Методические указания по определению остаточных количеств тебуконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии МУК 4.1.2084-06 (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 июля 2006 г.)

Методические указания по определению остаточных количеств тебуконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии
МУК 4.1.2084-06
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 июля 2006 г.)

Дата введения: с 1 сентября 2006 г.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации тебуконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса в диапазоне 0,1-1,0 мг/кг.

Тебуконазол - действующее вещество фунгицида Фоликур, КЭ (250 г/л), фирма производитель Байер Кроп Сайенс (Германия).

(RS)-1-п-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)пентан-3-ол (ИЮПАК)

--[2-(4-хлорфенил)этил]--(1,1-диметилэтил)-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.)

	Мол. масса: 307,8

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: 105°С. Давление паров при 20°С: мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: . Растворимость при 20°С: дихлорметан - более 200, изопропанол, толуол - 50-100, гексан - менее 0,1, вода - 0,036.

Вещество устойчиво к гидролизу при pH 5-9 и фотолизу.

Тебуконазол медленно разрушается в почве и слабо передвигается по почвенному профилю.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность для крыс и мышей - 3000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - 5100 воздуха. Тебуконазол вызывает слабое раздражение слизистой оболочки глаз у кроликов. для рыб - 5,7 (96 час.).

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей.

Рекомендуемый норматив для тебуконазола в семенах и масле рапса - 0,2 мг/кг.

Область применения препарата

Тебуконазол - системный фунгицид широкого спектра действия с защитным, лечебным и искореняющим эффектом. Эффективен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза, фузариоза, ринхоспориоза на зерновых злаках, альтернариоза и склеротиниоза на рапсе. Используется как для обработки вегетирующих растений, так и для протравливания семян.

Зарегистрирован в России под торговым названием Фоликур, КЭ (250 г/л) в качестве фунгицида для обработки вегетирующих растений зерновых злаков и рапса.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандарное отклонение, S, %	Относительное отклонение, DS, %	Доверительный интервал среднего, %
Зеленая масса	0,1	0,1-1,0	82,2	2,9	1,3
Семена	0,1	0,1-1,0	85,9	4,1	1,8
Масло	0,1	0,1-1,0	84,5	3,9	1,8

Таблица 2

Полнота определения тебуконазола в модельных матрицах (n = 5)

Матрица	Внесено тебуконазола, мг/кг	Открыто тебуконазола, %	Доверительный интервал среднего, %
Зеленая масса	0,1	81,3
	0,2	83,0
Семена	0,1	82,7
	0,2	84,4
	0,5	86,5
	1,0	89,8
Масло	0,1	80,4
	0,2	84,6
	0,5	85,6
	1,0	87,5

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД). Контроль тебуконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зеленой массы водным ацетоном, из семян и масла ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с ТИД (СКБ "Хроматэк", Россия)	Номер Госреестра N 14516-95
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/-0,036 г	ГОСТ 7328
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770
Меры массы	ГОСТ 7328
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10	ГОСТ 29227
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 5	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 500 и 1000	ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Тебуконазол, аналитический стандарт фирмы Байер (Германия) с содержанием д.в. 99,8%
Ацетон, ч.д.а.	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил, х.ч.	ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная	ГОСТ 6702
н-Гексан, х.ч.	ТУ 6-09-3375
Метилен хлористый (дихлорметан), х.ч.	ГОСТ 12794
Натрий сернокислый безводный, х.ч.	ГОСТ 4166
Натрий хлористый, х.ч.	ГОСТ 4233
Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.	ГОСТ 22300

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Азот газообразный (баллон), о.с.ч.	ГОСТ 9293
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с	ТУ 64-1-2851-78
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)
Вата медицинская	ТУ 9393-001-00302238
Воронка Бюхнера	ГОСТ 0147
Воронки делительные вместимостью 100 и 250	ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм	ГОСТ 25336
Генератор водорода, модель SPE, фирма General Electric (США) или аналогичный
Дефлегматор елочный	ГОСТ 9737
Колба Бунзена	ГОСТ 5614
Колбы плоскодонные вместимостью 250	ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100	ГОСТ 9737
Колонка кварцевая капиллярная ZB-1 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex (США) или аналогичная
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм	ГОСТ 9737
Компрессор (СКБ "Хроматэк", Россия)
Мельница электрическая лабораторная	ТУ 46-22-236
Насос водоструйный вакуумный	ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или	ТУ 25-11-917
ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария)
Силикагель 60 (0,063-0,2 мм) для колоночной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности
Стаканы химические вместимостью 100 и 500
Стекловата
Установка для перегонки растворителей
Фильтры бумажные "красная лента" обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ	ТУ 6-09-2678-77
Шприц для ввода образцов для газового хроматографа вместимостью 1-10 (Hamilton, США)

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20+5)°С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ).

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130°С в течение 3 часов.

7.2. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля I степени активности в 15 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 гексана со скоростью 1-2 капли в сек., после чего она готова к работе.

7.3. Проверка хроматографического поведения тебуконазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 помещают 0,1 градуировочного раствора N 1 тебуконазола с концентрацией 10 в этилацетате (п. 7.5.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 50 смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку с силикагелем промывают 60 смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему). Фракционно (по 10 ) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание тебуконазола по п. 9.4.

7.4. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280°С и скорости газа-носителя 2 в течение 8-10 часов.

7.5. Приготовление градуировочных растворов

7.5.1. Исходный раствор тебуконазола для градуировки (концентрация 100 ). В мерную колбу вместимостью 100 помещают 0,010 г тебуконазола, растворяют в 40-50 этилацетата, доводят этилацетатом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение 3-х месяцев.

7.5.2. Раствор тебуконазола N 1 для градуировки (концентрация 10 ).

В мерную колбу вместимостью 100 помещают 10 исходного раствора тебуконазола с концентрацией 100 (п. 7.6.1), разбавляют этилацетатом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов NN 2-5.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду п. 7.5.1

Для приготовления проб семян и зеленой массы с внесением при оценке полноты извлечения тебуконазола из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор тебуконазола с концентрацией 10 , а для приготовления проб масла - раствор тебуконазола в изопропаноле с концентрацией 10 .

Градуировочный раствор N 1, а также ацетоновый и изопропанольный растворы тебуконазола хранят в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы NN 2-5 тебуконазола для градуировки (концентрация 0,2-2,0 ).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 помещают 2.0, 4.0, 10.0 и 20.0 градуировочного раствора N 1 тебуконазола с концентрацией 10 (п. 7.5.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 2-5 с концентрацией тебуконазола 0.2, 0.4, 1.0 и 2.0 , соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мВ) от концентрации тебуконазола в растворе , устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 каждого градуировочного раствора (п. 7.5.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТом 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18°С до анализа. Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в холодильнике при температуре не выше 4°С. Масло хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4°С. В некоторых случаях масло получают из семян рапса экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция тебуконазола

9.1.1. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 , добавляют 100 смеси ацетон-вода (7:3, по объему) и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 . Осадок на фильтре промывают 50 смеси ацетон-вода (7:3, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/4 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 , добавляют 50 ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 1 час. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 . Осадок на фильтре промывают 30 ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 . В воронку вносят 10 гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 100 через слой ваты, помещенный в конусную воронку. Вату на фильтре промывают 10 ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С и подвергают очистке на колонке по п. 9.3.

9.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 , добавляют 50 ацетонитрила и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 25 ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу, пропущенную через вату, переносят в делительную воронку вместимостью 250 , добавляют 15 гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 , упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С и подвергают очистке на колонке по п. 9.3.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.1.1. и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (8-10 ) при температуре не выше 40°С. К водному остатку прибавляют 15 насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 . В воронку вносят 30 хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 . Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 9.1.2., 9.1.3. и 9.2., растворяют в 0,6 этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, добавляют 2,4 гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 40 смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1-2 капли в сек., элюат отбрасывают. Тебуконазол элюируют с колонки 50 смеси гексан-этилацетат (2:8, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 . Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С. Остаток в колбе растворяют в 2,5 этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание тебуконазола по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с термоионным детектором на азотсодержащие вещества с пределом детектирования не выше г/с.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex (США).

Температура термостата испарителя - 270°С, детектора - 330°С, термостата колонки (программа: от 180°С (1 мин) со скоростью 25°/мин до 240°С (0 мин); со скоростью 5°/мин до 255°С (4 мин); со скоростью 25°/мин до 270°С (2 мин).

Расход газов: газа-носителя (азот) - 3,5 ; водорода и воздуха к ТИД - 12,2 и 200 , соответственно.

Деление потока: 1:2.

Время удерживания тебуконазола: около 8 мин.

Объем вводимой пробы: 1 .

Линейный диапазон детектирования: 0,1-2,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту хроматографического пика тебуконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 2,0 , разбавляют этилацетатом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание тебуконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

, где

Х - содержание тебуконазола в пробе, мг/кг;

- высота пика образца, мВ;

- высота пика стандарта, мВ;

А - концентрация стандартного раствора тебуконазола, ;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

m - масса анализируемой части образца (г) /для зеленой массы, зерна и масла - 5 г/.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

12. Разработчики

Дубовая Л.В., науч. сотр.; Макеев А.М., зав. лаб., канд. биол. наук.

ГНУ ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.

Руководитель федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко