, химические аналоги которых в виде МЧ имеют ранее установленные гигиенические нормативы ПДК в воздухе рабочей зоны, величина ПДК может быть дана исходя из результатов сравнительной токсикологической оценки соответствующих НЧ и МЧ в кратковременных экспериментах на лабораторных животных. В случае выявления более существенной токсичности НЧ величина ПДК, установленная для МЧ данного вещества, должна быть снижена. Конкретное значение понижающего коэффициента выбирается экспертно в зависимости от числа эффектов действия частиц и величины выявленной разницы, а также с учётом биологической значимости соответствующих эффектов, но ориентировочная оценка этого коэффициента может быть дана исходя из соотношения параметров токсичности НЧ и МЧ при разных путях введения в организм (табл.).

Таблица

Определение коэффициента пересчета от к в соответствии с вариантом проявления токсичности

Номер варианта	Соотношение токсичности нано- и микрочастиц при соответствующих путях введения			Коэффициент пересчёта
	внутрижелудочный	внутрибрюшинный	интратрахеальный
1	г/кг			1
2		Тн > Тм		10
3	Тн > Тм	Тн > Тм	Тн > Тм	50
Примечание: Тн - токсичность НЧ; Тм - токсичность МЧ; - знак приблизительно равно.

3.5. Для тех НЧ, которые не имеют химических аналогов микрометрового диапазона с ранее установленными гигиеническими нормативами, может быть реализован тот же сравнительный токсикологический подход с использованием МЧ, относительно близких к таким НЧ по химическому составу и токсическим свойствам. Например, для НЧ магнетита , который не имеет ПДК в форме МЧ, образцом сравнения могут служить МЧ другого оксида железа , имеющего установленную ПДК; для углеродистых нанотрубок - образцы неволокнистого технического углерода, для которых имеются величины ПДК. В отдельных случаях дополнительный микрометровый образец сравнения может подбираться исходя из сходства не химического состава, а особой геометрии частиц (например, для тех же нанотрубок - хризотил-асбест).

По мере увеличения числа НЧ с уже обоснованными величинами ПДК из этого числа также могут выбираться образцы сравнения для оценки новых НЧ.

3.6. В качестве основы для ускоренного обоснования ПДК НЧ в воздухе рабочей зоны предлагается использовать также формулы для расчета ПДК аэрозолей металлов, приведенные в методических документах*:

(1)

и для аэрозолей окислов и других соединений металлов:

, где (2)

- смертельная доза для 50% мышей или крыс при внутрибрюшинном введении и недельном периоде наблюдения, выраженная в миллиатомах на килограмм веса;

N - число атомов металла в молекуле вещества;

М - молекулярный вес.

Подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию ПДК НЧ в воздухе рабочей зоны, основанные на ингаляционных токсикологических экспериментах

3.7. ПДК НЧ в воздухе рабочей зоны обосновывается как средне-сменная концентрация в результате установления пороговой концентрации НЧ в хроническом ингаляционном эксперименте.

3.8. Ингаляционная экспозиция животных проводится в установках типа "только нос" во избежание нереспираторного пути попадания токсического вещества в организм. Параллельно проводится "ложная экспозиция" животных контрольной группы в "пеналах" - ограничителях подвижности ("рестрейнерах") - идентичной ингаляционной установки, питаемой равным по объёму потоком чистого воздуха. Необходимость ограничения подвижности животного снижает возможную продолжительность разовой экспозиции (не более 4 часов).

3.9. Конструкция установки типа "только нос", а также её аэродинамические характеристики и объёмы воздуха, подаваемого в общее рабочее пространство и удаляемого из него, должны обеспечить:

а) быстрое достижение равновесного уровня заданной концентрации НЧ;

б) совпадение средних концентраций во всех точках подсоединения животных.

3.10. В процессе проведения эксперимента на животных в предварительно выбранных репрезентативных точках рабочего пространства установки непрерывно отбираются аспирационные пробы НЧ на фильтры, тип которых, как и методы измерения массы и геометрических характеристик задержанных НЧ (формы, распределение по размерам), выбираются с учётом химической природы и физических свойств этих НЧ. Вместе с концентрацией НЧ обеспечивается также автоматический контроль температуры и влажности воздуха в пределах, являющихся физиологическими для данного вида животных.

3.11. Общую продолжительность хронического ингаляционного воздействия для установления рекомендуется принимать равной 4 месяцам. При этом такая продолжительность рассматривается как минимально необходимая, принимая во внимание, что средняя продолжительность жизни крысы равна 30 месяцам, и, таким образом, 4-месячный срок составляет всего 13% от этой продолжительности. Между тем трудовой период жизни человека, даже сокращенный в производствах с вредными условиями труда, составляет значительно большую часть всей его жизни, поэтому надёжность оценки экспериментальной хронической ингаляционной экспозиции как безопасной будет выше при проведении экспериментов продолжительностью 6-8 месяцев (при рассмотрении вопроса о коэффициенте запаса см. п. 3.15).

В пределах общего периода экспозиции необходимо предусмотреть промежуточные сроки выведения из эксперимента животных для определения кинетики задержки НЧ в организме и показателей его состояния. В те же сроки аналогичные исследования проводятся у крыс, выводимых из контрольной (ложноэкспонированной) группы.

3.12. Хронический ингаляционный эксперимент проводится параллельно предпочтительно при 2-3 концентрациях НЧ, поскольку это повышает надёжность выбора одной из них в качестве пороговой. Однако техническая сложность и высокая стоимость выполнения рассмотренных выше условий такого эксперимента может сделать практически возможным его проведение только на одном уровне воздействия. В этом случае рекомендуется ориентироваться на концентрацию в 2-3 раза выше той, которая была предварительно обоснована в неингаляционном эксперименте (п.п. 3.2-3.6).

3.13. Оценка эффектов хронического ингаляционного воздействия НЧ проводится по тем же принципам, что и эффектов субхронического внутрибрюшинного (см. п. 3.2.2), с обязательным дополнением определения задержки НЧ и вызываемых ими патологических изменений в лёгких, в лёгочно-ассоциированных лимфоузлах и в ольфакторной области головного мозга.

3.14. При проведении хронического эксперимента с использованием одной экспозиционной концентрации НЧ наличие статистически значимых, но не выходящих за пределы нормы сдвигов лишь нескольких из числа оцененных показателей даёт основание считать вызвавшую их концентрацию близкой к пороговой. При более существенных сдвигах и большом числе измененных показателей концентрация признается действующей и для обоснования рекомендуемой безопасной экспозиции требуется повторный эксперимент при концентрации НЧ, сниженной примерно на порядок величин. Аналогичное решение принимается в том случае, когда надпороговый характер испытываемой экспозиции наблюдается уже на ранних сроках первоначального эксперимента.

3.15. Для перехода от пороговой или близкой к пороговой концентрации НЧ к рекомендуемой величине ПДК вводится делитель ("коэффициент запаса"), значение которого определяется экспертно (с учётом числа показателей, по которым получены сдвиги, выраженности этих сдвигов и биологической важности этих показателей), но, как правило, не должно превышать 20 при 4-месячном ингаляционном эксперименте и 10 - при более продолжительном.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. МУ 4000-85 "Методические указания по установлению ориентировочных безопасных уровней воздействия вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

3. МР 1.2.0022-11 "Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами".

4. МР 1.2.0024-11 "Контроль наноматериалов, применяемых в химической промышленности".

5. МР 1.2.0037-11 "Контроль наноматериалов в воздухе".

6. МР 1.2.0038-11 "Оценка риска воздействия наноматериалов и наночастиц на организм человека".

7. МР 1.2.0052-11 "Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета".

8. МР 1.2.0054-11 "Порядок и методы оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на токсическое действие химических веществ".

9. ГОСТ 33215 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными".

10. Глушкова А.В., Радилов А.С., Дулов С.А. Особенности проявления токсичности наночастиц//Гигиена и санитария. N 2. 2011. С. 81-86.

11. Глушкова А.В., Радилов А.С., Дулов С.А., Хлебникова Н.С. "Сравнительные подходы к оценке риска и гигиенического регламентирования наноматериалов в России и Евросоюзе (на примере Норвегии)". Токсикологический вестник. N 6. 2016. С. 31-35.

12. Глушкова А.В., Радилов А.С., Дулов С.А. Особенности проявления токсичности наночастиц//Гигиена и санитария. 2011. N 2. С. 81-86.

13. Дулов С.А., Земляной А.В., Варлашова М.Б., Глушкова А.В. и др. Применение углеродсодержащих наноматериалов в предотвращении поражения высокотоксичными химическими соединениями. Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации//Сб. трудов Всероссийского симпозиума, посвященного 50-летию со дня основания ФГУП "НИИ ГПЭЧ" ФМБА России/Под ред. В.Р. Рембовского, А.С. Радилова. СПб: ЭЛБИ-СПб, 2012. С. 25-32.

14. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Дегтярёва Т.Д., Кузьмин С.В., Гурвич В.Б., Сутункова М.П., Киреева Е.П., Минигалиева И.А., Ерёменко О.С. Анализ некоторых результатов экспериментального изучения токсикологии наночастиц с позиции гигиенического нормирования//Уральский медицинский журнал. 2011. N 9. С. 35-38.

15. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Дегтярёва Т.Д., Кузьмин С.В., Гурвич В.Б., Сутункова М.П., Киреева Е.П., Минигалиева И.А., Ерёменко О.С. К проблеме обоснования ориентировочных безопасных уровней воздействия металлосодержащих наночастиц в воздухе рабочей зоны//Токсикологический Вестник. 2012. N 4. С. 26-29.

16. Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Сутункова М.П., Гурвич В.Б., Минигалиева И.А., Логинова Н.В., Киреева Е.П., Шур В.Я., Шишкина Е.В., Бейкин Я.Б., Пичугова С.В., Макеев О.Г., Валамина И.Е. Основные результаты токсикологических экспериментов "ин виво" с некоторыми металлическими и металло-оксидными наночастицами//Токсикологический Вестник. 2015. N 3 С. 26-39.

17. Кацнельсон Б.А., Сутункова М.П., Привалова Л.И., Соловьёва С.Н., Гурвич В.Б. и др. Оценка токсических эффектов наночастиц оксида никеля при ингаляционных воздействиях//Здоровье населения и среда обитания. 2018. Т. 308. N 12. С. 24-29.

18. Николаев А.И., Дулов С.А., Глушкова А.В., Радилов А.С. Основные элементы связи физико-химических параметров и токсичности наноматериалов. Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации//Сб. трудов Всероссийского симпозиума, посвященного 50-летию со дня основания ФГУП "НИИ ГПЭЧ" ФМБА России/Под ред. В.Р. Рембовского, А.С. Радилова. СПб: ЭЛБИ-СПб, 2012. С. 416-424.

19. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А. Алгоритм токсикологических исследований наночастиц/Сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции "Химическая безопасность РФ в современных условиях" 27-28 мая 2010. СПб. С. 71-72.

20. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А. К вопросу об оценке опасности и токсичности наночастиц/Сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции "Химическая безопасность РФ в современных условиях" 27-28 мая 2010. СПб, С. 72-74.

21. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А. Оценка сравнительной острой токсичности наночастиц и микрочастиц/Сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции "Химическая безопасность РФ в современных условиях" 27-28 мая 2010. СПб, С. 190-191.

22. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А., Рембовский В.Р. Ускоренное нормирование и управление риском/Нанотехнологии. Экология. Производство. N 3. 2010. С. 65-68.

23. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А. Опасность наночастиц и программа превентивных действий//Токсикологический вестник 2010. Т. 105. N 6. С. 15-18.

24. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А., Рембовский В.Р. Ориентировочные гигиенические нормативы аэрозолей наночастиц в воздухе рабочей зоны. Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации//Сб. трудов Всероссийского симпозиума, посвященного 50-летию со дня основания ФГУП "НИИ ГПЭЧ" ФМБА России/Под ред. В.Р. Рембовского, А.С. Радилова. СПб: ЭЛБИ-СПб, 2012. С. 424-430.

25. Сутункова М.П., Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Гурвич В.Б., Конышева Л.К., Шур В.Я., Шишкина Е.В., Минигалиева И.А., Соловьева С.Н., Зубарев И.В. Экспериментальное и математическое моделирование кинетики задержки наночастиц оксида железа в лёгких при хронической низкоуровневой ингаляционной экспозиции//Токсикологический вестник. 2016. N 6. С. 4-10.

26. Сутункова М.П., Кацнельсон Б.А., Привалова Л.И., Гурвич В.Б., Конышева Л.К. и др. Экспериментальные данные и методические соображения к обоснованию предельно допустимой концентрации железо-оксидных наночастиц в воздухе рабочей зоны//Токсикологический вестник. 2016. N 6 (141). С. 11-17.

27. Сутункова М.П., Соловьёва С.Н., Кацнельсон Б.А., Гурвич В.Б., Привалова Л.И. и др. Некоторые особенности реакции организма на хроническую ингаляцию - содержащих субмикронных (преимущественно наноразмерных) частиц реального промышленного аэрозоля//Токсикологический вестник. 2017. N 3. С. 17-26.

28. Радилов А.С., Глушкова А.В., Дулов С.А., Николаев А.И. К вопросу об особенностях физико-химических свойств наночастиц/Сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции "Химическая безопасность РФ в современных условиях" 27-28 мая 2010, СПб. С. 69-71.

29. Сутункова М.П. Оценка токсического действия наночастиц NiO при ингаляционном поступлении//Медицина труда и промышленная экология. 2019. Т. 59. N 2. С. 86-91.

30. Сутункова М.П., Минигалиева И.А., Привалова Л.И., Рябова Ю.В., Макеев О.Г., Зубарев И.В., Шишкина Е.В., Бушуева Т.В., Кацнельсон Б.А. Оценка токсических эффектов наночастиц оксида цинка на организм крыс в остром и подостром экспериментах. Гигиена и санитария. 2021;100(7):704-710.

31. Boris A Katsnelson, Ivan N Chernyshov, Svetlana N Solovyeva, IIzira A Minigalieva, Vladimir В Gurvich, Irene E Valamina, Oleg H Makeyev, Renata R Sahautdinova, Larisa I Privalova, Anastasia E Tsaregorodtseva, Artem V Korotkov, Eugene A Shuman, Vladimir G Panov, Marina P Sutunkova. Looking for the LOAEL or NOAEL Concentration of Nickel-Oxide Nanoparticles in a Long-Term Inhalation Exposure of Rats//International Journal of Molecular Sciences. Volume 22. Issue 1. Pages 416.

32. Radilov A.S., Glushkova AV, Dulov SA, Khlebnikova NS. Development of prognostic occupational air standards for nanoparticles./Materials 2nd International Conference on Safe production and use of nanomaterials. Grenoble 16-18 November 2010; 123.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова

______________________________

* Например, МУ 4000-85 "Методические указания по установлению ориентировочных безопасных уровней воздействия вредных веществ в воздухе рабочей зоны"