Методические рекомендации "Лабораторная диагностика микозов, вызванных плесневыми грибами" (утв. Министерством здравоохранения СССР, 1986 г.)

1. Введение

Плесневые грибы "mould" - это таксономически неоднородная группа мицелиальных грибов, почвенных сапрофитов, широко распространенных в окружающей среде: в воздухе, на растениях, на предметах обихода, продуктах питания и т.д. Например, в 1 воздуха больничных палат выявляется от 600 до 2300 клеток аспергиллов, а на складах зерна и фуража - от 12 до 21 млн клеток различных плесневых грибов. Некоторые виды этих грибов широко используются в качестве продуцентов ферментов, органических кислот и других биологически активных веществ.

Организм человека постоянно контактирует со спорами грибов. Многие из этих грибов могут существовать как коменсалы на коже, на слизистых дыхательных путей, пищеварительного тракта, конъюнктивы глаз.

Грибы родов Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Cephalosporium, Cladosporium, Mucor, Rhizopus и др. могут явиться у человека этиологическими агентами микотических поражений, разнообразных по клиническим проявлениям и формам:

1. Инвазивные поражения кожи, ногтей, наружного слухового прохода, слизистых носа, глаз, придаточных пазух; микозы опорно-двигательного аппарата (мицетомы), легких, центральной нервной системы, желудочно-кишечного тракта.

2. Аллергии и аллергические реакции - дерматит, ринит, конъюнктивит, астма, аллергический бронхо-легочный аспергиллез,

3. Микотоксикозы, возникающие в результате употребления пищевых продуктов, которые могут содержать микотоксины.

Микозы, вызванные плесневыми грибами, развиваются у больных со сниженной иммунной реактивностью, которая может быть обусловлена самыми разнообразными причинами. К ним относятся: недоедание, хронические бактериальные инфекции, сахарный диабет, лейкоз, лимфогранулематоз, апластическая анемия, рак, ожоги, раны, облучение и т.д. При наличии этих состоянии или факторов иммунологическая реактивность снижается за счет расстройств, которые непосредственно влияют на иммунную систему или же требуют лечения цитостатическими, антибактериальными или иммунодепрессивными препаратами.

Трудности диагностики микозов, вызванных плесневыми грибами, определяются: полиморфизмом клинических форм и отсутствием патогномоничных симптомов, широко распространенным транзиторным носительством плесневых грибов, частотой вторичных инфекций, недостаточной разработанностью и стандартизацией микологических методов и критериев диагностики.

Особую проблему в этиологической терапии плесневых микозов создает низкая чувствительность плесневых грибов к существующим антифунгальным препаратам и значительные видовые и штаммовые различия в их лекарственной чувствительности.

В данное методическое пособие включены методы лабораторной диагностики микозов плесневой этиологии. Приводятся основные характеристики возбудителей, методы определения чувствительности к антифунгальным препаратам и токсигенности.

Методическое пособие составлено на основании собственных наблюдений авторов и опыта, накопленного во Всесоюзном центре Минздрава СССР по глубоким микозам, а также данных литературы за последние годы.

Подобных методических рекомендаций для практических врачей не имеется.

Методические рекомендации рассчитаны на врачей-микологов, бактериологов, врачей-клиницистов различных специальностей, научных работников и работников клинико-диагностических лабораторий.

2. Устройство и противоэпидемический режим микологической лаборатории, работающей с плесневыми грибами и микотоксинами

Согласно "Положению о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения" MЗ СССР 1980 г., по степени эпидемиологической опасности Aspergillus flavus, A. fumigatus и их микотоксины относятся к III группе возбудителей инфекционных болезней и ядов биологического происхождения, a A. niger, A. nidulans, Cephalosporium spp., Penicillium spp., Rhizopus, Absidia, Mucor spp. к IV группе.

Лаборатория, в которой производятся микологические исследования, должна иметь набор помещений, укомплектовываться мебелью, оборудованием и посудой так же, как и любая бактериологическая лаборатория. Для работы с микотоксинами необходима комната с вытяжным шкафом.

Эпидрежим и техника безопасности при работе с плесневыми грибами также соответствует таковым бактериологических лабораторий с учетом специфики работы с плесневыми грибами, которая заключается в следующем:

1. Во избежаний возможной аллергизации персонала спорами культур плесневых грибов нельзя открывать чашки Петри и пробирки с культурами плесневых грибов без соблюдения специальных мер предосторожности. Следует работать с ними в настольных боксах с вытяжкой или в марлевых масках в боксированном помещении.

2. Воздух в посевной комнате и боксе лаборатории обеззараживается ультрафиолетовыми облучателями, которые включают на 1-1,5 часа.

3. Пол и рабочие столы в помещениях, где производится работа с патологическим материалом и выделенными культурами, ежедневно убирают влажным способом с применением дезинфицирующих средств (5% хлорамин, 5% осветленная хлорная известь). Термостаты еженедельно протирают 5% хлорамином, стены обрабатывают дезсредствами 1 раз в месяц.

4. Загрязненные микроорганизмами пипетки, шпатели, предметные и покровные стекла обеззараживают погружением в 5% раствор фенола, лизола на 30 мин, или в 5% раствор хлорамина, осветленной хлорной извести - на 2-3 часа, затем кипятят и моют.

5. Случайно разбитые емкости, содержащие патологический материал или культуры, заливают одним из вышеупомянутых дезрастворов на 2-3 часа с последующей влажной уборкой помещения с применением дезрастворов.

6. Культуры плесневых грибов обезвреживают автоклавированием в разных режимах: при 2 атм (132°) 20 мин, (контроль - мочевина); при 1,5 атм (126°) 30 мин, (контроль - безводная фталевая кислота); при 1,1 атм (120°) 40 мин, (контроль - бензойная кислота).

7. Жидкий патологический материал (кровь, моча, мокрота, промывные воды) и фекалии, смешанные 1:1 с водой, засыпают хлорамином или хлорной известью (200 г на 1 л) на 2 часа с последующей эвакуацией в канализацию.

8. Микотоксины чрезвычайно устойчивы к физическим и химическим воздействиям и не разрушаются при пастеризации, кипячении, автоклавировании, стерилизации сухим жаром при температуре до 240-300°; инактивируются 5-6% раствором NaOCl (гипохлорида натрия) или насыщенным раствором (перманганата калия).

3. Взятие и доставка патологического материала

При подозрении на микоз, вызванный плесневыми грибами, в зависимости от локализации патологического процесса может исследоваться: мокрота, промывные воды бронхов и гайморовых пазух, гнойное и серозное отделяемое свищей, плевральный экссудат, спинномозговая жидкость, моча, фекалии, кожные и ногтевые чешуйки, отделяемое наружного слухового прохода и конъюнктивы глаза, кусочки органов и биопсированная ткань, кровь и др.

Мокроту, выделенную при откашливании, собирают в стерильную баночку с завинчивающейся крышкой или стерильную чашку Петри. Предварительно больному необходимо обработать слизистую ротовой полости и зева одним из следующих растворов: 2% раствор питьевой соды, буры, слаборозовый раствор марганцево-кислого калия, стерильный изотонический раствор хлорида натрия.

Промывные воды бронхов, гайморовых пазух, плевральный экссудат, спинномозговую жидкость собирают в стерильные пробирки,

Кровь на гемокультуру берут в количестве 5-10 мл из локтевой вены после тщательной обработки кожи в области локтевого сгиба.

Фекалии (последнюю порцию) собирают в небольшом количестве в стерильную баночку с завинчивающейся крышкой,

Мочу (последнюю порцию) собирают после туалета наружных половых органов в количестве 10-15 мл в стерильные баночки.

Отделяемое свищей, в случае обильного выделения, можно собирать в стерильные пробирки. При незначительном количестве отделяемого, материал собирают тампоном, пастеровской пипеткой или бактериологической петлей.

Отделяемое наружного слухового прохода, конъюнктивы глаза собирают стерильным сухим тампоном.

Кожные чешуйки соскабливают скальпелем с поверхности очага поражения, а ногтевые - из глубоких слоев ногтевой пластинки. Чешуйки собирают в стерильную чашку Петри.

Кусочки органов и биопсированную ткань собирают в 2 стерильные баночки. Одну пробу заливают 10% формалином для гистологии, вторую - используют для микологического исследования.

К направляемым анализам прилагается сопроводительный документ, где указывается фамилия, имя, отчество больного, возраст, предполагаемый диагноз, номер истории болезни, наименование исследуемого материала.

Патологический материал транспортируется в специальной таре или металлических биксах. Спинномозговая жидкость доставляется в специальных термосах с температурой +37°С. Поступивший в лабораторию материал может исследоваться в течение дня.

4. Микроскопическое исследование и посев патологического материала

4.1. Приготовление микропрепаратов из патологического материала

Патологический материал может исследоваться в нативных и окрашенных препаратах. Предметные и покровные стекла, предназначенные для приготовления микропрепаратов, должны храниться в смеси спирта с эфиром (1:1) во избежание загрязнения микрофлорой воздуха. Перед употреблением предметные и покровные стекла стерилизуют над пламенем горелки,

Микроскопия мокроты. Для приготовления нативных препаратов мокроту переносят в стерильную чашку Петри и рассматривают на черном фоне для обнаружения мелких частиц (комочков). Комочки могут быть гнойные, гнойно-слизистые, гнойно-кровянистые. Размеры комочков варьируют по величине в пределах 0,3-3 мм в диаметре, цвет их может быть серым, желтоватым, зеленоватым.

Для приготовления нативных микропрепаратов отдельные комочки переносят препаровальными иглами или бактериологической петлей в каплю спирта с глицерином, либо в каплю 10% раствора KОН. Покрывают покровным стеклом, слабо надавливают препаровальной иглой и микроскопируют при малом (1:80, окуляр 10х и объектив 8х) и большом (1:400, окуляр 10х и объектив 40х) увеличениях микроскопа.

Препараты из промывных вод, экссудата, а также желчи, мочи, желудочного сока, ликвора готовят из нативного осадка или из осадка полученного в результате центрифугирования (при 1500 об./мин в течение 5 минут). Осадок петлей или пастеровской пипеткой переносят в каплю 10% раствора KОН на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и рассматривают при малом и большом увеличениях микроскопа.

Для приготовления окрашенных препаратов исследуемые комочки или каплю осадка равномерно распределяют препаровальными иглами или предметным стеклом меньшего размера по поверхности стерильного предметного стекла до получения тонкого мазка. Полученный мазок подсушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (равные части 96° этилового спирта и эфира) в течение 3-5 минут, либо троекратным фламбированнием над пламенем горелки. Фиксированный мазок окрашивают по Граму. Окрашенный препарат микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа (1:900, окуляр 10х объектив 90х).

При микроскопии нативных препаратов обнаруживают цепочки конидий (иногда отдельные конидии), фрагменты мицелия, конидиеносцы. Клетки гиф мицелия имеют четкие контуры, гомогенное или вакуолизированное содержимое; конидии с гладкой или шероховатой (шиповатой) оболочкой.

При микроскопии окрашенных препаратов обнаруживают грам-положительные или грам-отрицательные морфологические элементы плесневого гриба (гифы мицелия, конидиеносцы, отдельные конидии или цепочки конидий).

В гистологических препаратах можно обнаружить ветвящийся мицелий или отдельные фрагменты мицелия, конидии, иногда конидиеносцы. В зависимости от метода окрашивания, структурные элементы клетки гриба (стенки мицелия, конидий, цитоплазма) приобретают ту или иную окраску.

4.2. Методика посева

При исследовании любого патологического материала на плесневую флору его засевают на плотную среду Сабуро или сусло с добавлением пенициллина и стрептомицина (100-200 ед./мл среды). Посев производят в двух повторениях, учитывая различные температурные режимы выращивания плесневых грибов (+37°С и 28°С), всегда в 3 точки в центре чашки. Время инкубации 4-5 суток.

Одновременно с посевом патологического материала осуществляют контрольный посев воздуха на плесневую микрофлору в помещениях лаборатории и палат, где находятся обследуемые больные. Пробы воздуха отбирают методом седиментации или аппаратом Кротова.

Мокроту (отобранные комочки) переносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на поверхность среды Сабуро или сусла. Место посева отмечают карандашом с обратной стороны дна чашки Петри. Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышкой вверх.

После инкубации засеянные чашки просматривают и при обнаружении спороношения определяют культуру гриба. В случае отсутствия спороношения гриб пересевают на дифференциальную среду Чапека с целью дальнейшей идентификации.

Осадок промывных вод бронхов, гайморовых полостей, экссудата, мочи, желудочного сока (нативный или после центрифугирования) забирают пипеткой и засевают в объеме 0,1 мл.

Фекалии разводят 1:10 (1 г фекалий и 9 мл жидкости) в жидкой среде Сабуро или жидком стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, эмульгируют, отстаивают 10 мин для осаждения крупных частиц, засевают надосадочную жидкость в объеме 0,1 мл.

Отделяемое наружного слухового прохода и зева, взятое тампоном, сеют, тщательно проводя каждой стороной тампона по поверхности питательной среды. Можно засевать смывы с тампонов. Для этого тампоны помещают в 10 мл жидкой среды Сабуро или жидкого сусла со стеклянными бусами и эмульгируют 10 мин, засевают 0,1 мл смыва с тампона газоном (Лещенко В.М., 1973), либо в три точки.

Кожные и ногтевые чешуйки помещают на поверхность питательной среды, тщательно прижимая их.

Осадок спинномозговой жидкости сеют на две чашки среды но 0,1 мл, а остаток спинномозговой жидкости засевают в среду обогащения (жидкая среда Сабуро или жидкое сусло), разлитую по пробиркам в объеме 5 мл. Засеянные чашки инкубируют как обычно, а пробирки с посевом на среде обогащения - при +28°С в течение 10 дней.

В случае наличия роста плесневой флоры на плотных средах культуру гриба определяют из этого посева, при отсутствии роста на Сабуро-aгape или сусло-агаре гриб изучают со среды обогащения. Для этого культуру гриба пересевают на дифференциальную плотную среду Чапека и в дальнейшем идентифицируют.

Из кусочка ткани органа (биопсия, аутопсия) делают отпечаток на поверхность плотной среды надрезанной стороной исследуемого кусочка в трех точках. Одновременно кусочки тканей помещают в 50 мл жидкой питательной среды (Сабуро, сусло).

Кровь исследуют при подозрении на фугемию в двух-трех повторах. Засевают 5 или 10 мл крови, соответственно в 50 или 100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозы. Посевы выращивают при +37°С и +28°С в течение 10 дней. Первый просмотр посевов проводят через 5 дней, второй - через 10 дней. На пятые сутки можно наблюдать рост плесневого гриба в виде войлочного комочка на дне и поверхностной пленки. Грибницу пересевают на дифференциальную среду Чапека для определения рода и вида гриба. Если на 5-й день рост гриба не отмечается, посевы выдерживают до 10 дней и при отсутствии роста результаты исследования регистрируют как отрицательные.

5. Идентификация выделенных культур плесневых грибов

После выделения культур плесневого гриба их пересевают на дифференциальную среду Чапека для родового и, по возможности, видового определения. Идентифицируют 4-5-дневные культуры гриба со спороношением.

В практике диагностических лабораторий, как правило, используют культурально-морфологические критерии идентификации:

1) характер роста культуры гриба на агаровых средах (культуральная диагностика);

2) микроморфология гриба.

В затруднительных случаях используют дополнительные методы диагностики (изучение ферментативной активности, температурных особенностей роста некоторых плесневых грибов).

5.1. Макроморфология (культуральные признаки)

Описывают структуру колонии (пушистая, войлочная, бархатистая, паутинистая, шерстистая, клочковатая, мучнистая и др.), поверхность (плоская, складчатая, бугристая, куполообразная, коремиеформная, зональная и др.), пигментацию колонии гриба и субстрата (различные оттенки зеленого, голубого, фиолетового, черного, серого и др.), наличие экссудата на поверхности колонии.

5.2. Микроморфология гриба из культуры

Микроморфологию изучают по нативным препаратам, которые в зависимости от родовой принадлежности гриба готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости для приготовления препаратов (равные части спирта, глицерина и воды); в нее помещают кусочек грибницы, вырезанный микологической лопаточкой из колонии в виде треугольника с захватом центральной и периферической части, двумя препаровальными иглами расправляют вырезанный кусочек, с осторожностью во избежание образования пузырей воздуха. В некоторых случаях (мукор и ризопус) при приготовлении препарата грибницу расправляют на сухом предметном стекле, затем на нее наносят каплю жидкости и покрывают покровным стеклом.

Препараты просматривают под микроскопом при малом и большом увеличениях. Изучают субстратный и воздушный мицелий, отмечают наличие или отсутствие септ (перегородок), обращают внимание на характер спороношения: конидиеносцы с конидиями и спорангии со спорангиеспорами. Конидиеносцы различны по своему строению: от простых одиночных спороносных гиф до ветвистых древовидных образований.

Конидиеносцы располагаются по одиночке либо группами, заметно отличающиеся от вегетативных гиф мицелия, бесцветные или окрашенные, приподнимающиеся, прямостоящие, ниспадающие, стелющиеся. Они могут состоять из одной клетки и из большого количества разных по форме и величине клеток, каждая из которых имеет свое наименование.

Например, у рода Aspergillus конидиеносец состоит из следующих клеток: ножки, пузыревидного вздутия, стеригм, цепочек конидий. У рода Penicillium конидиеносец имеет форму простых или сложных кисточек, состоящих также из различных клеток: веточек-рами, метул, фиалид, цепочек конидий (рис. 1 и 2, приложение 1).

У плесневых грибов (Mucor и Rhizopus) спороношение в виде спорангиев с эндоспорангиоспорами. Спорангий находится на конце спорангиеносца. Спорангии шаровидной или грушевидной формы, у большинства с особой колонкой, являющейся продолжением спорангиеносца внутрь спорангия. Спорангиоспоры округлые, бесцветные или окрашенные.

Конидии (споры) (рис. 1-9, приложение 1) у плесневых грибов полиморфные (цилиндрические, шаровидные, овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, булавовидные) одно- и многоклеточные варьируют по размеру и окраске, одиночные, цепочками, собраны в головки или располагаются гроздьями. Поверхность конидий может быть гладкая, шероховатая, шиповатая, бородавчатая, щетинистая и т.д.

6. Характеристика важнейших родов и видов плесневых грибов

6.1. Род Aspergillus
(рис. 1, приложение 1)

Конидиеносцы большей частью несептированные, неветвящиеся, на конце вздутые в виде пузыря, на поверхности которого тесным слоем расположены цилиндрические клетки - стеригмы, несущие каждая цепочку конидий, в результате чего получается шаровидная головка конидий. Головка может быть радиальной, когда стеригмы и продолжающие их цепочки конидий свободно расходятся по радиусам, и не радиальной, когда стеригмы имеются только на верхней половине пузыря, прижатые кверху. У многих видов стеригмы расположены в два слоя (ряда). Стеригмы внутреннего слоя - первичные, а стеригмы наружного слоя - вторичные. Вторичные стеригмы сидят по несколько штук на концах первичных стеригм, и только они дают цепочки конидий, срастающиеся своими боками в "колонку". Мицелий и конидиеносцы у большинства бесцветные, конидии же окрашены в светлые тона (преобладают зеленый и сизый) или немногие - почти в черный (A. niger). Та или иная окраска колоний определяется, главным образом, цветом массы конидий и в меньшей степени - изменением с возрастом цвета мицелия и пигментов, выделяемых им в субстрат.

6.1.1. Aspergillus fumigatus

Колонии гладкие, бархатистые или шерстисто-клочковатые, зеленые (разные оттенки), обратная сторона колонии бесцветная или желтая. Конидиеносцы гладкие, часто зеленоватые, септированные или несептированные, большей частью 300-500 мкм длины и 2-8 мкм ширины. Конечное вздутие обратно-фляжковидное, 20-30 мкм в диаметре, несущее стеригмы, в основном только в верхней половине. Стеригмы 6-8х2-3 мкм пригнуты кверху. Каждая стеригма отчленяет цепочку конидий. Гриб термофильный, хорошо растет при температуре 37°С, некоторые расы растут при 52°С.

6.1.2. Aspergillus niger

Колонии гладкие, бархатистые, пушистые от развития воздушного мицелия. Мицелий белый или желтоватый, спороносная зона колоний темно-фиолетового, шоколадного или черного цвета, обратная сторона колонии светло-желтая. Конидиеносцы гладкие, чаще бесцветные, 200-400 мкм длины и 7-10 мкм ширины. Конечное пузыревидное вздутие круглое, бесцветное или бурого цвета, от 20 до 100 мкм в диаметре. Стеригмы двурядные, первичные (нижние) - цилиндрические, чаще 20-30 мкм, иногда до 120 мкм, вторичные стеригмы 6-10х2-3 мкм, чаще буроватого цвета. Конидиальные головки радиальные. Конидии круглые, гладкие либо бородавчатые, 2,5-4 мкм в диаметре. Внутри вида много разновидностей и рас, отличающихся как морфологическими, так и физиологическими свойствами.

6.1.3. Aspergillus flavus

Колонии клочковатые, зеленовато-желтого цвета (окраска варьирует у разных рас). Обратная сторона колонии желтоватая. Конидиеносцы желтые, шероховатые, 400-700 мкм длиной и 5-15 мкм шириной. Конечное пузыревидное вздутие круглое, 10-40 мкм в диаметре. Конидиальные головки не радиальные. Стеригмы большей частью с колонкой конидиальных цепочек, однорядные в малых головках, размером 10-15х3-5 мкм, или двурядные в более крупных головках. В последнем случае первичные стеригмы 7-10х4-5 мкм, а вторичные - 7-10х2,5-3,5 мкм. Конидии грушевидные или круглые 2-5x3-6 мкм в диаметре. Обильные склероции сначала белые, потом буреющие.

6.1.4. Aspergillus nidulans

Колонии бархатистые, клочковатые. Обратная сторона колонии красно-бурая, конидиеносцы бурые, гладкие, 60-100 мкм длиной и 3-5 мкм шириной. Пузыревидное вздутие грушевидной формы, 7-15 мкм шириной. Стеригмы двурядные, прижатые. Конидии шаровидные, чаще гладкие (могут быть шероховатые), 3-3,5 мкм в диаметре, зеленоватого или оливкового цвета.

6.2. Род Penicillium
(рис. 2, приложение 1)

Мицелий бесцветный или светлоокрашенный. Конидиеносцы бесцветные, большей частью септированные, прямостоящие, в верхней части один или несколько раз мутовчато разветвленные, образуют характерно построенную кисточку, несущую на конечных разветвлениях цепочки конидий. Конидии одноклеточные, округлые или овальные, в массе большей частью зеленоватые. Строение кисточки в деталях различно, оно положено в основу видовой систематики рода PeniciIlium.

Различают основные типы ветвлений кисточек:

1) Одномутовчатые.

2) Двумутовчатые.

3) Многомутовчатые.

4) Несимметричные.

5) Неправильные.

У некоторых видов грибов рода Penicillium конидиеносцы соединяются в пучки-коремии, У немногих видов известны сумчатые спороношения в виде клейстотеций (клейстокарпиев).

6.2.1. Penicillium kewense Smith

Колонии плоские, бархатистые, приподнятые в центре, серовато-сизые, светло-желтые с белым краем; с обратной стороны - коричневые. Пигмент диффундирует в питательный агар; на поверхности колонии имеются светлые капельки экссудата.

Конидиеносцы гладкие, кисточки двуярусные, ассиметричные с одной веточкой. Стеригмы с хорошо выраженной конидиеносной шейкой. Конидии грушевидные, гладкие или слегка шероховатые.

6.2.2. Penicillium expansum Link. Syn. P. glaucum Link

Колонии быстрорастущие, радиальнобороздчатые, от светло-голубого до желто-зеленого цвета. С возрастом колонии приобретают зернистый или мучнистый вид; обратная сторона колонии оранжево-коричневая или пурпурная, с сильным плесневым запахом. Конидиеносцы (150-700х3-3,5 мкм) гладкие или мелко-шероховатые. Веточки большей частью 15-25х2,5-3,5 мкм, иногда до 50 мкм длины, прижатые к главной оси.

Метулы 10-15x2,2-3 мкм по 3-6. Стеригмы 8-12х2-2,5 мкм, иногда до 15-16x3 мкм по 5x9 в пучке. Конидии эллиптические, 3-3,5 мкм в диаметре, гладкие, темно-желто-зеленые в массе.

6.2.3. Penicillium citrinum Thom

Колонии типично радиальнобороздчатые, обычно бархатистые, иногда пушистые, с конидиеносной зоной вначале голубовато-зеленой, затем зелено-серой, при созревании переходящей в мышино-серые тона. Обратная сторона колонии и питательная среда окрашиваются в желто-оранжевый цвет. На поверхности колонии обильный экссудат в виде капелек желтого или соломенного цвета. Конидиеносцы отходят от субстрата или от воздушных гиф, 50-200X2,2-3 мкм несущие одну или несколько веточек 25-35 мкм длины, гладкие. Метулы по 3-4 или более в верхушечной мутовке, 12-20х2,2-3 мкм. Стеригмы по 6-10 в пучке, 8-11X2-2,8 мкм. Конидии шаровидные, 2,5-3 мкм, гладкие, иногда зернистые.

6.3. Род Scopulariopsis
(рис. 3, приложение 1)

Колонии серовато-белые, затем песочные с желтоватым оттенком, никогда не имеющие зеленоватых тонов окраски. Конидии толстостенные, большей частью бородавчатые и с ростковой порой в основании. Конидиеносцы короткие, образующие нормальные многомутовчатые кисточки, иногда сильно редуцированные до пучка фиалид или даже до отдельных фиалид.

6.3.1. Scopulariopsis brevicaulis var hominis Brumpt et Langeron

Колонии с возрастом мучнистые, бежевого или песочного цвета. Конидиеносцы короткие, сидящие с боку на гифе мицелия. Фиалиды трубчато-конические, длинные, суживающиеся постепенно от основания к вершине. Конидии округлые или грушевидные 6x7 мкм с толстыми грубобородавчатыми оболочками и порами (тонким местом) в основании. Окраска конидий в массе никогда не бывает зеленой.

6.4. Род Acremonium
(рис. 4, приложение 1)

Мицелий септированный, ветвящийся, стелющийся по субстрату. Конидиеносцы неветвящиеся, несущие верхушечно одиночные бесцветные или светлоокрашенные, большей частью яйцевидные, мелкие, гладкие, конидии, иногда склеенные слизью в шаровидные головки.

6.4.1. Acremonium kiliense

Колонии плотные, шерстистые, хлопковидные или войлочные, вначале белые, позже розовые или красноватые. Конидиеносцы прямостоящие, несептированные, неразветвленные, 40-60х3 мкм. Конидии многочисленные, яйцевидные, эллипсоидные, бесцветные или в массе светло-розовые, 3-4х1-1,5 мкм, собраны в склеенные слизью шаровидные головки, достигающие 14-16 мкм в диаметре.

6.4.2. Acremonium falciforme Car

Колонии гладкие либо складчатые, бугристые, пушистые, белые, с обратной стороны розовато-коричневые; конидиеносцы тонкие, бутылковидные, 2-4х6-10 мкм, искривленные, иногда септированные; конидии овальные, собранные в шаровидные головки, склеенные слизью.

6.5. Род Cephalosporum corda
(рис. 5, приложение 1)

Мицелий септированный, стелющийся. Конидиеносцы, как правило, неветвящиеся, редко слаборазветвленные, в виде отчетливо обособленных боковых ответвлений гиф; прямостоящие, несептированные, на вершине неутолщенные. Конидии одноклеточные, эллипсоидные, продолговатые, бесцветные или светлоокрашенные; собраны в шаровидные головки.

6.5.1. Cephalosporium anoma Boucher

Колонии бархатистые, пушистые, хлопьевидные, вначале белые, затем серовато-розоватые. Конидиеносцы латеральные, септированные, 7,5-70 мкм; конидии овальные до 5 мкм, собранные в головки.

6.5.2. Cephalosporium granulomatis Weid et Klig

Колонии пушистые, ровные, с коремиями в центре, сероватые. Конидиеносцы прямостоящие, простые, 14-18Х5-1,5 мкм; конидии удлиненные, округлые или овальные 2,8-3,5Х0,7-1,3 мкм, склеенные в шаровидные головки.

6.6. Род Alternaria neis ex wallroth
(рис. 6, приложение 1)

Мицелий стелющийся, септированный. Колонии вначале белые, затем оливковые или оливково-бурые, войлочные. Конидиеносцы одиночные, или пучками, короткие либо удлиненные, прямые или изогнутые, несептированные или септированные, окрашенные. Конидии в акропетальных простых или разветвленных цепочках, легко распадающихся. По форме конидии обратнобулавовидные, реже - обратнояйцевидные, большей частью с округленным основанием и с конусовидной, часто вытянутой к вершине, шейкой; нижняя и средняя части конидий муральные (т.е. с рядом поперечных и продольных перегородок), окрашенные в оливковые, зеленоватые, коричнево-бурые тона.

6.6.1. Aliernaria aliernata Nees ex Fries

Колонии бархатистые, войлочные от дымчато-серых до оливково-черных тонов. Конидиеносцы простые или разветвляющиеся, септированные, коленчатые, обычно одиночные, темно-оливковые или оливково-бурые. Конидии в цепочках по 8-12 с 3-9 поперечными и 2-3 или несколькими продольными перегородками, с перетяжками у перегородок; конидии темно-оливковые или оливково-бурые до коричневато-черных, гладкие или шероховатые, 30-50х14-18 мкм, по форме разнообразные.

6.7. Род Cladosporium link ex fries (рис. 7, приложение 1)

Мицелий стелющийся, септированный, часто со вздутыми клетками, бурый или оливковый. Конидиеносцы прямостоящие, простые или слаборазветвляющиеся, оливковые или оливково-зеленые.

Конидии полиморфные (яйцевидные, продолговато-эллиптические, цилиндрические), окрашенные в светло-коричневые тона; гладкие или шиповатые, вначале одноклеточные, позже двуклеточные. Конидии образуют древовидно- и дихотомически разветвленные цепочки. Имеются хламидоспоры терминальные и интракалярные.

6.7.1. Cladosporium banlianum (Syn. CI. trichoides Emmons)

Колонии бархатистые, с приподнятым центром, врастающие в субстрат; темно-оливковые или темно-коричневые, почти черные. Обратная сторона колонии черного цвета. Конидиеносцы древовидные, септированные, коричневые, шириной 2-3 мкм. Конидии полиморфные (яйцевидные, овальные), в длинных цепочках, светло- или темно-коричневые; гладкие, вначале одноклеточные, с возрастом двуклеточные.

6.8. Род Fusarium link ex fries
(рис. 8, приложение 1)

Мицелий хорошо развит, белый, соломенно-желтый, бело-розовый, пурпурный, синевато-лиловый или буроватый. Обратная сторона колонии (строма) имеет различную окраску - от розоватых до красно-коричневых и синих тонов.

Конидии двух типов. Микроконидии образуются на простых или разветвленных конидиеносцах, одиночные или скученные в ложные головки, иногда в цепочках, овальные, яйцевидные, эллипсоидные, удлиненные, реже шаровидные, грушевидные, большей частью одно-, двухклеточные.

Макроконидии часто скученные и вместе с конидиеносцами образуют сплошной слой на строме - т.н. спородохии, или собраны в виде слизистого слоя на обычном сплетении гиф, образуя т.н. пионноты. Среди макроконидий преобладают по форме серповидные, веретеновидные, суженные к обоим концам, у основания с выраженной ножкой или сосочком. Количество поперечных перегородок 3-5 или 6-10. Свободный конец макроконидии (верхушечная клетка) короткий конусовидный, клювовидный, иногда закругленный или заостренный. Макроконидии в массе светлоокрашенные, розоватых и желтоватых оттенков.

Хламидоспоры возникают в гифах и макроконидиях, терминальные, интракалярные, одиночные, в цепочках или скученные в клубочки. В массе окрашены в коричневый или желто-бурый цвет различных оттенков.

6.8.1. Fusarium solani (Martius) Sacc

Колония пушистая или пленчатая белая, бело-розовая, желтоватая. Обратная сторона колонии (строма) серовато-розово-лиловая. Хламидоспоры конечные и промежуточные, округлые и грушевидные, одноклеточные 8,5-8,0 мкм и двуклеточные 12,0-8,0 мкм; редко цепочками, гладкие, иногда с мелкозубчатой оболочкой. Микроконидии собраны в ложные головки. Макроконидии в спородохиях и пионнотах, веретено-видно-серповидные, обычно с тремя и пятью перегородками; кремово-желтые, зеленые. Размеры макроконидий 31,8-40,2х5,5-6,0 мкм.

6.9. Мuсоr mich
(рис. 9, приложение 1)

Мицелий несептированный, субстратный и воздушный, белый или сероватый; в воздушном мицелии у многих имеются особые столоны в виде толстых маловетвящихся гиф с дугообразным ростом. Бесполые спороношения - спорангии, расположенные на спорантиеносцах (спорангиеносцы бывают простые и ветвящиеся). Спорангии шаровидной или грушевидной формы с особой колонкой в виде продолжения конца спорантиеносца внутрь спорангия. У некоторых имеется апофиза в виде воронковидного или иной формы расширения спорангиеносца непосредственно под спорангием. Оболочка расплывается при созревании спорангия и лишь в нижней его части сохраняется в виде воротника вокруг основания колонки.

6.9.1. Mucor mucedo

Колонии пушистые, войлочные, серые. Спорангии 100-200 мкм, сначала желтые, потом темно-серые; колонка цилиндрическая, иногда грушевидная с желтым содержимым. Споры цилиндрические 12-15х5,5 мкм. Спорангиеносец 22-50 мкм.

6.9.2. Mucor pusillus

Колонии гладкие, бархатистые, серые, спорангиеносцы прямостоящие, с 1-2 ветвями, отходящими почти под прямым углом, 180-400 мкм высотой. Спорангии с апофизой, темно-серые или буроватые, до 60 мкм в диаметре; колонка шаровидно-грушевидная, дымчатая, 18-45х14-35 мкм. Споры 3-5 мкм в диаметре.

6.9.3. Mucor racemosus

Колонии рыхло-войлочные, вначале белые или желтоватые, затем буреющие. Спорагиеносцы моноподиальные, 8-20 мкм толщиной; спорангии шаровидные, 20-70 мкм в диаметре, желтые или бурые; колонка грушевидно-эллиптическая или шаровидная. Споры широкоэллиптические, иногда почти шаровидные, 6-10х5-8 мкм. Обильные хламидоспоры.

6.10. Род Rhizopus ehrenb
(рис. 10, приложение 1)

Имеется обильная воздушная грибница, состоящая из гиф и столонов, а у некоторых - только из столонов. Столоны хорошо дифференцированные, с ризоидами (корневидными отпрысками мицелия) и спорангиеносцами. Спорангиеносцы неветвящиеся, спорангии крупные, шаровидные, большей частью с апофизой. Споры часто неправильной формы, обычно продольно исчерченные.

6.10.1. Rhizopus orizae

Колония пушистая с хорошо развитым воздушным мицелием, темно-серая, почти черная; спорангиеносцы одиночные или группами по 2-5, 600-1000 мкм длиной, иногда ветвящиеся, с ризоидами.

6.10.2. Rhizopus nigricans

Колония бархатистая, воздушный мицелий отсутствует. Субстратный мицелий в виде длинных темных столонов, от которых отходят вниз ризоиды и вверх - спорангиеносцы, Спорангиеносцы коричневые, почти черные, неразветвленные, большей частью группами по 3-5 и больше на узлах столонов, 2-4 мкм высотой. Спорангии округлые, с кубковидной апофизой, 100-200 мкм. Колонка шаровидная. Споры эллиптические, угловатые, исчерченные, темные, 8-14х6-11 мкм.

6.11. Род Absidia van tiegh
(рис. 11, приложение 1)

Столоны темные, в виде очень правильной системы крутых дуг с ризоидами в узлах и спорангиеносцами посредине дуги, расположенными одиночно или по 2-5. Спорангии с воронковидной апофизой.

6.11.1. Absidia corymbifera

Колонии пушистые, вначале белые, затем серые. Спорангиеносцы расположены по 2-5 на дугах столонов. Спорангиеносцы до 250 мкм длиной; спорангии грушевидной формы, 40-60 мкм; с конической апофизой - размер 50-100 мкм. Споры шаровидные или эллиптические, бесцветные, гладкие или шероховатые.

7. Иммунологические исследования

Иммунный ответ при микозах, вызванных плесневыми грибами, мало изучен, следовательно, иммунологическая диагностика этих заболеваний недостаточно разработана. При развитии этих микозов в организме происходят сложные взаимодействия между хозяином и возбудителем. В большинстве случаев иммунный механизм хозяина прямо содействует развитию патологического процесса, но иногда на этом фоне формируется иммунный ответ на плесневые грибы. Поэтому традиционные иммунологические реакции, рассчитанные на выявление специфических антител или же для характеристики показателей клеточно-опосредованного иммунитета в диагностическом значении у больных плесневыми микозами имеют ограниченную достоверность. Здесь следует также упомянуть о том, что специфичность реакций при этих микозах относительна, а не абсолютна, т.к. антигены плесневых грибов дают значимые перекрестные реакции не только между собой, но и с представителями грибов других родов: Candida, Blastomyces, Coccidioides immitis, Geotrichum, Sporothrix.

В связи с тем, что при микозах, вызванных плесневыми грибами, у больных с тяжелыми нарушениями иммунитета нередко отсутствует иммунный ответ, в особенности гуморальный, представляется перспективным в качестве диагностики обнаружение антигенов в тканевых жидкостях больных.

В настоящее время иммунологические реакции наиболее изучены при микозах, обусловленных грибами рода Aspergillus.

Плесневые грибы рода Aspergillus ответственны по крайней мере за 5 патологических синдромов, два из которых проявляются в виде инвазивного процесса (инвазивный аспергиллез, аспергиллема), три - в виде легочной гиперчувствительности (астма, аллергический бронхолегочный аспергиллез, экзогенный аллергический альвеолит).

1. Инвазивный аспергиллез. При этой патологии грибы рода Aspergillus, преимущественно A. fumigatus, реже - A. flavus, A. niger A. nidulans, находясь на коже и в просвете дыхательных путей, обычно вызывают поверхностные локальные инфекции кожи или слизистых оболочек. К ним относятся наружный отит, легочная аспергиллема, аллергический бронхо-легочный аспергиллез и т.д. Только у больных с иммунодефицитом аспергиллы проникают в ткани хозяина и вызывают инвазивный аспергиллез, который характеризуется тяжелым течением. Своевременная иммунологическая диагностика инвазивного аспергиллеза представляется крайне важной для эффективной терапии этой инфекции.

Однако иммунологические исследования при этом ограничены, т.к. большинство профильных больных иммуносупрессированы применением стероидов и цитотоксических препаратов, которые подавляют функции как Т-, так и В-лимфоцитов, а также и активность фагоцитарных клеток. Поэтому чаще диагноз подтверждается обнаружением гриба Aspergillus в тканях при помощи гистологических методов исследования.

Для иммунодиагностики инвазивного аспергиллеза наиболее пригодными являются такие реакции, как встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и метод иммуноферментного анализа (ИФА - "ELISA"). Положительные титры антител у больных инвазивным легочным аспергиллезом при использовании очищенного гликопротеидного антигена из мицелия A. fumigatus получены в реакциях ВИЭФ и РНГА у 30% больных, при ИФА - у 80%.

В настоящее время выявление антигена Aspergillus в сыворотке больных при помощи ИФА представляется более целесообразным и перспективным для иммунодиагностики инвазивного аспергиллеза. Этот метод определяет антиген гриба и фактически является независимым от иммунного ответа.

2. Аспергиллема. Аспергиллемы развиваются у неатопических лиц. В процессе роста гриба внутри полости легкого формируются шарообразные скопления мицелия диаметром до 5 см. Часто эта полость остается после туберкулеза, легочного абсцесса, саркондоза и др. Аспергиллема сопровождается продукцией большого количества антител класса IgG в сыворотке, но в отличие от аллергического бронхо-легочного аспергиллеза уровень IgE антител не повышается. Это свидетельствует о том, что грибы Aspergillus не во всех ситуациях действуют как аллергены.

Наличие антител IgG в сыворотке больных с аспергиллемой выявляется при помощи реакций ВИЭФ, РНГА, ИФА в более чем 90% случаев. Особенности клеточно-опосредованного иммунитета у этих больных изучены недостаточно.

Болезни, обусловленные повышенной чувствительностью организма к антигенам плесневых грибов (астма, ринит, конъюнктивит, аллергический бронхо-легочный аспергиллез, экзогенный аллергический альвеолит). При этих болезнях повреждение тканей обусловливается механизмами повышенной чувствительности. Инвазия в ткани отсутствует. Как правило, аллергены передаются по воздуху со спорами или фрагментами мицелия определенных плесневых грибов.

Плесневые грибы чрезвычайно разнообразны, отличаются большим полиморфизмом; аллергенные свойства доказаны лишь у небольшого числа грибов из родов: Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Penicillium.

Для аллергических заболеваний, вызванных этими грибами, характерны обострения в осенний период, при сырой погоде, во время пребывания в таких помещениях, как подвалы, хлевы, сараи. Контакты с плесневыми грибами более часто отмечаются у сельскохозяйственных работников, у садовников, овощеводов, мельников, пекарей, сапожников, работников химических и фармакологических производств и др.

Споры плесневых грибов имеют различные размеры, но многие из них малы - около 1-2 мкм. Они легко проникают в легкие и длительное время сохраняются в них. В зависимости от особенностей иммунной реактивности организма, а также продолжительности, кратности и интенсивности контакта с аллергеном, плесневые грибы могут вызывать продукцию антител как IgE типа, так и типа IgG.

1. Астма. У больных с атопией контакт с аллергеном плесневых грибов наиболее часто вызывает образование антител IgE и, следовательно, гиперчувствительность немедленного типа - ГНТ. Клинически это состояние нередко проявляется в виде астмы с опосредованным IgE клеточным механизмом. В сыворотке у этих больных (неосложненная астма, а также ринит, конъюнктивит) выявляется повышенный уровень концентрации общего IgE и специфические антитела, определяемые при помощи радиоиммуносорбентного теста (РИСТ) и радиоаллергосорбентного теста (PACT), соответственно. Специфический IgE можно измерить также при помощи более нового, связанного с ферментом, иммуносорбентного теста (ИФА), который позволяет избежать применения радиоактивной метки. Результаты, полученные при определении сывороточного специфического IgE у больных с клиническими специфическими симптомами к плесневым грибам, точно коррелируют с результатами реакции дегрануляции базофилов (РДБ) и уколочных тестов.

2. Аллергический бронхо-легочный аспергиллез (АБЛА). АБЛА представляет собой заболевание лиц с атопией. При этом заболевании происходит прорастание спор гриба с образованием мицелия внутри бронхиол. Это приводит к сильному антигенному стимулу, и у этих больных сыворотки содержат как IgE, так и преципитирующие IgG антитела.

К выраженным клиническим проявлениям АБЛА относится астма, которая почти всегда сопровождается легочной эозинофилией. Кроме того, постоянно наблюдаются рецидивирующие проходящие затемнения на рентгенограммах грудной клетки и двойственная реакция (реакции I и III типа) на внутрикожную инъекцию антигена A. fumigatus. В клинической практике наличие астмы и легочной эозинофилии и немедленная кожная проба типа I со специфическим антигеном весьма убедительно указывают на диагноз АБЛА. Известно, что преципитины имеются у 60-70% больных, однако при использовании более чувствительных тестов на антитела, таких как ВИЭФ и ИФА, доказано присутствие антител IgG почти всегда.

Иммунодиагностика аллергического бронхо-легочного аспергиллеза, особенно у больных, прошедших курс кортикостероидной терапии, а также на ранних стадиях заболевания затруднена. Постановка диагноза при помощи определения уровня IgE и IgG антител особенно эффективна в остром периоде и при повторных обострениях заболевания.

3. Экзогенный аллергический альвеолит. Этот синдром связан с сенсибилизацией организма человека переносимыми по воздуху спорами гриба и проявляется в поражении дистальных отделов дыхательного тракта. Эта болезнь проявляется лихорадкой, ознобами, одышкой и кашлем через 4-8 часов после контакта с заплесневелыми растительными продуктами, обычно сеном, зерном. Сельскохозяйственные рабочие, контактирующие с заплесневелым сеном и другими продуктами, вдыхают плотные аэрозоли спор грибов. Эти споры образуются в огромных количествах, и так как очень малы по размеру (диаметр около 1 мкм), то не только проникают в альвеолы, но и могут остаться там. Повторный контакт с аллергеном индуцирует образование преципитирующих IgG и IgM антител. Реакция с антигеном сопровождается связыванием комплемента, активацией альвеолярных макрофагов с последующим развитием альвеолита. Без терапии болезнь заканчивается необратимым пневмофиброзом.

Почти во всех случаях экзогенного аллергического альвеолита, особенно при острой форме, сыворотки крови у больных содержат преципитирующие антитела, которые можно обнаружить при помощи ВИЭФ, ИФА и др. После того, как прекращается контакт с источником антигена, благодаря перемене профессии или неспособности продолжать работу, уровень антител снижается, и в конечном счете они исчезают.

8. Этиологическая роль гриба, критерии достоверности

Этиологическая роль плесневого гриба, выделенного из патологического материала больного, определяется по следующим критериям:

1) клиническая картина заболевания, включая рентгенологические данные;

2) выявление элементов плесневого гриба при микроскопии патологического материала;

3) обнаружение элементов гриба в тканях гистологическими методами исследования;

4) высев плесневого гриба из патологического материала;

5) повторный высев из патологического материала плесневого гриба того же рода и вида, что и при первом исследовании;

6) рост плесневого гриба на плотной питательной среде только в точках посева;

7) отсутствие роста идентичного плесневого гриба в контрольных чашках с посевом воздуха лаборатории, где производился посев патологического материала, и палаты, где находился обследуемый больной;

8) положительные аллергические пробы и иммунологические реакции с плесневым антигеном у обследуемого больного;

9) изучение патогенных свойств выделенного гриба в эксперименте на лабораторных животных.

В любой практической лаборатории могут быть воспроизведены семь первых критериев.

9. Определение лекарственной чувствительности плесневых грибов

С целью назначения рациональной терапии при микозах, вызываемых плесневыми грибами, необходимо определение чувствительности этих грибов к различным антифунгальным препаратам.

Для лабораторной практики следует рекомендовать метод серийных разведений в агаровой среде и диско-диффузный метод.

Метод серийных разведений в агаровой среде.

Навеску (таблетку, содержимое ампулы) препарата растворяют в воде (водорастворимые соли полиеновых антибиотиков, амфоглюкамин, амфотерицин В, миконазол), в диметилсульфоксиде (нистатин, леворнн, микогептин) или в 50% ацетоне (актидион, анкотил-5-флюороцитозин) до концентрации 1% (вес), объем - 10 мг/мл = 10 000 мкг/мл.

Исходный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой и в определенных количествах вносят в колбы с расплавленным остывающим агаром Сабуро или Чапека до конечных концентраций препаратов в интервале от 0,1 до 100 мкг/мл. После энергичного перемешивания среду разливают в чашки Петри и подсушивают. Все манипуляции производят с соблюдением стерильности.

Готовят взвеси конидий или мицелия 6-7-суточных чистых исследуемых культур в воде или изотоническом растворе хлорида натрия (с добавлением 0,001-0,01% раствора твина-80 для улучшении смачивания клеток и получения гомогенной суспензии) с содержанием грибов кл/мл.

Взвеси культур наносят на поверхность агаровой среды с помощью бактериологической петли по шаблону, помещенному под чашкой Петри, или с помощью многоштырькового металлического репликатора. Посевы производят в 3-х повторностях. Контролем служат чашки, не содержащие антибиотик. В качестве биологического контроля в опыт следует включать 1-2 индикаторных штамма с известной чувствительностью к данному препарату.

Засеянные чашки инкубируют крышками вниз в термостате при 28° в течение 5 суток. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяют по чашке с наибольшим разведением антибиотика, при котором отсутствует видимый глазом рост колоний. МИК наиболее точно характеризует уровень чувствительности выделенных штаммов к препаратам.

Диско-диффузный метод

На поверхность агаризованной среды Чапека слоем 4-5 мм, засеянной шпателем взвесью клеток испытуемого штамма, накладывают не более 6 дисков из фильтровальной бумаги средней пористости диаметром 6 мм, смоченных растворами антифунгальных препаратов в концентрации 1000 мкг/мл.

Чашки инкубируют в термостате при 28° 3-4 дня. Чувствительность штамма оценивают по диаметру зоны отсутствия роста культуры.

Метод позволяет быстро ориентировочно выявить малочувствительные к препаратам штаммы и полезен для выбора средств химиотерапии плесневых микозов.

10. Определение токсигенности плесневых грибов

Микотоксины (МТ) - это вторичные метаболиты плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими свойствами и тропностью по отношению к различным тканям и органам, а также мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью.

Наиболее важную роль в патологии человека играют афлотоксины (продуценты A. flavus, A. parasiticus), а также стеригматоцистин (A. versicolor, A. nidulans), фумитреморгены (A. fumigatus), трихотеценовые МТ и зараленон (род Fusarium), цитринин (род Penicillium).

Существуют многочисленные методы определения способности культур плесневых грибов к токсинообразованию, которые сводятся к следующему: 1) выращивание культур на оптимальных для токсинообразования средах; 2) экстракция токсинов; 3) использование биопроб для установления токсичности экстрактов; 4) идентификация МТ физико-химическими методами.

Мы рекомендуем простой и эффективный метод быстрого ориентировочного выявления продукции МТ у штаммов аспергиллов и пенициллов с помощью модифицированного метода Фогеля, апробированного нами и вполне доступного для практических лабораторий.

На дно чашки Петри наливают тонкий слой шириной 3 мм 10% суспензии кизельгеля (вариант силикагеля) с 2% агаром в дистиллированной воде, на который после затвердевания наслаивают агар Чапека с добавлением 10% по объему настоя сухарей. Чашки с помощью шпателя засевают испытуемыми культурами. Через 3-4 дня дно чашек осматривают при УФ-освещении (лампа ВУДА).

Незасеянный агар имеет темно-серый оттенок и не дает флюоресценции. Штаммы, продуцирующие афлатоксин, вызывают ярко-голубую флюоресценцию агара, стеригматоцистин - красную флюоресценцию, цитринин - желто-зеленую. Наличие флюоресценции в 90% случаев коррелирует со способностью штамма продуцировать МТ.

Список литературы:

1. Дайняк Л.Б., Кунельская В.Я. Микозы верхних дыхательных путей. - М., Медицина, 1979, стр. 246.

2. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. - М., Медицина, 1983, стр. 189.

3. Кашкин П.Н., Шеклаков Н.Д. Руководство по медицинской микологии.- М., Медицина, 1978, стр. 325.

4. Курсанов Л.И. и др. Определитель низших растений. Грибы. - М. Советская наука, 1954, т. 3-4, стр. 453.

5. Лещенко В.М. Аспергиллез. - М., Медицина, 1973, стр. 192.

6. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов - Л., Наука, 1967, стр. 302.

7. Пидопличко Н.М. Пенициллин (ключи для определения видов). - К., Наукова думка, 1972, стр. 148.

8. Тутельин В.А., Кравченко Л.В. Микотоксины - М., Медицина, 1985.

9. Alnsworth I.С. Introduction to the history of mycology, Cambridge: Camb. Univ. Press., 1976, 359 p.

10. M., I. Fungi infecting man, Taxonomy of agents of human mycoses in an alphabetical survey, Mycologle, 1985, 39, 3, p. 156-164.

Приложение 1

Морфологические особенности различных родов плесневых грибов (строение органов спороношения)