Приложение А (справочное). Примеры информации, предоставляемой изготовителем с реагентами, обычно применяемыми в методиках биологического окрашивания

Приложение А
(справочное)

Примеры
информации, предоставляемой изготовителем с реагентами, обычно применяемыми в методиках биологического окрашивания

А.1 Общие положения

Следующая информация представляет собой примеры процедур окрашивания и ее не следует рассматривать как единственный способ проведения описанных процедур. Эти процедуры могут быть использованы изготовителем для исследования реактивности красящих веществ и иллюстрируют то, каким образом изготовитель может представить информацию, соответствующую настоящему стандарту.

А.2 Краситель метиловый зеленый - пиронин Y. Пример 1

Информация, предоставленная производителем вместе с красящими веществами, используемыми в данной процедуре для окрашивания (метиловый зеленый или этиловый зеленый и пиронин Y), перечисленными ниже.

А.2.1 Красящее вещество метиловый зеленый

А.2.1.1 Метиловый зеленый краситель

Внимание - R 36/37/38: Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи; S 26: В случае контакта с глазами немедленно промыть; S 36: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

А.2.1.1.1 Описание продукта (наименование):

- метиловый зеленый (синонимы: двойной зеленый SF, легкий зеленый);

- регистрационный номер CAS: 22383-16-0;

- наименование и номер индекса красителя: основной голубой 20, 42585.

А.2.1.1.2 Состав продукта:

молекулярная формула, включающая противоион: + 2 ;

молярная масса с противоионом (или без него): 561,17 г/моль (387,56 г/моль);

массовая доля (содержание) метилового зеленого катиона: 85 %, определена с помощью метода абсорбционной спектрометрии; допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1 %;

- неорганические соли: менее 0,1 %;

- детергенты: не присутствуют;

- окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживаются с помощью тонкослойной хроматографии;

- индифферентные соединения: 14 % растворимого крахмала.

А.2.1.1.3 Обращение и хранение

Стабилен при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре (от 18 °C до 28 °C).

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, соответствующий метиловому зеленому.

А.2.1.2 Красящее вещество этиловый зеленый

Внимание - R 36/37/38: Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи; S 26: В случае контакта с глазами немедленно промыть; S 36: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

А.2.1.2.1 Описание продукта (наименование):

- этиловый зеленый (синоним: метиловый зеленый);

- регистрационный номер CAS: 7114-03-6;

- наименование и номер индекса красителя: наименование в индексе красителя отсутствует, 42590.

А.2.1.2.2 Состав:

молекулярная формула, включающая противоион: + 2 ;

молярная масса с противоионом (или без него): 575,19 г/моль (401,58 г/моль);

массовая доля этилового зеленого катиона: 85 %, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1 %;

- неорганические соли: менее 0,1 %;

- детергенты: отсутствуют;

- окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии;

- индифферентные соединения: 14 % растворимого крахмала.

А.2.1.2.3 Обращение и хранение

Стабилен при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с этиловым зеленым.

А.2.1.3 Красящее вещество пиронином Y.

Внимание - R20/21/22: Вреден при вдыхании, попадании на кожу и проглатывании.

А.2.1.3.1 Описание продукта (название):

- пиронин Y (синонимы: pyronine Y, пиронин G, pyronine G);

- регистрационный номер CAS: 92-32-0;

- наименование и номер индекса красителя: наименование в индексе красителя отсутствует, 45005.

А.2.1.3.2 Состав продукта:

молекулярная формула, включающая противоион: ;

молярная масса с противоионом (или без него): 302,75 г/моль (267,30 г/моль);

массовая доля пиронина Y катиона: 80 %, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1 %;

- неорганические соли: менее 0,1 %;

- детергенты: отсутствуют;

- окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии;

- индифферентные соединения: 19 % растворимого крахмала.

А.2.1.3.3 Обращение и хранение.

Стабилен при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 550 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с пиронином Y.

А.2.2 Предназначенное применение метода окрашивания метиловым зеленым - пиронином Y

Эта процедура используется для демонстрации ДНК (нуклеинов) и РНК (рибосом) в клеточном материале. Это особенно подходит для демонстрации плазменных клеток.

А.2.3 Тип(ы) материала

Краситель метиловый зеленый - пиронин Y применяется для окрашивания свежезамороженных, парафинированных или пластиковых срезов тканей различных видов.

А.2.4 Обращение и обработка перед окрашиванием

А.2.4.1 Возможные фиксирующие средства включают в себя:

жидкость Карноя [этанол (объемная доля 99 %) + хлороформ + уксусная кислота (массовая доля 99 %), смешанные в объемах (60 + 30 + 10) см ³ (мл)]; или

формальдегид (массовая доля 3,6 %), забуференный фосфатом (pH = 7,0); высушивание, очистка, пропитывание и покрытие парафином, приготовление срезов с помощью микротома.

А.2.5 Рабочий раствор

А.2.5.1 Приготовление рабочего раствора [15], [16]

a) Готовят раствор этилового зеленого или метилового зеленого из количества, соответствующего массе 0,15 г чистого красящего вещества, рассчитанного как окрашенный катион (в приведенных выше примерах 0,176 г в каждом случае) в 90 см ³ (мл) горячей (температура 50 °C) дистиллированной воды [6], [10], [14].

b) Растворяют количество вещества соответствующее, содержанию по массе 0,03 г пиронина Y, рассчитанного как окрашенный катион (в примере, приведенном выше, 0,038 г) в 10 см ³ (мл) фталатного буфера (pH = 4,0) концентрацией 0,1 моль/дм ³ (моль/л) [9], [13].

c) Смешивают полученный раствор с раствором этилового зеленого или метилового зеленого.

d) Рабочий раствор стабилен по крайней мере одну неделю при хранении в плотно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

А.2.5.2 Методика окрашивания [12], [16]

a) Депарафинируют срезы.

b) Срезы смачивают.

c) Окрашивают срезы в течение 5 мин при комнатной температуре примерно 22 °C в рабочем растворе.

d) Промывают срезы в двух сменах дистиллированной воды, от 2 до 3 с в каждой.

e) Стряхивают излишки воды.

f) Активируют в трех сменах 1-бутанола.

g) Переносят непосредственно из 1-бутанола в гидрофобную синтетическую смолу.

А.2.6 Ожидаемый(е) результат(ы)

Ожидается получение следующих результатов с типами материалов, перечисленными в А.2.4.1:

- для ядерного хроматина: зеленый (фиксатор Карнов) или голубой (фиксатор формальдегид);

- для нуклеол и цитоплазмы, богатой рибосомами: красный (фиксатор Карнов) или лиловато-красный (фиксатор формальдегид);

- для матрицы хрящей и гранул тучных клеток: оранжевый;

- для мышц, коллагена и эритроцитов: не окрашены.

А.3 Реакция Фельгена-Шиффа. Пример 2

Информация, предоставленная производителем с красителем, используемым для получения хромогенного реагента (парарозанилин - реактив Шиффа), применяемого в процедуре окрашивания.

А.3.1 Краситель, использованный в реакции Фельгена-Шиффа

А.3.1.1 Красящее вещество парарозанилин

Внимание - Для R 40: Возможный риск необратимых эффектов; для R 22: Не вдыхать пыль; для S 36/37: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

А.3.1.1.1 Описание продукта (наименование):

- парарозанилин (синонимы: основной рубиновый, парафуксин, парамагента, магента 0);

- регистрационный номер CAS: 569-61-9;

- наименование и номер индекса красителя: основной красный 9,42500.

А.3.1.1.2 Состав:

молекулярная формула, включающая противоион: ;

молярная масса с противоионом (или без него): 323,73 г/моль (288,28 г/моль);

массовая фракция парарозанилина катиона: 85 %, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирую