Методические указания по определению остаточных количеств пендиметалина в луке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МУК 4.1.2020-05 (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 17 октября 2005 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Вводная часть

Торговое наименование: Кобра КЭ, Эстамп КЭ.

Фирма-производитель: Агротрейд Лтд, ЗАО "Щелково Агрохим".

Действующее вещество: пендиметалин.

Структурная формула:

N-(1-этилпропил)-2,6-динитро-3,4-ксилидин (IUPAC).

N-(1-этилпропил)-3,4-диметил-2,6-динитробензиламин (СА).

Брутто-формула: .

Мол. масса: 281,3.

Разлагается при возгонке.

Химически чистый пендиметалин представляет собой оранжево-жёлтые кристаллы.

Температура плавления 54-58°С. Давление паров 4,0 мПа (25°С).

Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода .

Растворимость в воде - 0,3 мг/л (20°С). Растворимость (г/л) при 26°С: ацетон - 55; изопропанол - 77; ксилол - 628; н-гептан - 138; кукурузное масло - 148. Хорошо растворим в бензоле, толуоле, хлороформе и дихлорметане. Растворим в петролейном эфире и бензине.

Очень стабилен при хранении (хранение при температуре 5-130°С). Устойчив к воздействию кислот и щелочей. Медленно разлагается на свету. в воде - менее 21 дня.

Острая пероральная токсичность (мг/кг): для крыс - 1050-1250. Острая дермальная токсичность для кроликов - более 5000 мг/кг. Не ирритант для глаз и кожи. (96 часов) для радужной форели - 0,14 мг/л. для пчёл - более 50 мкг/особь.

Группа токсичности по ЕРА - III, ВОЗ - III.

Пендиметалин - селективный гербицид, абсорбируемый корнями и листвой. Используется для контроля большинства однолетних трав и широколиственных сорняков при выращивании большинства сельскохозяйственных растений.

Гигиенические нормативы для пендиметалина в России:

ОДК в почве - 0,15 мг/кг, ПДК в воде водоемов - 0,05 (органолептический лимитирующий показатель), ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,5 . МДУ для пендиметалина: соя (семена и масло), чеснок, табак, хмель сухой - 0,1 мг/кг; петрушка - 0,05 мг/кг. ВМДУ для пендиметалина: томаты, морковь, капуста, огурец - 0,05 мг/кг. Для лука гигиенические нормативы в России не установлены.

2. Методика определения пендиметалина в луке методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении пендиметалина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с флорисилом.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р =0,95
Лук-перо	0,01	0,01-0,1	83,6	5,3	4,7
Лук-репка	0,01	0,01-0,1	83,7	5,3	4,7

Таблица 2

Полнота определения пендиметалина в луке методом ВЭЖХ
(n = 6 для каждой концентрации)

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение,	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Лук-перо	0,01	0,00841	0,00053	84,1
	0,02	0,01646	0,00111	82,3
	0,05	0,04175	0,0026	83,5
	0,1	0,0846	0,0051	84,6
Среднее				83,6
Лук-репка	0,01	0,00822	0,00057	82,2
	0,02	0,01688	0,00102	84,4
	0,05	0,04215	0,0025	84,3
	0,1	0,0839	0,0052	83,9
Среднее				83,7

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Пендиметалин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 94,7%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (75:25 по объему).

Флорисил для колоночной хроматографии (0,150-0,250 мм) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (75:25 по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry С-18 (250х4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный R-200 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ250 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 и КШ500 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 , ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 , ГОСТ 1770-74.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 , ГОСТ 20292-74.

Колонки стеклянные (25х1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб лука производится в соответствии с ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый" и ГОСТ 27166-86 "Лук репчатый свежий реализуемый".

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объёмом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для получения 75%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 75:25 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента для колоночной хроматографии в колбе на 1000 мл смешивают 750 мл н-гексана и 250 мл этилацетата.

Приготовление градуировочных растворов

Берут точную навеску пендиметалина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (исходный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил : вода = 75:25 по объему).

Градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца.

При изучении полноты определения пендиметалина используют ацетонитрильные растворы вещества. Для внесения в лук-перо и лук-репу растворы с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из градуировочного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Раствор пендиметалина в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/мл для проверки хроматографического поведения пендиметалина на колонке с флорисилом готовят из исходного раствора 0,5 мг/мл последовательным разбавлением ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация пендиметалина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пендиметалина в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорисила в 20 мл гексана. Не позволяя высохнуть верхней кромке слоя флорисила, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10-15 мм. Колонку промывают 20 мл элюента для колоночной хроматографии, затем 30 мл гексана со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения пендиметалина на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора пендиметалина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40°С), остаток растворяют в 5 мл гексана и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл гексана и также вносят на колонку. Промывают колонку 40 мл гексана, которые отбрасывают, затем 50 мл элюента для колоночной хроматографии со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание пендиметалина по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие пендиметалин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание пендиметалина в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания пендиметалина и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Извлечение пендиметалина из проб лука-репки

Навеску гомогенизированных луковиц массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл. К навеске приливают 100 мл смеси ацетон-вода (3:1 по объёму) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют ещё со 100 мл 75%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (45-50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Объём экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.2. Извлечение пендиметалина из проб зеленого лука

Навеску гомогенизированных перьев лука массой 20 г помещают в коническую колбу ёмкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон - вода (1:1 по объёму) и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют со 100 мл 50%-ного водного ацетона. Экстракт упаривают до водного остатка (90-95 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Объём экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.3. Очистка экстрактов

Полученные по п.п. 2.6.1 и 2.6.2 водные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют пендиметалин трижды гексаном порциями по 30 мл (собирают верхний органический слой), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1-2 минут. Объединённый гексановый раствор пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4*.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.4. Очистка на колонке с флорисилом

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.5 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя 5 мл порциями гексана в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 40 мл гексана. Элюат отбрасывают. Пендиметалин элюируют 40 мл смеси гексан - этилацетат (75:25 по объему), собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха в вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 432 нм.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry С-18 (250х4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 75:25.

Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания пендиметалина мин.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1-2,0 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание пендиметалина в образцах растительных материалов (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

,

где - площадь пика пендиметалина в градуировочном растворе, ;

- площадь пика пендиметалина в анализируемой пробе, ;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

P - навеска анализируемого образца, г;

C - концентрация градуировочного раствора пендиметалина, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств пендиметалина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор пендиметалина 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Требования техники безопасности

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "ГОСТ 12.1.005-88"

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5. Разработчики

Цибульская И.А., Долженко В.И., Юзихин О.С. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главный Государственный санитарный врач РФ

Г.Г. Онищенко

______________________________

* В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.3) дает удовлетворительные результаты, дополнительную очистку на колонке с флорисилом можно исключить.