Методические указания по лабораторному исследованию спермы производителей, а также препаратов и инструментов, применяемых при искусственном осеменении животных, на бактериальную загрязненность (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 17 июля 1969 г.)

Методические указания
по лабораторному исследованию спермы производителей, а также препаратов и инструментов, применяемых при искусственном осеменении животных, на бактериальную загрязненность
(утв. Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 17 июля 1969 г.)

1. В целях ветеринарного контроля за качеством спермы производителей сельскохозяйственных животных проводят ветеринарно-санитарную оценку спермы, препаратов и инструментов, применяемых при искусственном осеменении маток. При этом в ветеринарных лабораториях проводят следующие бактериологические исследования:

а) определение общего количества микробов в сперме, смывах из препуциальной полости, на инструментах и приборах;

б) исследование сред и препаратов на стерильность;

в) определение их коли-титра или коли-индекса.

Взятие и доставка проб. 2. При взятии проб следует соблюдать условия, позволяющие предупредить загрязнение их посторонней микрофлорой. В этих целях пробы спермы и смывы из препуциального мешка производителя берут только после соответствующей подготовки самого производителя, а также манекена, инструментария, используемого при взятии спермы, и манежа, где эту работу проводят. Чтобы число микроорганизмов не увеличивалось за счет их размножения, взятые пробы для исследования хранят при температуре 2-4°С.

Пробу спермы получают от производителей только при помощи асептически подготовленной искусственной вагины. Из спермоприемника пробу берут в стерильной камере (УНБК-1) или стерильной комнате (боксе) при помощи стерильной стеклянной пипетки из средней части эякулята при слегка приподнятой крышке спермоприемника, переносят ее в сухой стерильный флакон (пробирку, колбочку) и закрывают пробкой над пламенем спиртовки. Желательны склянки с притертой пробкой. Можно также использовать и резиновые пробки, обернутые пергаментной бумагой и простерилизованные вместе с флаконами.

3. Для получения смыва в полость препуция вводят при помощи стерильного шприца и резиновой трубки 10 мл стерильного физиологического (0,9%) раствора NaCl, правой рукой зажимают кожу у входа в препуций вместе с резиновой трубкой, а левой - проводят легкий массаж в течение 1-2 минут, перемещая раствор в полости. После этого пробу смыва насасывают поршнем шприца через резиновую трубку и переносят ее в стерильные склянки.

4. Для исследования на стерильность инструментов, полистироловых пипеток и т.п. смыв с них берут в настольной стерильной камере или стерильной комнате (боксе). При взятии смыва с пипеток наружную поверхность полиэтиленового мешочка, в котором упакованы пипетки, обрабатывают тампоном, смоченным 70° спиртом. Стерильными ножницами надрезают один угол полиэтиленового мешочка и достают стерильным пинцетом пипетку. Смыв делают с внутренней и наружной поверхности пипетки.

Для взятия смыва с внутренней стороны пипетки на ее конец надевают стерильный полиэтиленовый или резиновый баллончик, с помощью которого через ту же пипетку набирают 1 мл стерильного физиологического раствора хлористого натрия и промывают пипетку 3-5 раз (раствор хлористого натрия для этой цели расфасовывают в пробирки по 1 мл и стерилизуют заранее).

Для получения смыва с наружной поверхности пипетки (инструмента) стерильным пинцетом берут марлевый тампон диаметром 7-8 см, смачивают его стерильным физиологическим раствором хлористого натрия и тщательно протирают наружную поверхность пипетки, удерживая ее пинцетом. После этого тампон помещают в чашку с МПА (мясопептонным агаром) на 3-5 минут (тампон можно оставлять в чашке до конца инкубации) и инкубируют при температуре 37-37,5° в течение 24 часов.

Если смыв с поверхности инструментов приходится брать непосредственно в рабочих комнатах станций или пунктов искусственного осеменения, то заготавливают специально смонтированные пробирки. Для этого на конец деревянной палочки или металлической проволоки, предварительно пропущенной через ватно-марлевую пробку, фиксируют марлевый тампон диаметром 7-8 см. Пробками с тампонами закрывают пробирки и стерилизуют их. В день получения смыва в каждую пробирку с тампоном наливают по 1-2 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия так, чтобы марлевый тампон находился над уровнем жидкости. Перед взятием смыва пробирки наклоняют и увлажняют тампон. Затем тампоном быстро протирают поверхность инструмента и помещают в ту же пробирку.

Для получения смыва с внутренней поверхности искусственной вагины к последней присоединяют с обоих концов стерильные спермоприемники. Один конец вагины приоткрывают и вливают 5 мл физиологического раствора. Легкими движениями вагину вращают и слегка встряхивают. Смыв с камеры искусственной вагины собирают в спермоприемник, переносят в стерильную пробирку и направляют для исследования.

5. Пробы для исследования направляют в лабораторию в объеме: неразбавленной спермы - не менее 1 мл; вазелина, химреактивов, смыва, сред и т.п. - 5-10 мл или граммов. На пробирки (флаконы) наклеивают этикетки с указанием номера пробы и доставляют в лабораторию в термосе или ящике. Если время транспортировки проб до лаборатории будет превышать 2 часа, то в термос необходимо положить лед, на который кладут флаконы, обернутые ватой (температура 2-4°). С момента взятия проб до начала исследования допускается их хранение не более 6 часов при температуре 2-4° и не более двух часов при более высокой температуре. Замороженную сперму транспортируют в термосе с жидким азотом.

6. К каждой пробе, направляемой в лабораторию, прилагают сопроводительный документ и опись (см. приложение). В сопроводительном документе указывают: 1) наименование учреждения, которое отправляет пробы; 2) количество направляемых проб; 3) год, месяц, число и час взятия спермы; 4) какими методами и в каких условиях взяты пробы; 5) сведения об использовании производителя и его ветеринарно-санитарной обработке; 6) для какой цели направляются пробы; 7) характер упаковки и способ транспортировки проб; 8) опись проб; 9) должность и адрес лица, взявшего пробу, и его подпись.

Опись проб составляют в 3 экземплярах.

Определение общего числа бактерий. 7. Для определения общего числа бактерий в 1 мл или 1 г пробы применяют 1,5-2%-ный МПА с добавлением 1% глюкозы (на 1 л мясопептонного бульона добавляют 15-20 г агара, 10 г глюкозы), рН среды устанавливают 7-7,2, стерилизуют обычным методом. Перед стерилизацией агар желательно профильтровать.

Перед посевом пробу спермы, смыва или среды тщательно перемешивают встряхиванием, не смачивая пробки. Стерильными градуированными пипетками делают посев в бактериологические чашки. В зависимости от степени ожидаемого загрязнения высевают 1,0; 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл (г) пробы с таким расчетом, чтобы в чашках на МПА вырастало не очень большое число колоний, что удобно для подсчета.

При высеве небольшого объема пробы делают последовательные разведения. С этой целью в пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора вносят 1,0 мл исследуемого материала и тщательно перемешивают. Получают разведение 1:10 (в 1 мл такого раствора содержится 0,1 мл пробы). Затем из пробирки первого разведения пипеткой переносят 1 мл раствора во вторую пробирку с 9 мл физиологического раствора (второе разведение 1:100; в 1 мл раствора содержится 0,01 мл пробы). Так поступают до получения необходимого разведения.

При разведении можно пользоваться одной пипеткой, но при этом необходимо растворы набирать резиновой грушей или полиэтиленовым баллончиком и тщательно (не менее 3 раз) промывать пипетку раствором из той пробирки, в которую перенесли суспензию. Если эти требования не могут быть выполнены, то для каждого разведения берут новую стерильную пипетку. Следует учитывать, что при приготовлении разведений пользование одной пипеткой в отдельных случаях может привести к завышению показателей вследствие адсорбции микроорганизмов на стенках пипетки. В результате адсорбированные микробы могут попадать в пробирку с гораздо большим разведением.

8. Рекомендуются три метода посева материала:

а) посев на поверхность МПА, заранее разлитого в бактериологические чашки (поверхностный пластинчатый метод);

б) разлив в пустые стерильные бактериологические чашки посевного материала, предварительно смешанного с 10-15 мл расплавленного агара при температуре 45-46° (метод одновременных разливок);

в) высев на поверхность застывшего МПА, предварительно смешанного с 2-3 мл подогретого 0,75-1% агара (двухслойный метод).

9. При исследовании сухих препаратов на стерильность в камере или стерильном боксе отвешивают 1 г пробы на обеззараженных весах. Навеску растворяют в 9 мл стерильной дистиллированной воды и взбалтывают в течение 10-15 минут. После полного растворения пробы делают ряд разведений в зависимости от предполагаемого загрязнения и высевают на среду. При подсчете количества микробных тел в 1 г первую пробирку, в которой растворяли пробу, считают за разведение 1:10.

Материал высевают в объемах не более 1 мл и не менее 0,3 мл стерильной градуированной пипеткой. При использовании чашек с заранее приготовленным агаром их перед посевом выдерживают в термостате 24 часа (проверка на стерильность). Суспензию, нанесенную на МПА, равномерно распределяют по всей поверхности агара стерильным шпателем, который делают из стеклянной палочки или пастеровской пипетки. Распределяют суспензию до полной ее адсорбции агаром. Чашки помещают в термостат и выдерживают при 37-37,5° 24 часа.

10. Подсчет колоний. Для подсчета выросших колоний чашку кладут вверх дном на темный лист бумаги. При небольшом росте колоний их подсчитывают невооруженным глазом на всей площади чашки. Подсчитанные колонии отмечают на чашке восковым карандашом или чернилами. При обильном росте чашку делят на секторы (2, 4, 8, 16) и подсчитывают с помощью лупы в каждом секторе, а затем полученные числа складывают. При равномерном распределении колоний можно подсчитывать на 1/2 или 1/4 площади чашки. Если колоний выросло много (более 600), лучше пользоваться камерой Вольфгюгеля для подсчета колоний, которая состоит из стеклянной пластинки, разделенной на 144 квадрата площадью 1 каждый. Для подсчета чашку кладут под стеклянную пластинку и подсчитывают колонии при ярком боковом освещении. При сравнительно равномерном распределении колоний их подсчитывают в 10 квадратах, расположенных в разных участках чашки.

11. Вычисление количества микробных тел в 1 мл или 1 г исследуемого материала проводят по формуле:

,

где С - количество микробных тел в 1 мл;

N - количество подсчитанных колоний;

D - степень разведения исследуемого материала;

V - объем раствора, взятого для посева;

S - площадь чашки, на которой произведен подсчет колоний.

Например, было высеяно 0,5 мл (V) разбавленной 1:10 (D) спермы. Подсчет колоний произведен на 1/4 чашки (S), насчитано 20 колоний (N). В этом случае колоний, следовательно, 1600 микробных тел в 1 мл.

Вычисление количества микробных тел в 1 мл или в 1 г исследуемого материала при пользовании камерой для подсчета колоний проводят следующим образом: количество колоний, подсчитанных в 10 квадратах, складывают и определяют число микробных тел по формуле:

,

где - площадь чашки;

n - количество сосчитанных квадратов.

Например, при высеве 0,5 мл разведенной 1:10 спермы в каждом из 10 квадратов насчитано колоний: 8, 10, 12, 11, 7, 14, 8, 12, 18 и 14 = 114.

В этом случае микробных тел.

Таким же образом подсчитывают число микробных тел для данной пробы и по остальным трем чашкам. Результат подсчета колоний записывают в журнал и окончательно определяют количество микробных тел в 1 мл или в 1 г исследуемой пробы по среднему вычислению.

Складывают только те числа, которые имеют расхождение не более 22%. Например, если по 4 чашкам подсчитано 250, 290, 270 и 450 микробных тел, то вычисление ведут из расчета трех чашек. Результаты четвертой чашки (450 микробных тел) не учитывают.

При записи результатов подсчета количества микробных тел полученное число округляют из расчета:

Определено микробных тел в 1 мл		Запись результатов исследований
От	1 до 100	Как подсчитано
"	101 до 1000	Округлено	до	10
"	1001 до 10 000	"	"	100
"	10 001 до 100 000	"	"	1000
"	100 001 до 1000 000	"	"	10 000

Исследование на наличие синегнойной палочки, плесени, анаэробной микрофлоры. 12. Для выделения синегнойной палочки необходимо делать посев из исследуемого материала на МПБ с добавлением 1-2% сахара (глюкозы, лактозы) и инкубировать посевы в течение 6-7 суток в термостате при 37°, проверяя рост каждые 1-2 дня. При росте микроб продуцирует водорастворимый пигмент пиоцианин, который постепенно окрашивает бульон в зеленовато-голубой цвет. На МПА он дает круглые голубовато-серые колонии. При микроскопии - грамотрицательная палочка.

Производителей, в сперме которых выделена синегнойная палочка, исследуют трехкратно с интервалом 3-4 дня. Если при повторных исследованиях спермы выделяют синегнойную палочку, то это указывает на выделение палочки из организма со спермой. В таких случаях сперму от производителя не используют для осеменения, проводят тщательный клинический осмотр производителей и назначают необходимый курс лечения общего или местного характера.

13. Для исследования на плесень чашки с посевом на агаре после подсчета количества микробных тел оставляют при комнатной температуре на 8 суток в месте, удаленном от прямых солнечных лучей. По истечении этого срока чашки с посевами проверяют на наличие в них плесени.

14. Из спермы и смывов может быть выделена и анаэробная микрофлора. Чаще всего выделяют наиболее распространенный микроб - Bact. perfringens. Однако могут быть выделены и другие микробы.

Для выделения анаэробных бактерий, помимо соответствующей среды и температурного оптимума, требуется создание бескислородных условий. Лучше всего для выращивания анаэробов применять среду Китт-Тароцци.

Исследуемый материал засевают в 2 пробирки с указанной средой. Одну из пробирок после посева материала прогревают в водяной бане при 80° в течение 20 минут для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры. Затем засеянные пробирки помещают в термостат при 37° на 10 суток. На печеночном бульоне учитывают интенсивность роста, характер осадка, а также наличие и степень газообразования. Через каждые 3-4 дня, независимо от наличия или отсутствия признаков микробного роста, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Обнаружение в сперме анаэробных микроорганизмов указывает на нарушения ветеринарно-санитарных требований при работе со спермой.

Исследование на наличие кишечной палочки. 15. Санитарно-показательными бактериями считают все разновидности кишечной палочки, способные ферментировать жидкую среду с глюкозой и маннитом с выделением кислоты и газа в течение 24 часов при температуре 43-44°. Количество кишечной палочки, обнаруженной в сперме, выражают в виде коли-титра (титр кишечной палочки) или коли-индекса. Таким образом, исследованиями на коли-титр определяют степень загрязненности исследуемого материала микробами из группы кишечной палочки, что является показателем фекального загрязнения.

Коли-титр - наименьший объем или вес исследуемого материала, выраженный в мл или г, в котором обнаружена одна кишечная палочка.

Коли-индекс - число бактерий кишечной палочки в 1 мл спермы или в 1 г сухого вещества.

Коли-титр можно перевести в коли-индекс и наоборот. Для перевода коли-титра в коли-индекс единицу делят на объем, выражающий коли-титр. Например, установлен коли-титр, равный 0,01 мл (разведение 1:100), следовательно, , то есть в 1 мл содержится 100 кишечных палочек.

Для перевода коли-индекса в коли-титр необходимо единицу разделить на число, выражающее коли-индекс. Например, коли-индекс равен 100. В этом случае мл.

Коли-титр можно определять: 1) методом бродильных проб, 2) методом "прямого посева" и 3) методом мембранных фильтров.

Наиболее приемлем в практических условиях метод бродильных проб. С этой целью убывающие объемы спермы высевают на специальные среды. При этом допускают, что попадание 1 бактерии вызывает видимые изменения в среде.

В ветеринарной практике широко апробирована среда Булира. На 1 л МПБ добавляют 2,5 г маннита, рН среды доводят до 7,0-7,1, автоклавируют или кипятят 15 минут. Добавляют насыщенный водный раствор нейтральрота до окрашивания среды в вишнево-красный цвет. Затем ее фильтруют, разливают в пробирки с поплавками (газовками) по 7 мл и автоклавируют 15 минут при температуре 120°.

На среду Булира высевают по 1 мл спермы, разведенной 1:10; 1:100 и 1:1000. Если в пробе устанавливают одновременно коли-титр и степень бактериальной загрязненности, то высев производят одновременно одной пипеткой. Пробирки с посевами инкубируют при температуре 43-44° в течение 24 часов. Температура 43-44° не задерживает роста кишечной палочки, но подавляет размножение другой микрофлоры.

Учет результатов. При отсутствии помутнения среды и газообразования реакцию считают отрицательной.

Изменение цвета среды (пожелтение), помутнение и газообразование (пузырек в газовке) указывают на размножение в среде микробов группы кишечной палочки (кишечная палочка, размножаясь, продуцирует кислоту и газ).

Для подтверждения того, что брожение маннита вызвано именно кишечной палочкой, проводят идентификацию культуры.

Из пробирок, содержащих газ в поплавке, делают высев петлей в чашки со средой Эндо. Для получения изолированных колоний засеваемый материал наносят на поверхность среды в виде густо пересекающихся штрихов или втирают в среду шпателем. Выращивают при температуре 37° в течение 24 часов. Осматривают чашки и отмечают колонии, характерные для группы кишечной палочки (красные колонии с металлическим блеском и без него, розовые колонии, бесцветные и бесцветные с розовым центром). При отсутствии колоний, характерных для кишечной палочки, результат считают отрицательным, исследования прекращают. При установлении микроорганизмов с признаками, типичными для бактерий из группы кишечной палочки, из 2-3 колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Наличие грамотрицательных палочек, без спор, морфологически сходных с кишечной палочкой, указывает на возможность наличия кишечной палочки. Из колоний, характерных для кишечной палочки, высевают в пробирки со средой Булира (вторая бродильная проба) и выращивают 24 часа при температуре 43-44°. Помутнение среды без газообразования - отрицательный результат, изменение цвета, помутнение среды и газообразование - положительный.

За титр кишечной палочки принимают тот объем материала, который вызвал брожение в пробирке с наибольшим разведением.

Ветеринарно-санитарная оценка исследуемого материала. 16. Неразбавленная сперма по санитарным показателям должна удовлетворять следующим требованиям:

а) не должна содержать патогенных микробов, а также условно-патогенных (синегнойной палочки, группы зеленеющих стрептококков);

б) количество непатогенных микробов в 1 мл не должно быть выше установленных норм;

в) в зависимости от степени бактериальной загрязненности неразбавленной спермы следует различать пять степеней ее чистоты (см. таблицу).

Степень чистоты	Микробных тел в 1 мл	Коли-титр	Коли-индекс	Санитарная оценка качества спермы
I	-	Выше 0,1	Отрицательно	Стерильна
II	До 100	0,1	10	Незначительно загрязнена
III	До 2000	0,1	10	Слабо загрязненная
IV	До 5000	0,1	10	Средне загрязненная
V	Более 5000	0,01	100 и более	Сильно загрязнена

Станции искусственного осеменения должны получать и применять сперму первых четырех степеней чистоты. Сперма четвертой степени чистоты считается условно годной.

Все среды, применяемые для разбавления спермы, должны быть стерильными.

Разбавленная и сохраненная сперма должна иметь отрицательный коли-титр и содержать не более 500 микробных тел в 1 мл.