Методические указания МУК 4.2.3733-21 "Подготовка культур микроорганизмов I-II групп патогенности для анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и формирование баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 декабря 2021 г.)

Методические указания МУК 4.2.3733-21
"Подготовка культур микроорганизмов I-II групп патогенности для анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и формирование баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 декабря 2021 г.)

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают способы подготовки микроорганизмов I-II групп патогенности для исследования с помощью MALDI-TOF (англ. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI; англ. time of flight, ToF) масс-спектрометрии и определяют методику формирования базы данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, применяющими методы масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов I-II групп патогенности, и в экспериментальной работе*(1).

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Масс-спектрометрический анализ представляет собой точный и чувствительный метод (чувствительность метода моль, точность до 0,1 а.е.м.)*(2), позволяющий измерять массы органических и неорганических соединений, посредством ионизации исследуемого вещества и дальнейшего разделения полученных ионов по массам под воздействием электрических полей.

Принцип матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) основан на "мягкой" ионизации аналита вместе с летучим органическим веществом - матрицей под действием коротких мощных лазерных импульсов.

Наиболее распространенными матрицами при анализе белков являются кислота и 3-гидроксипиколиновая кислота для олигонуклеотидов, 2,5-дигидроксибензойная кислота для пептидов и полисахаридов.

2.2. Во времяпролетном масс-спектрометре ионы вещества ускоряются пропорционально их заряду в электрическом поле. После попадания на детектор и оцифровки результата выдается график, где по оси абсцисс находится соотношение m/z, а ординат - количество событий регистрации ионов на детекторе. Анализаторы данного типа носят название линейных времяпролетных (ToF), а их сочетание с MALDI эффективно для анализа белков, пептидов и нуклеиновых кислот.

2.3. Спектральный паттерн является уникальной родо-, видо-, а в некоторых случаях и штаммоспецифичной характеристикой, позволяющей идентифицировать микроорганизм до рода, вида, а в некоторых случаях осуществить и внутривидовую дифференциацию или определить дополнительные свойства микроорганизма. Собранные в процессе анализа спектры исследуемых микроорганизмов сравниваются с референсными спектрами базы данных. На основании коэффициента соответствия полученного паттерна рефененсному спектру выдается заключение о таксономической принадлежности исследуемого объекта.

2.4. Для создания баз данных референсных масс-спектров для указанной группы микроорганизмов при проведении автоматической идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии необходимо использовать белковые экстракты чистых культур микроорганизмов с типичными свойствами для вида.

2.5. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации возбудителей I-II групп патогенности осуществляют в соответствии с документами, регламентирующими лабораторную диагностику для каждой нозологии. Если в документах использование метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для определения таксономического положения патогена не предусмотрено, данный подход рассматривают как дополнительный, и исследования осуществляют после подготовки баз данных референсных масс-спектров микроорганизма и подтверждения диагностической эффективности метода для данного вида возбудителя.

2.6. При приготовлении реагентов и проведении анализа используют наконечники с фильтрами и пробирки, изготовленные из химически неактивного пластика, с целью исключения попадания в пробы пластификаторов.

2.7. Реактивы, используемые при пробоподготовке и проведении масс-спектрометрического анализа, должны иметь степень чистоты "химически чистые", специально предназначенные для масс-спектрометрического анализа или высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.8. Манипуляции с летучими химическими реактивами проводят:

- при приготовлении рабочих растворов и обработке мишени (чипа) после исследования в вытяжном шкафу;

- при приготовлении экстрактов микроорганизмов и при нанесении матрицы на лунки мишени в боксе микробиологической безопасности II класса типа В или III класса с использованием средств индивидуальной защиты, в том числе фильтрующей полумаски, обеспечивающей защиту органов дыхания от летучих химических веществ, в помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией.

III. Материально-техническое обеспечение

3.1. Оборудование:

- MALDI-ToF масс-спектрометр;

- MSP-мишень (чип) для нанесения образцов;

- дозатор механический одноканальный 0,5-10 мкл;

- дозатор механический одноканальный 10-100 мкл;

- дозатор механический одноканальный 100-1000 мкл;

- штатив для механических дозаторов;

- вортекс;

- таймер-секундомер;

- центрифуга настольная с режимом 13000 об/мин;

- цилиндры мерные (100 мл);

- штативы "рабочее место" для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл;

- боксы микробиологической безопасности II и/или III класса;

- вытяжной шкаф для работы с летучими реактивами;

- твердотельный термостат.

Примечание. Допускается использование средств измерений и стандартных образцов утвержденных типов с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.

3.2. Расходные материалы:

- пробирки микроцентрифужные с защелкой 1,5 мл;

- микропробирки стерильные пластиковые с завинчивающейся крышкой и кольцевой прокладкой;

- центрифужные ультрафильтры с диаметром пор 0,22 мкм;

- наконечники с аэрозольным фильтром для механического дозатора, 0,1-10 мкл;

- наконечники с аэрозольным фильтром для механического дозатора, 10-100 мкл;

- наконечники с аэрозольным фильтром для механического дозатора 100-1000 мкл;

- петля бактериологическая пластиковая стерильная, 1 мкл;

- емкость-контейнер полимерный для дезинфекции;

- салфетки лабораторные безворсовые.

Примечание. Допускается применение вспомогательного оборудования, отличного от указанного, с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

3.3. Средства индивидуальной защиты:

- противочумный костюм IV типа (или аналог, разрешенный к применению в установленном порядке);

- латексные перчатки;

- защитные очки;

- прорезиненный (водонепроницаемый) фартук;

- фильтрующая полумаска, обеспечивающая защиту органов дыхания от паров кислот.

3.4. Реактивы:

- ацетонитрил, 99.8%;

- вода деионизованная ультрачистая;

- муравьиная кислота для масс-спектрометрии, 98%;

- спирт этиловый, 96% (ГОСТ 5962);

- трифторуксусная кислота, 99%;

- кислота;

- 2,5-дигидроксибензойная кислота;

- калибровочный стандарт;

- хлорид натрия;

- стандартный образец мутности;

- гуанидин гидрохлорид (4М).

Примечание. Допускается применение реактивов с характеристиками не ниже указанных.

IV. Требования безопасности

4.1. При выполнении работ необходимо руководствоваться санитарно-эпидемиологическими требованиями к обеспечению безопасности при работе с патогенными микроорганизмами*(1), а также внутренними инструкциями по контролю соблюдения требований биологической безопасности организации, утвержденными руководителем, регламентирующими работу с возбудителями I-IV группы патогенности.

Все манипуляции с живыми микроорганизмами I-II групп патогенности проводят в боксах микробиологической безопасности II (типа В) или III класса, в зависимости от группы патогенности микроорганизма, в противочумном костюме IV типа (или аналоге, разрешенном к применению в установленном порядке), дополненном двумя парами перчаток при работе в боксе II класса, в противочумном костюме IV типа (или аналоге, разрешенном к применению в установленном порядке) - при работе в боксе III класса*(3).

Для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности работа с концентрированными растворами сильных органических кислот и растворителями, а также все манипуляции по приготовлению рабочих растворов и обработка мишени (чипа) после исследования должны проводиться в вытяжном шкафу для работы с летучими вредными веществами с использованием средств индивидуальной защиты: латексных перчаток, очков, фартука и фильтрующей полумаски, обеспечивающей защиту органов дыхания от паров кислот. Необходимо избегать попадания концентрированных и рабочих растворов на открытые участки кожи*(4).

V. Технология подготовки проб микроорганизмов

5.1. Для масс-спектрометрического анализа отбирают изолированные колонии культур микроорганизмов, находящихся в поздней логарифмической или стационарной фазе роста. Для культивирования возбудителей I-II групп патогенности с целью последующего исследования методом МALDI-TOF масс-спектрометрии применяются неселективные среды накопления, не содержащие красителей и антибиотиков. Для получения наилучших результатов рекомендуется использовать стандартные условия культивирования (среда, фаза роста, температура), идентичные тем, что были использованы для культивирования образцов, при создании референсных единиц базы данных (приложение 1 к настоящим МУК).

5.2. Для создания референсных масс-спектров возбудителей особо опасных инфекционных болезней и внесения их в базу данных используют исключительно белковые экстракты.

5.2.1. Для получения белкового экстракта штаммов возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, холеры, сапа и мелиоидоза используют метод экстракции этанолом/муравьиной кислотой (приложение 2 к настоящим МУК).

5.2.2. Для получения белкового экстракта штаммов спорообразующих микроорганизмов и возбудителей глубоких микозов используют метод экстракции трифторуксусной кислотой (приложение 2 к настоящим МУК).

5.2.3. Для создания референсных масс-спектров возбудителей особо опасных инфекционных болезней с целью создания баз данных для их идентификации в качестве матрицы используют кислоту. Возможно применение других матриц (приложение 3 к настоящим МУК).

VI. Подготовка MALDI-мишени

6.1. Новые или одноразовые MALDI-мишени не требуют специальной обработки и могут быть сразу использованы для анализа микроорганизмов. Ранее использованные в идентификации MALDI-мишени подвергают процедуре тщательной промывки с помощью 70% раствора этанола и 80% раствора трифторуксусной кислоты по изложенному ниже протоколу (приложение 2 к настоящим МУК).

6.2. Для чистки мишеней используют следующую схему.

6.2.1. Помещают мишень в подходящий контейнер и наливают достаточное для полного покрытия поверхности мишени количество 70% этанола.

6.2.2. Выдерживают мишень в течение 5 мин при комнатной температуре.

6.2.3. Вынимают мишень и тщательно промывают в проточной водопроводной воде.

6.2.4. Тщательно очищают мишень, используя безворсовую лабораторную салфетку, смоченную в 70% этаноле.

6.2.5. Промывают мишень проточной водой и промокают безворсовой салфеткой до полного высушивания или высушивают в вытяжном шкафу.

6.2.6. На поверхность мишени наносят 100 мкл 80% трифторуксусной кислоты и тщательно протирают поверхность мишени салфеткой, соблюдая правила работы с кислотами.

6.2.7. Промывают мишень деионизованной водой и промокают безворсовой салфеткой.

6.2.8. Просушивают мишень при комнатной температуре (не менее 15 мин).

6.2.9. Мишень готова к использованию.

6.3. Для мишеней с высокой степенью загрязненности промывка проводится по следующей схеме.

6.3.1. Мишень помещают в подходящий контейнер и вносят достаточное для полного покрытия поверхности мишени количество 70% этанола.

6.3.2. Выдерживают мишень в течение 5 мин при комнатной температуре.

6.3.3. Достают мишень и тщательно промывают в проточной водопроводной воде.

6.3.4. Тщательно очищают мишень, используя безворсовую лабораторную салфетку, смоченную в 70% этаноле.

6.3.5. Промывают мишень проточной водой и промокают безворсовой салфеткой до полного высушивания или высушивают в вытяжном шкафу.

6.3.6. На поверхность мишени наносят слой гуанидин гидрохлорида (4М) и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

6.3.7. Промывают мишень проточной водопроводной водой и просушивают безворсовой салфеткой.

6.3.8. Протирают мишени салфеткой смоченной в гуанидин гидрохлориде (4М), затем промывают под проточной водой и просушивают салфеткой.

6.3.9. При необходимости повторяют два предыдущих шага.

6.3.10. Промывают мишень деионизованной водой и промокают безворсовой салфеткой.

6.3.11. Просушивают мишень при комнатной температуре (не менее 15 мин).

6.3.12. Мишень готова к дальнейшей работе.

VII. Масс-спектрометрическое измерение

7.1. Для проведения масс-спектрометрических измерений заранее приготовленный экстракт образца наносят на 8 лунок мишени по 1 мкл на лунку. В одну лунку мишени наносят 1 мкл бактериального калибровочного стандарта.

7.2. После высыхания нанесенных экстрактов и бактериального калибровочного стандарта, лунки покрывают матрицей (по 1-2 мкл), дают подсохнуть при комнатной температуре в вытяжном шкафу или боксе микробиологической безопасности (II класс типа В или III класс).

7.3. Мишень (чип) с нанесенными образцами помещают в масс-спектрометр, производят калибровку, необходимую для увеличения достоверности получаемых результатов и контроля качества приготовленных образцов.

7.4. Приступают к сбору спектров в автоматическом режиме, устанавливая необходимые параметры. Результирующее количество спектров должно быть не менее 20. Возможен сбор спектров в ручном режиме.

7.5. Из исходных спектров создают референсный масс-спектр (англ. Main Spectrum, далее - MSP) исследуемого штамма микроорганизма и вносят его в базу данных программы.

VIII. Создание базы данных референсных масс-спектров микроорганизмов

8.1. Для создания базы данных референсных масс-спектров микроорганизмов одной таксономической единицы (например, вида микроорганизма) используют штаммы микроорганизмов, таксономическая принадлежность которых определена и подтверждена бактериологическими и/или молекулярно-генетическими методами.

8.2. Создание MSP.

8.2.1. Предварительно производят обработку исходных спектров: сглаживание, вычитание фоновой линии спектра, контроль спектров (следят, чтобы разброс пиков масс-спектра не превышал 500 ppm), удаляют спектры, отличающиеся от остальных. Результат сохраняют в отдельную папку.

8.2.2. Для создания одного MSP одного штамма необходимо не менее 20 исходных спектров. Создают MSP из выделенных 20 исходных спектров.

8.2.3. Созданный MSP перемещают в таксономическое дерево, выбрав при этом пользовательский проект.

8.3. Создание подтипов спектров. Для более точной идентификации близкородственных микроорганизмов создают подтипы спектров. Каждый подтип хранит информацию о различиях спектров.

IX. Идентификация микроорганизмов с использованием созданной базы данных масс-спектров

9.1. После формирования базы данных референсных масс-спектров возможна таксономическая идентификация исследуемого микроорганизма в автоматическом режиме, которая строится на основе сравнения данных спектров, полученных в ходе эксперимента, с базой данных референсных масс-спектров.

9.2. На первом этапе идентификации производится сбор исходных спектров исследуемых образцов. Для получения одиночного масс-спектра используют 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон m/z составляет 2000-20000 Да. С каждой ячейки чипа снимается исходный спектр, представляющий собой сумму шести одиночных спектров (240 импульсов лазера).

9.3. На следующем этапе проводится автоматическая идентификация, сравниваются собранные исходные спектры с референсными спектрами базы данных. По окончании процесса идентификации программа отображает результат, приводя наиболее соответствующую исходному спектру таксономическую единицу базы данных, с указанием значения коэффициента соответствия (анг. Skore Value, далее - SV). Чем выше SV, тем вероятнее видовая идентификация. Для лучшего восприятия результаты идентификации помечены одним из трех цветов: зеленый, желтый или красный. Заключение о таксономической принадлежности микроорганизма осуществляется на основании значения SV. Значение соответствует достоверной идентификации до вида (зеленый цвет); SV менее 2,299, но более 2,000 - достоверной идентификации до рода и вероятной идентификации до вида (зеленый цвет); значение SV в диапазоне 1,7-1,999 рассматривается как вероятная идентификация до рода (желтый цвет) и менее 1,7 - недостоверный результат (красный цвет).

______________________________

*(1) СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

*(2) ОФС.1.2.1.1.0008.15 Масс-спектрометрия

*(3) ГОСТ Р EH 12469 "Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности",

*(4) МР 4.2.0089-14 "Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS)".

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

3. МР 4.2.0089-14 "Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности".

4. ГОСТ Р ЕН 12469 "Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности".

5. ГОСТ 5962 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья".

6. ОФС. 1.2.1.1.0008.15 "Масс-спектрометрия".

Термины и сокращения

Для целей настоящей методики использованы следующие понятия:

МАЛДИ (MALDI)	Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (англ. matrix-assisted laser desorption/ionization)
МС (MS) об.	Масс-спектрометрия (англ. Mass Spectrometry) обороты
MALDI-ToF	Времяпролетная матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (англ. Time-Of-Flight Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)
MALDI target	Мишень (чип) для нанесения образцов
MSP	Референсный спектр (англ. Main Spectrum)
SV	Коэффициент соответствия (англ. Score Value)
Steel, Anchor	Типы мишеней для масс-спектрометрии
HPLC	Высокоэффективная жидкостная хроматография (High-Performance Liquid Chromatography)
HCCA	кислота
3-HPA	3-гидроксипиколиновая кислота
DHB	2,5-дигидроксибензойная кислота
PVDF	Поливинилиденфторид
m/z	масса/заряд

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова