Методические рекомендации "Методы бактериологического исследования в клинической микробиологии" (утв. Министерством здравоохранения РСФСР 17 января 1983 г.)

Введение

Методы бактериологического исследования все шире внедряются в практику для более детального обследования больных, установления этиологического фактора воспалительного процесса, назначения рациональной терапии и определения ее эффективности.

Разнообразие клинического материала и своеобразие микрофлоры отдельных органов определяют особенности методов бактериологического исследования, которые требуют применения специальных приемов отбора проб, посевов на питательные среды и проведения хода анализов.

Бактериологическое исследование клинического материала состоит из нескольких этапов:

- отбор проб на исследование;

- посев на питательные среды;

- выделение чистой культуры;

- идентификация и дифференциация выделенных культур микроорганизмов;

- анализ результатов исследования.

В настоящих рекомендациях изложены методы бактериологического исследования отделяемого различных открытых и закрытых полостей организма: глаз, верхних и нижних дыхательных путей, ран; пунктатов, экссудатов, мочи, крови и т.д.

Учитывая наличие официальных инструкций по бактериологическому исследованию при инфекционных заболеваниях (дифтерия, менингит, коклюш, кишечные инфекции и др.), в настоящих рекомендациях основное внимание уделено методам выделения и идентификации аэробной условно-патогенной микрофлоры и дифференциации ее от патогенных бактерий и микроорганизмов резидентной микрофлоры различных органов.

Исследование микрофлоры глаз

Отбор проб на исследование. При заболеваниях глаз (воспалительные процессы, исследования перед операциями и др.) материал для исследования берут с пораженных мест. Накануне, за 6 - 8 часов (ночь), отменяют все медикаменты и процедуры. Отделяемое берут с конъюнктивы стерильным ватным тампоном или стерильными стеклянными палочками двумя - тремя движениями по слизистой нижней переходной складки с края век, из секрета слезных путей, при язве - с роговицы (после обезболивания), при "уголковом конъюнктивите" - с уголков век. Выбор места взятия материала определяет окулист. Материал забирают с соблюдением правил асептики в разгар воспалительного процесса, так как в начале заболевания возбудителя можно не выявить.

Взятый материал наносят на поверхность предметного стекла, предварительно прокаленного над пламенем горелки и остуженного. Мазок сушат. Предметное стекло, на которое нанесен мазок, накрывают стерильным предметным стеклом, между ними прокладывают спички, чтобы стекла не соприкасались. На стекле, где сделан мазок, с обратной стороны делают отметку карандашом и доставляют в лабораторию для бактериоскопического исследования. При бактериологическом исследовании посев материала, взятого из каждого глаза отдельно, производят в пробирки с 0,5 - 1 % сахарным бульоном, обозначая: OD - oculus dextra (правый глаз) и OS - oculus sinistra (левый глаз). Эти процедуры осуществляются в кабинете врача, посевы доставляют в лабораторию не позднее чем через 1 - 2 часа после взятия материала.

Ход исследования. В лаборатории мазки фиксируют на пламени горелки или в смеси Никифорова и окрашивают метиленовой синькой или по Граму, а затем просматривают в микроскоп с увеличением 7 х 90 или 10 x 90. Результат бактериоскопического исследования выдается на основании морфологии микроорганизмов и имеет ориентировочное значение. Как при положительном, так и при отрицательном результате материал, подлежащий бактериоскопии, должен быть обязательно подвергнут параллельному бактериологическому исследованию.

Посевы, доставленные в лабораторию, помещают в термостат при 37° на 24 часа. При появлении роста в бульоне приготавливают мазки для бактериоскопического исследования и, в зависимости от морфологических свойств обнаруженных микроорганизмов, назначают дифференциальные тесты. Если при бактериоскопии обнаружено несколько морфологически различных форм, производят посев на плотные питательные среды, выделяют чистую культуру, проводят ее идентификацию и определение чувствительности к антибиотикам. Ответ выдают через двое - трое суток от начала исследования. В случае отсутствия роста через 48 - 72 часа выдают отрицательный ответ.

Резидентной микрофлорой глаз является Corynebacterium xerosis и Corynebacterium pseudodiphtheriticum. Условно-патогенная микрофлора может быть представлена грамположительными кокками (Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis) и грамотрицательными палочками семейства Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella) и Pseudomonas aeroginosa. Патогенная микрофлора может включать Streptococcus pyogenes и pneumoniae, Haemophilus influenzae и другие. В посевах клинического материала могут быть выделены микроорганизмы, обусловливающие только конъюнктивиты. К ним относятся: Haemophilus aegypticus (Koch-Weeks Bacillus), Moraxella lacunata (Diplobacillus moraxaxenfeld), Branhamella catarrhalis (Mikrococcus catarrhalis).

Исследование микрофлоры верхних дыхательных путей (нос, глотка) и уха

Отбор проб для исследования. Материал для бактериологического исследования забирают стерильными тампонами средний медицинский персонал отделений. В качестве палочек для тампонов рекомендуется использовать алюминиевую проволоку. Верхний конец ее должен быть завернут колечком или просто загнут, чтобы не колол руку; на нижний конец навертывают вату.

Пробы доставляют в лабораторию не позднее чем через 1 - 2 часа после взятия. Посуда считается стерильной 2 - 4 дня с момента ее получения из лаборатории.

Слизь из глотки берут натощак или через 3 - 4 часа после еды стерильным ватным тампоном с воспаленных участков, при налетах (по краю их) и при пленках - из глубины крипт миндалин. При взятии материала из носа наружные отверстия необходимо предварительно обработать 60° спиртом.

Материал из уха после предварительной обработки спиртом наружных слуховых проходов берут стерильным ватным тампоном.

Ход исследования. Материал, доставленный в лабораторию, подлежит бактериологическому исследованию. В качестве питательных сред рекомендуется использовать 5 % кровяной агар, 10 % желточно-солевой агар и среду Эндо. У края чашки тампон, смоченный бульоном, хорошо втирают в среду, после чего делают посев штрихами по всей чашке или сектору. Тем же ватным тампоном делают мазки на предметных стеклах для микроскопического исследования.

Посевы помещают в термостат при 37 °С. Через 18 - 24 часа посевы просматривают, выделяют чистые культуры и приступают к их изучению и определению чувствительности к антибиотикам. Ответ о результатах исследования выдают через 2 - 3 суток.

При необходимости срочного ответа об ориентировочной антибиотикочувствительности целесообразно чашки с кровяным агаром после посева первичного материала выдержать при комнатной температуре в течение 30 - 40 минут, затем на поверхность агара разложить диски для определения чувствительности к антибиотикам. Ответ о результатах ориентировочного определения чувствительности к антибиотикам выдается на следующий день.

Микробный пейзаж верхних дыхательных путей весьма разнообразен и включает микроорганизмы, выделяемые как в монокультуре, так и в различных ассоциациях, для глотки и носа резидентной микрофлорой являются и -стрептококки (Streptococcus), нейссерии (Neisseria), микрококки (Micrococcus), псевдодифтерийные палочки (Corynebacteritium pseudodiphteriticum), и лактобациллы (Lactobacillus). Условно-патогенная флора может быть представлена золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus), представителями семейства Enterobacteriaceae, гемофильными палочками, бактероидами, синегнойной палочкой и другими микроорганизмами.

Патогенная микрофлора включает -гемолитический стрептококк (Streptococcus pyogenes), пневмококки (Streptococcus pneumoniae) и возбудители капельных инфекционных заболеваний: коклюша, дифтерии, менингита и др. При подозрении на указанные заболевания, проводится бактериологический анализ согласно действующим инструкциям.

При воспалительных процессах уха могут быть обнаружены стафилококки (Staphylococcus aureus и epidermidis), стрептококки (Streptococcus pyogenes и pneumoniae), гемофильные палочки (Haemophilus influenzae), синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) и Corynebacterium. Также возможно выделение грамотрицательной кишечной микрофлоры - кишечных палочек (Escherichia coli), клебсиелл (Klebsiella), протеев (Proteus).

Исследование микрофлоры нижних дыхательных путей ¹

------------------------------

¹_{См. методические рекомендации "Микробиологические методы обследования пульмонологических больных", Л., 1980 г.}

------------------------------

Отбор проб на исследование. Пробу мокроты отбирают в день исследования утром, натощак, после чистки зубов и полоскания полости рта кипяченой водой в стерильную банку. Не позже чем через 1 - 2 часа пробу доставляют в лабораторию.

Ход исследования. Мокроту выливают в стерильную чашку Петри, запаянными стеклянными палочками отбирают 2 - 3 комочка, которые промывают в стерильном физиологическом растворе или мясо-пептонном бульоне (pH 7,2 - 7,4). Рекомендуется также гомогенизация мокроты перед посевом. В этом случае мокроту отбирают в стеклянную банку с бусами, в лаборатории мокроту смешивают в соотношении 1:2 с физиологическим раствором или мясо-пептонным бульоном и встряхивают до разбивания комочков. Из материала делают мазки на двух предметных стеклах для бактериоскопического исследования. Стерильным стеклянным шпателем производят посев двух - трех гнойных комочков или двух - трех капель гомогената, растирая материал по поверхности чашек Петри с питательной средой. В качестве питательных сред рекомендуется использовать 5 % кровяной агар, 10 % ЖСА и среду Эндо. Чашки помещают в термостат на 18 - 24 часа при 37 °С.

Одновременно с посевом на питательные среды исследуемый материал, разведенный физиологическим раствором или бульоном в соотношении 1:2 или 1:5 по 0,5 мл, целесообразно ввести внутрибрюшинно двум белым мышам весом 18 - 20 г. Через сутки погибших животных вскрывают или забивают одну мышь. Кровь, из сердца, кусочки ткани селезенки и печени засевают на кровяной агар.

Через 24 часа чашки с посевами вынимают из термостата, изучают выросшие на питательных средах колонии, идентифицируют их и определяют антибиотикочувствительность. Ответ о результатах исследования может быть получен через 2 - 3 суток.

В этиологии воспалительных процессов нижних дыхательных путей имеют значение следующие виды бактерий: пневмококки (Streptococcus pneumoniae), стафилококки (Staphylococcus aureus), стрептококки (Streptococcus pyogenes), бактерия инфлюэнцы (Haemophilus influenzae), клебсиелла (Klebsiella pneumoniae), туберкулезная палочка (Micobacterium tuberculosis). При исследовании отделяемого нижних дыхательных путей могут быть также выявлены стафилококки (Staphylococcus epidermidis), стрептококки (Streptococcus viridans), микрококки (Micrococcus), энтерококки (Streptococcus faecalis), нейссерии (Neisseria), палочка сине-зеленого гноя (Pseudomonas aeruginosa), кишечная палочка (Escherichia coli), микробы рода Proteus, грибы рода Candida.

Исследование микрофлоры ран, пунктатов, экссудатов различных органов

Отбор проб на исследование. Материал из ран, полостей, пунктаты, содержимое карбункулов, лимфоузлов, свищевых ходов и т.д. забирают стерильным шприцем, пинцетом или тампоном, по возможности из более глубоких отделов, так как верхние отделы могут содержать сапрофитную флору. При снятии повязки рекомендуется очистить поверхность от мази, отмерших тканей, а затем отбирать материал. Взятый материал помещают в стерильную пробирку, чашку Петри или баночку. Материал доставляют в лабораторию в течение 1 - 2 часов. Взятие материала должно быть осуществлено с соблюдением правил асептики.

Ход исследования. Посев материала производят ватным тампоном, которым отбирали материал для исследования, или пипеткой в пробирку с сахарным бульоном, неоднократно погружая в него тампон, после чего несколько капель сахарного бульона пастеровской пипеткой засевают в среду Тароцци. Этим же тампоном делают посев на плотные питательные среды.

В случае жидкого субстрата пастеровской пипеткой делают посев в среды обогащения (сахарный бульон и среду Тароцци) и на плотные питательные среды. Используют 5 % кровяной агар и 10 % желточно-солевой агар, среду Эндо. Посевы помещают в термостат при 37° на 24 часа. На следующий день посевы просматривают и проводят идентификацию выросших колоний с определением чувствительности к антибиотикам. При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высевы и мазки для микроскопии со сред обогащения - сахарного бульона. Посевы выдерживают до 5 суток. Со среды Тароцци делают мазки, окрашивают по Граму. При обнаружении клеток, подобных возбудителям анаэробных инфекций, исследования проводят согласно методам, изложенным в "Руководстве по микробиологической диагностике инфекционных заболеваний", под ред. К.И. Матвеева. М., 1973.

При развитии воспалительных процессов могут быть обнаружены стафилококки (Staphylococcus aureus), стрептококки (Streptococcus pyogenes), различные представители энтеробактерий (Klebsiella, Escherichia coli, Proteus и др.), синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa), а также Streptococcus viridans, Staphylococcus epidermidis, Neisseria и другие микроорганизмы, которые относятся к представителям резидентной микрофлоры.

Исследование микрофлоры мочи

Отбор проб на исследование. Для бактериологического исследования следует брать среднюю порцию утренней мочи после тщательного туалета наружных мочеполовых органов (мытье кипяченой водой с мылом). Мочу собирают в стерильную пробирку в количестве не менее 3 - 5 мл и доставляют в лабораторию в течение 1 часа.

Ход исследования. В первый день исследования производят посев мочи на 3 - 5 % кровяной агар или простой агар и на среду Эндо с целью выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae. Посев производят одной стандартной (3 мм в диаметре) бактериологической петлей. Мочу перед посевом тщательно перемешивают, набирают полную петлю мочи, наносят в чашку Петри с кровяным или простым агаром, предварительно разделенную на 4 сектора: А, I, II и III. При этом в участке среды сектора А делают посев 40 штрихами, равномерно втирая материал по всей поверхности, затем, не беря нового материала, этой же петлей делают посев штрихами на питательную среду в секторе I (3 - 4 штриха), из него в сектор II, из сектора II в сектор III. Каждый раз перед посевом на следующий сектор петля прожигается и материал для посева захватывается из предыдущего сектора. Чашки с посевом ставят в термостат на 24 часа при 37 °С.

На второй день исследования учитывают результаты и определяют степень бактериурии согласно схеме (см. табл. 1). После подсчета количества микробных клеток в 1 мл проводят выделение чистой культуры для дальнейшей идентификации и определения чувствительности к антибиотикам. В случае отсутствия роста чашки выдерживают в термостате 48 часов.

На третий день исследования при отсутствии роста выдают ответ: в 1 мл мочи роста микроорганизмов не обнаружено. Наличие в 1 мл мочи микроорганизмов в количестве 10 ⁵, а для детей - 10 ⁴ свидетельствует об инфекции в мочевыводящих путях или почках. Содержанию в моче 10 ² - 10 ⁴ микроорганизмов в 1 мл следует дать критическую оценку, т.к. такой результат может иметь место при механическом попадании микроорганизмов, загрязнении проб мочи в момент взятия, при лечении больного антибиотиками и т.д. В этих случаях исследование рекомендуют повторить.

Выделение микроорганизмов в ассоциациях не характерно для уроинфекции, а является следствием загрязнения мочи. Ответ выдается через двое - трое суток от начала исследования.

Таблица 1

Число колоний бактерий в различных секторах чашки Петри в зависимости от степени бактериурии (по В.С. Рябинскому и В.Е. Родоману)

Количество бактерий в 1 мл мочи	Число колоний в различных секторах чашки Петри
	А	I	II	III
Менее 1 тыс.	1 - 6	Роста нет	Роста нет	Роста нет
1 тыс.	8 - 20
5 тыс.	20 - 30
10 тыс.	30 - 60
50 тыс.	70 - 80
100 тыс.	100 - 150	50 - 10
500 тыс.	Очень большое	20 - 30
1 млн.		40 - 60
5 млн.		100 - 140	10 - 20
10 млн.		Очень большое	30 - 40
50 млн.			60 - 80	Единичные
100 млн.			80 - 140	От единичных до 25

Наиболее частыми возбудителями инфекций мочевых путей является грамотрицательная микрофлора семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Enterobacter, Proteus), Pseudomonas, а также некоторые представители грамположительной кокковой микрофлоры (Staphylococcus, Streptococcus faecalis).

Исследование крови

При исследовании крови могут быть обнаружены стафилококки, стрептококки, гемофильные палочки и возбудители инфекционных заболеваний, сопровождающиеся бактериемией. Помимо этих микроорганизмов, в крови могут находиться представители условно-патогенной микрофлоры: Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Escherichia coli, Proteus и другие Роль этих микроорганизмов в развитии сепсиса должна решаться в каждом случае индивидуально, путем сравнения с микрофлорой первичного очага, повторностью выделения одинаковых видов, родов микроорганизмов. Наиболее часто возбудителями сепсиса являются стафилококки.

Исходя из современных методических возможностей, установление этиологии бактериемий, обусловленных анаэробной бесспоровой микрофлорой, как и в других образцах отделяемого различных органов человеческого организма, в настоящее время ограничено из-за отсутствия унифицированных методик, пригодных к использованию в условиях практических лабораторий. В данном разделе изложена методика исследования на аэробную бесспоровую микрофлору.

Отбор проб на исследование. Кровь забирают из вены локтевого сгиба. У маленьких детей кровь берут в меньшем количестве из мочки уха, пятки, пальца. Пробы крови отбирают после тщательной обработки поверхности кожи с соблюдением правил асептики, спиртом (70°), йодом и еще раз спиртом, стерильным 20- или 10-граммовым шприцем, специально для этих целей простерилизованным в центральной стерилизационной или прокипяченным 30 - 40 минут в отдельном стерилизаторе. Взятие крови рекомендуется производить во время подъема температуры, до начала специфического, антибактериального лечения или через 12 - 48 часов после последнего введения препарата. Для более достоверного выявления возбудителя следует брать кровь 3 раза подряд на подъеме температуры.

Взятие крови и посевы производят у постели больного или в специально оборудованном кабинете. Засевают кровь из шприца во флаконы с питательной средой в соотношении 1:10 (5 мл крови и 50 мл 0,15 % агаризованного сахарного бульона или комбинированной питательной среды). Посевы производят над горелкой. Флаконы закрывают пробкой и бумажным колпачком, немедленно доставляют в лабораторию и помещают в термостат при температуре 37 °С. Не допускается смачивание пробки питательной средой, в которую произведен посев. Флаконы с питательной средой получают в лаборатории.

Ход исследования. В лаборатории флаконы с посевом выдерживают в термостате в течение 10 суток, ежедневно встряхивая. Первый высев со среды, в которую произведен посев крови, производят через двое суток. Пересев осуществляется на кровяной агар петлей, после чего чашку помещают в термостат при 37 °С и выдерживают в течение 24 часов. При наличии роста микроорганизмов выделяемую культуру тщательно изучают, производят бактериоскопию, определение культуральных и биохимических свойств, чувствительности к антибиотикам. При отсутствии роста после первого высева флаконы с посевом крови вновь помещают в термостат и повторные высевы производят через каждые 48 часов. Последний высев производят на 10-е сутки, после чего выдают окончательный ответ: роста аэробных микроорганизмов не обнаружено. С комбинированной среды (сахарный бульон со скошенным сахарным агаром) высева не делают, а наличие роста определяют по появлению колоний на скошенном агаре.

Для количественного учета микроорганизмов можно пользоваться методикой капельного посева. Материал для исследования (мазки из носа, зева и других полостей, экссудаты, содержимое плевральной полости, промывание воды бронхов и др.) помещают в пробирки с 5 мл агаризованного буфера (диаметр пробирки 20 мм) и тремя стеклянными бусами и подвергают встряхиванию на шутель-аппарате в течение 15 минут. Далее готовят 10-кратные разведения в том же буфере до соотношения 1:10 ⁷ и используют для посева материала из носа из 1-й и 3-й пробирок, а для других материалов из 1-й, 3-й, 5-й, 7-й пробирок. Посев осуществляют капельным способом по 1 капле на 4 сектора питательной среды, разлитой на чашку Петри. Через 18 - 24 часа производят количественный учет выросшей микрофлоры, проводят идентификацию и определение антибиотикочувствительности.

Методы идентификации и дифференциации микроорганизмов

Методы идентификации основаны на изучении морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и фаголитических свойств культур, выросших на питательных средах.

Изучение морфологических свойств осуществляют путем бактериоскопического исследования исходного материала, а также после подращивания на плотных или жидких питательных средах, после визуального изучения выросших колоний. Из исходного материала или из колоний и жидких питательных сред делают мазки на предметных стеклах, фиксируют над пламенем горелки или в жидких фиксаторах (96° спирте, смеси Никифорова) и окрашивают по Граму, метиленовой синью или фуксином.

При нахождении в мазках грамположительных кокков, типа ланцетовидных диплококков, окруженных зоной неокрасившейся капсулы, можно предположить наличие пневмококков. Если обнаруживают грамположительные кокки, расположенные цепочкой, то можно предположить наличие в исследуемом материале стрептококков. Расположение грамположительных кокков в виде гроздей винограда дает основание предположить наличие стафилококков. Не следует забывать о возможности обнаружения анаэробных кокков. Мелкие грамотрицательные палочки кокковидной формы позволяют предположить наличие гемофильных бактерий. Грамотрицательные палочки различной величины, окруженные капсулой в виде светлого ореола, свидетельствуют о возможности наличия энтеробактер-клебсиелл-серрация. Бескапсульные палочки позволяют предположить присутствие в материале кишечных палочек, протея, палочки сине-зеленого гноя, а также бесспоровых анаэробных палочек. При наличии в мазках грамотрицательных кокков можно думать о наличии нейссерий.

При обнаружении грамположительных длинных палочек в мазках как из исходного материала, так и со среды Тароцци можно предположить наличие споровых анаэробов или аэробов, для идентификации которых следует использовать методы, изложенные в "Руководстве по микробиологической диагностике инфекционных заболеваний", под ред. К.И. Матвеева, М., 1973.

Бактериоскопический диагноз является ориентировочным. Необходимо дальнейшее бактериологическое исследование, включающее посев исходного материала на питательные среды, выделение чистой культуры, их идентификация и изучение чувствительности к антибиотикам.

Изучение культуральных свойств осуществляется при просмотре колоний, выросших на жидких и плотных питательных средах. При росте на жидких средах отмечают характер роста, степень прозрачности среды, наличие осадка или пленки на поверхности питательных сред. При изучении колоний на плотных питательных средах обращают внимание на размер колоний, их прозрачность, особенности краев колоний, наличие гемолиза и его характер, цвет колоний, наличие пигмента и т.д.

Изучение биохимических свойств основано на выявлении ферментативной, сахаролитической, протеолитической активности, способности утилизировать те или иные питательные вещества в различных (аэробных и анаэробных) условиях культивирования.

Изучение антигенных свойств культур осуществляется при взаимодействии антигенов бактерий с соответствующими антисыворотками в различных серологических реакциях (реакция агглютинации, преципитации, иммунофлюоресценции и т.д.).

Изучение фаголитических свойств основано на способности культур лизироваться под действием специфических фагов в жидких или плотных питательных средах, а также при применении метода фаготипирования культур.

Следует отметить, что изучение антигенных и фаголитических свойств используется главным образом при идентификации патогенных микроорганизмов. В клинической микробиологии эти методы еще недостаточно разработаны и до настоящего времени не получили широкого применения.

На изучение комплекса всех перечисленных выше свойств основаны методы дифференциации и идентификации культур.

После изучения морфологических и культуральных свойств микроорганизмов, выросших на питательных средах в монокультуре, определяют дифференциальные тесты. При росте ассоциаций микроорганизмов предварительно проводят выделение чистой культуры.

Ниже изложены методы идентификации культур, наиболее приемлемые для условий практической работы клинических бактериологических лабораторий и основанные на изучении минимального количества признаков, позволяющих с достаточной достоверностью проводить их идентификацию. В основу дифференциации положены тесты, рекомендованные Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974) и "Кратким определителем бактерий Берджи" (1980).

Грамположительные кокки

Грамположительные кокки (аэробы и/или факультативные анаэробы) представлены семейством Micrococcaceae, включающим род Micrococcus и Staphylococcus, и семейством Streptococcaceae.

Семейство Micrococcaceae. Первоначально проводят изучение характера роста колоний на 10 % желточно-солевом и 5 % кровяном агаре. Затем рекомендуется произвести окраску мазков из колоний по Граму. Для дифференциации Staphylococcus от Micrococcus используют следующие тесты: размеры клеток, ферментация глюкозы в анаэробных условиях и образование пигмента (табл. 2).

Таблица 2

Дифференциация Micrococcus от Staphylococcus

Тесты	Micrococcus	Staphylococcus
Размеры клеток	0,5 - 3,5 мкм	0,5 - 1,5 мкм
Ферментация глюкозы в анаэробных условиях	-	+
Образование пигмента на плотных средах	От желтого до розового	От золотистого до белого

Примечание: некоторые штаммы S. saprophyticus слабо ферментируют глюкозу.

Для дифференциации различных видов Staphylococcus следует определить плазмокоагулазу, ферментацию маннита в аэробных и анаэробных условиях, ДНК-азную активность, наличие протеина А, чувствительность к новобиоцину (табл. 3). При необходимости эпидемиологического обследования проводят фаготипирование золотистых стафилококков. Для определения факторов патогенности

Staphylococcus epidermidis, выделяемых из клинического материала (кровь, закрытые полости, раны), рекомендуем учитывать следующие свойства: образование гемолизина при росте на плотных кровесодержащих средах, лецитиназы при росте на ЖСА и фосфатазную активность.

Таблица 3

Дифференциация различных видов Staphylococcus

Тесты	Aureus	Epidermidis	Saprophyticus
Плазмокоагулаза	+	-	-
Ферментация маннита:
аэробно	+	+ 1	+ 1
анаэробно	+	-	-
ДНК'азная активность	+	-	-
Протеин А	+	-	-
Чувствительность к новобиоцину	+ 2	+	-

------------------------------

Примечание:

¹_{Некоторые штаммы дают отрицательную реакцию.}

²_{Чувствительные штаммы МПК меньше 0,6 мкг/мл, резистентные МПК больше 2,0 мкг/мл.}

------------------------------

Семейство Streptococcaceae представлено многочисленными видами, среди которых при заболеваниях человека наиболее изученными в настоящее время являются аэробные представители: Streptococcus pyogenes, faecalis, pneumoniae. На 5 % кровяном агаре стрептококки растут в виде мелких, прозрачных, с гладким краем колоний, образующих или не дающих зону гемолиза. Стрептококки серологической группы А, дающие прозрачную зону гемолиза вокруг колонии типа , отнесены к разновидностям Streptococcus pyogenes.

Стрептококки, образующие -тип гемолизина, характеризующиеся частичным гемолизом вокруг колонии и зеленоватым окрашиванием зоны гемолиза, отнесены к зеленящим стрептококкам (Streptococcus viridans). Стрептококки серологической группы D, обычно не дающие зоны гемолиза, отнесены к энтерококкам разновидности Streptococcus faecalis.

Пересев колоний производят в пробирки с сахарным бульоном или со скошенным кровяным агаром, делают бактериоскопию и проводят дифференциацию стрептококков от энтерококков по следующим тестам: редукция метиленовой сини в молоке, рост в бульоне с 6,5 % хлоридом натрия, рост на 10 или 40 % желчном агаре или бульоне. Положительные реакции позволяют отнести выделенные штаммы к S. faecalis, отрицательные, в зависимости от характера гемолиза, к S. pyogenes или S. viridans.

Современная классификация стрептококков (классификация Ленсфильд) основана на различии группоспецифических полисахаридных антигенов, локализованных в клеточной стенке стрептококков группы А.

Для серологической идентификации стрептококков группы А применяют реакцию преципитации в геле. Группоспецифические сыворотки для этой реакции выпускает МЭМ им. Гамалеи АМН СССР. Для серодиагностики стрептококковой инфекции применяют определение антигиалуронидазы, антистрептокиназы и антистрептолизина-О в сыворотке крови больных. Диагностические препараты для этих реакций выпускают ИЭМ им. Гамалеи АМН СССР и Ленинградский НИИВС. Методики постановки реакций изложены в наставлениях к этим препаратам.

В семейство стрептококков включены также Streptococcus pneumoniae (пневмококки). Пневмококки растут на питательных средах с кровью в виде нежных, мелких, зеленовато-серого цвета, полупрозрачных колоний, окруженных ореолом, напоминающим гемолиз. Подозрительные колонии снимают в пробирки сахарного бульона с добавлением сыворотки или скошенного кровяного агара.

Для идентификации пневмококков и дифференциации их от других видов стрептококков используют следующие тесты:

- гибель белых мышей при введении исследуемого материала и обнаружение капсульных форм пневмококков в мазках-отпечатках из крови, печени, селезенки;

- лизис пневмококков при росте в 10 % желчном бульоне или тест с желчными дисками;

- ферментация глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы пневмококками с образованием кислоты;

- отсутствие роста пневмококков на 5 % кровяном агаре, содержащим оптохин в разведении 1:50000 или тест с оптохиновым диском.

Для серологической идентификации пневмококка в Московском НИИВС им. И.И. Мечникова разработаны капсульные сыворотки (18 типов) для применения в реакции агглютинации на стекле.

Грамотрицательные кокки и коккобациллы

Грамотрицательные кокки и коккобациллы (Neisseriaceae), вызывающие заболевания человека, представлены родами Neisseria, Branhamella, Moraxella.

Род Neisseria включает возбудителей менингита (N. meningitidis), гонореи (N. gonorrhoeae), а также несколько непатогенных видов нейссерий, встречающихся при исследовании клинического материала. Сапрофитные представители нейссерий включают виды: N. sicca, N. subflava, N. flavescens, N. mucosa и другие.

Для идентификации этих видов и дифференциации от Branhamella catarrhalis используют следующие тесты: капсулообразование, ферментация глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, образование пигмента (табл. 4). Все представители рода дают положительную реакцию на оксидазу.

Таблица 4

Дифференциация видов рода Neisseria и Branhamella

Тесты	N. sicca	N. subflava	N. flavescens	N. mucosa	В. catarrhalis	N. meningitidis
Капсула	+/-	+	-	+	+	+/-
Глюкоза	к	к	-	к	-	к
Мальтоза	к	к	-	к	-	к
Сахароза	к	-	-	к	-	-
Пигмент	+/-	+	+	-	-	-

Примечание: к - образование кислоты.

Род Branhamella представлен видом Branhamella catarrhalis, вызывающим конъюнктивит у человека. В. catarrhalis располагаются в виде диплококков, образуют капсулу, неподвижны, не образуют кислоты при росте на средах с углеводами, растут на питательных средах, не образуют уреазы, аэробы.

Род Moraxella, вызывающий конъюнктивит у человека, представлен видом Moraxella lacunata (Diplococcus moraxaxenfeld). M. lacunata имеет вариабельную морфологию - от мелких ланцетовидных кокков до толстых, коротких палочек, расположенных попарно или короткими цепочками. Эти микроорганизмы, в отличие от Klebsiella, не образуют капсулы. Колонии растут на кровяном агаре, на шоколадном агаре образуют большие темные зоны вокруг очень мелких колоний, разжижают свернутую лошадиную сыворотку, дают оксидазный тест, углеводы не ферментируют.

Грамнегативные факультативные анаэробные палочки

Семейство Enterobacteriaceae представлено трибами Escherichia, Klebsiella, Proteae и другими. Оно включает в себя грамотрицательные мелкие палочки, обладающие подвижностью или неподвижные, капсульные или бескапсульные, неспорообразующие аэробы или факультативные анаэробы, оксидазонегативные, образующие кислоту при ферментации глюкозы, восстанавливающие нитраты в нитриты.

В клинической микробиологии используются тесты для дифференциации между отдельными трибами семейства Enterobacteriaceae. Характеристика указанных трибов представлена в табл. 5.

Таблица 5

Биохимические свойства семейства Enterobacteriaceae

Тесты	Escherichia	Shigella	Salmonella	Citrobacter	Klebsiella	Ent. cloacae	Ent. aerogenes	Hafnia	Serratia	Proteus
Цитрат Симмонса	-	-	+	+	+	+	+	х	+	+/-
Мочевина	-	-	-	-/+	(+)	(+)	-	-	х	+/-
H 2S	-	-	+	+/-	-	-	-	-	-	+/-
Подвижность	+/-	-	+	+	-	+	+	+	+	+
Лизин	+/х	-	+	-	+	-	+	+	+	-
Малонат	-	-	-	х	+	+/-	+	х	-	-

Примечание: х - различные реакции;

(+) - замедленные реакции.

Триб Escherichia представлен родами Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Shigella и другими.

Для дифференциации внутри триба Escherichia родов Escherichia и Shigella используют рост Escherichia на ацетатной среде и цитратной среде Христенсена, ферментацию лактозы и глюкозы (с газом), декарбоксилирование лизина, индолообразование (табл. 6). Методы идентификации Salmonella и Shigella изложены в Инструкции по микробиологической диагностике кишечных заболеваний, вызванных шигеллами, сальмонеллами и энтеропатогенными кишечными палочками. (М., 1967).

Таблица 6

Дифференциация триба эшерихий

Тесты	Роды
	Escherichia	Shigella
Ацетатная среда	+/(+)	-
Цитрат Христенсена	+/(+)	-
Глюкоза (газ)	+/-	-/+ 1
Лактоза	+/-	- 2
Лизин	+/х	-
Индол	+/-	х

------------------------------

Примечание:

¹_{Некоторые биотипы S. Newcastle образуют газ;}

²_{S. sonnei сбраживают лактозу медленно.}

------------------------------

Триб Klebsiella представлен четырьмя родами: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia и Serratia. Род Klebsiella включает неподвижные капсульные палочки, располагающиеся попарно или короткими цепочками. К этому роду относятся микроорганизмы, вызывающие заболевания человека: Klebsiella pneumoniae является возбудителем пневмонии, Klebsiella ozaenae вызывает озену и другие хронические заболевания респираторного тракта, Klebsiella rhinoscleromatis является возбудителем риносклеромы. Бактерии рода Klebsiella могут вызывать также воспалительные процессы различных органов и тканей. Klebsiella pneumoniae хорошо растет на обычных питательных средах в виде слизистых колоний. Дифференциацию рода Klebsiella от Enterobacter, Hafnia и Serratia следует проводить, используя тесты определения подвижности, образования индола, реакций с метил-рот и Фогес-Проскауера, гидролиза желатины, ферментации инозита и усвоения лизина, аргинина и орнитина (табл. 7). Для серологической идентификации бактерий рода Klebsiella Московским НИИВС им. И.И. Мечникова разработаны капсульные сыворотки.

Следует учитывать материал, из которого выделены культуры: из респираторного тракта выделяется Klebsiella, из фекалий и мочи - Enterobacter. Дифференциация рода Klebsiella проводится по биохимическим свойствам (табл. 8).

Таблица 7

Дифференциация триба Klebsiellae

Тесты	Klebsiella	Enterobacter		Hafnia	Serratia
		cloacae	aerogenes
Индол	-/+	-	-	-	-
Реакция с метил-рот	-/+	-	-	+/-	-/+
Реакция Фогес-Проскауера	+/-	+	+	+/-	+
Желатина	-	(+)	-/(+)		+
Лизин	+	-	+	+	+
Аргинин	-	+	-	-	-
Орнитин	-	+	+	+	+
Инозит	+	-	+	-	х
Подвижность	-	+	+	+	+

Таблица 8

Биохимические свойства разных видов рода Klebsiella

Тесты	KI. pneumoniae	KI. rhinoscleromatis	KI. ozaenae
Глюкоза	кг	-	+/-
Лактоза	кг	-	к
Сахароза	кг	кг	к
Мочевина	+	-	+/-
Реакция Фогес-Проскауера	+	-	-
Реакция с метил-рот	-	+	+
Лизин	+	-	+/-
Цитрат	+	-	+/-
Малонат	+	+	-

Примечание: кг - образование кислоты и газа;

к - образование кислоты.

Род Enterobacter включает два вида: Enterobacter cloacae и Enterobacter aerogenes. Дифференциация между этими видами осуществляется по различной ферментации лизина, аргинина, инозита.

Триб Proteae представлен родом Proteus, включающим пять видов: Р. vulgaris, Р. mirabilis, Р. morgani, Р. rettgeri, Р. inconstans (Providentia Stuarti). Характерными свойствами микробов рода Proteus являются: негативная окраска по Граму, подвижность, ползучий рост большинства штаммов Р. vulgaris и Р. mirabilis на питательных средах, ферментация глюкозы с образованием кислоты и газа, разложение мочевины в первые часы, за исключением Р. inconstans (Providencia Stuarti) и фенилаланина. Их дифференциация по тестам приведена в табл. 9.

Таблица 9

Дифференциация внутри триба Proteae

Тесты	Proteus
	vulgaris	mirabilis	morgani	rettgeri	inconstans
Индол	+	-	+	+	+
НД	+	+	-	-	-
Цитрат Симмонса	х	+/(+)	-	+	+
Желатина	+	+	-	-	-
Орнитин	-	+	+	-	-
Адонит	-	-	-	+	+/-
Инозит	-	-	-	+	-/+
Глюкоза (газ)	+/-	+	+	-/+	+/-
Маннит	-	-	-	+	-
Мочевина	+	+	+	+	-

Примечание: х - различные реакции.

Для серологической идентификации бактерий рода Proteus - Московский НИИВС им. И.И. Мечникова выпускает поливалентные и типовые к О- и Н-антигенам адсорбированные сыворотки. Разработаны также поливалентные и типовые адсорбированные сыворотки для идентификации бактерий рода Providencia (Proteus inconstans).

Для идентификации энтеробактерий в практических лабораториях приемлема схема дифференциации с использованием минимального набора тестов, предложенная Всесоюзным центром по эшерихиям и модифицированная в микробиологической лаборатории МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Методика заключается в следующем. Через 18 - 20 часов после посева исходного материала на питательные среды отбирают колонии и засевают их на модифицированную среду Олькеницкого для первичной дифференциации по основным тестам: ферментация глюкозы с наличием или отсутствием газообразования, ферментация лактозы, образование сероводорода и наличие уреазы.

На следующий день на основании результатов роста культур, выделенных на данной среде, и с учетом полученных вариантов проводят вторичную биохимическую дифференциацию по дополнительным тестам.

Приводим возможные варианты первичной дифференциации.

Вариант 1: глюкоза кг/к, лактоза -, H ₂S -, мочевина -. Образование кислоты или кислоты с газообразованием на глюкозе учитывают по посинению столбика среды с газо- или без газообразования. Этот вариант реакции характерен для Shigella, Escherichia, Hafnia, Serratia, Proteus inconstans. Для дифференциации этих микроорганизмов рекомендуется изучение усвоения цитрата, индолообразование, определение подвижности, декарбоксилирование фенилаланина и лизина, ферментация рамнозы и сорбита (табл. 10).

Таблица 10

Схема дифференциации Enterobacteriaceae
(вариант 1: глюкоза кг/к; лактоза -; мочевина -; H ₂S -)

Тесты	Escherichia	Shigella	Hafnia	Sirratia	Proteus inconstans
Цитрат Симмонса	-	-	х	+	+
Индол	+/-	-/+	-	-	+
Подвижность	+/-	-	х	+	х
Фенилаланин	-	-	-	-	+
Лизин	+/-	-	+	+	-
Рамноза	+/х	х	+	-	-
Сорбит	+/х	х	-	+	х

Вариант 2: глюкоза кг, лактоза -, H ₂S +, мочевина -. Эти свойства учитывают по изменению столбика среды в серовато-зеленоватый цвет с газообразованием и почернением. Этот вариант характерен для Citrobacter, Salmonella, Edwardsiella. Для дифференциации этих видов рекомендуется постановка тестов: рост на среде Симмонса, индолообразование, декарбоксилирование лизина (табл. 11). Некоторые лактозопозитивные варианты Citrobacter дают изменение косяка в синий цвет.

Вариант 3: глюкоза кг/к, лактоза +, H ₂S -, мочевина -. Эти свойства проявляются посинением столбика среды с газообразованием и посинением косяка. Изменения среды характерны для Escherichia, Enterobacter aerogenes, Serratia, Hafnia. Дифференциацию между этими видами проводят по росту на среде Симмонса, индолообразованию и декарбоксилированию лизина, разложению сорбита и рамнозы (табл. 12).

Таблица 11

Схема дифференциации Enterobacteriaceae
(вариант 2: глюкоза кг; лактоза -; мочевина -; H ₂S +)

Тесты	Citrobacter	Salmonella	Edwardsiella
Цитрат Симмонса	+	+/-	-
Индол	-/+	-	+
Лизин	-	+	+

Таблица 12

Схема дифференциации Enterobacteriaceae
(вариант 3: глюкоза кг/к; лактоза +; мочевина -; H ₂S -)

Тесты	Hafnia	Serratia	Enterobacter aerogenes	Escherichia
Цитрат Симмонса	х	+	+	-
Индол	-	-	-	+/-
Сорбит	-	+	+	+
Лизин	+	+	+	+/-
Рамноза	+	-	+	+/х

Вариант 4: глюкоза -, лактоза -, H ₂S +/-, мочевина +. Усвоение мочевины проявляется окрашиванием всей среды в оранжевый цвет. Образование H ₂S характерно для Proteus vulgaris и Proteus mirabilis. Оно проявляется почернением столбика среды. Дифференциацию между Pr. vulgaris и Pr. mirabilis проводят по тестам индолообразования и разложения мальтозы, между Pr. morgani и Pr. rettgeri - по росту на среде Симмонса и ферментации инозита (табл. 13).

Вариант 5: глюкоза кг/к, лактоза -, H ₂S -, мочевина (+) - замедленная реакция. Эти свойства проявляются в первые сутки посинением столбика среды с газообразованием на слабооранжевом фоне, на вторые сутки вся среда приобретает оранжевый цвет. Дифференциация проводится между Klebsiella и Enterobacter по определению подвижности, декарбоксилированию лизина и ферментации инозита. Для уточнения разложения мочевины следует делать дополнительный посев на среду Преуса. В данном варианте разложение лактозы Klebsiella не проявляется (табл. 14).

Таблица 13

Схема дифференциации Enterobacteriaceae
(вариант 4: глюкоза -; лактоза -; мочевина +; H ₂S +/-)

Тесты	Proteus morgani	Proteus rettgeri	Proteus vulgaris	Proteus mirabilis
Цитрат Симмонса	-	+	х	+(+)
Индол	+	+	+	-
Мальтоза	-	-	+	-
Фенилаланин	+	+	+	+
Инозит	-	+	-	-
H 2S	-	-	+	+

Таблица 14

Схема дифференциации Enterobacteriaceae
(вариант 5: глюкоза кг/к; лактоза -; мочевина -/(+); H ₂S -)

Тесты	Klebsiella	Enterobacter cloacae
Инозит	+	-
Подвижность	-	+
Лизин	+	-

Заключительным этапом всех отдифференцированных по биохимическим свойствам видов является серологическая идентификация с соответствующими агглютинирующими сыворотками.

Для определения ферментативных свойств с целью межродовой дифференциации и внутривидовой идентификации энтеробактерий Горьковский НИИЭМ выпускает стабильные бумажные системы - "СИБ" набор N 2 (малый) - 9 тестов и набор N 2 "В" (расширенный) - 23 теста.

Грамотрицательные аэробные палочки

Семейство Pseudomonadaceae включает несколько видов, в том числе Pseudomonas aeruginosa. Синегнойная палочка является условно-патогенным микроорганизмом и может быть выделена из различных образцов клинического материала. Особая роль принадлежит Pseudomonas aeruginosa в возникновении внутрибольничных инфекций в хирургических, ожоговых, онкологических, реанимационных и других отделениях.

Pseudomonas aeruginosa растет на обычных питательных средах, образуя сине-зеленый пигмент (некоторые штаммы беспигментны), имеет характерный фиалковый запах, обладает в отношении углеводов слабой активностью, разлагает только глюкозу с образованием кислоты без газа, обладает высокой протеолитической активностью. Характерным признаком этого микроорганизма является наличие фермента оксидазы и уреазы.

Дифференциацию Р. aeruginosa от семейства Enterobacteriaceae следует проводить по оксидазному и уреазному тестам. От рода Aeromonas дифференцируют Pseudomonas по ферментации (анаэробному разложению) глюкозы и сбраживанию маннита и ксилозы (табл. 15).

Таблица 15

Некоторые дифференциальные признаки родов Pseudomonas и Aeromonas

Тесты	Pseudomonas	Aeromonas
Пигмент	+/-	-/+
Ферментация глюкозы:
аэробно	+	+
анаэробно	-	+
Маннит	+/-	+
Ксилоза	+/-	-

Изучение рода Pseudomonas и дифференциации между отдельными видами проводят по тестам, указанным в табл. 16. Для серологической идентификации выпускаются поливалентные и сусорбированные сыворотки Днепропетровским предприятием по производству бакпрепаратов.

Таблица 16

Культуральная и биохимическая характеристики Pseudomonas

Тесты	Ps. aeruginosa	Ps. putida	Ps. fluorescens	Ps. cepacia
Наличие пигмента	+/-	-	+	х
Рост: при 41 °С	+	-	-	-
при 4 °С	-	х	+	-
Оксидаза	+	+	+	+
Уреаза	+	х	х	+
Желатина	+	-	+	+
Глюкоза	+	+	+	+
Сахароза	-	-	х	-
Мальтоза	-	-	+	+
Лактоза	-	-	х	+

Примечание: среды с углеродами готовятся при содержании 0,2 % поптона.

Род гемофильных палочек

К роду Haemophillus отнесены гемофильные палочки, включающие как патогенные, так и непатогенные для человека виды и выделяемые при исследовании верхних дыхательных путей: Н. influenzae, Н. parainfluenzae, Н. haemolyticus, Н. parahaemolyticus и др., а также Н. aegypticus, вызывающие воспаление конъюнктивы глаз.

Гемофильные бактерии очень требовательны к условиям культивирования и нуждаются для роста в добавочных факторах (X и V), содержащихся в крови. Обычно посев производят на кровяной агар (лучше 10 %) или шоколадный агар Левинталя. Колонии гемофильных бактерий вырастают довольно крупных размеров на среде Левинталя и более мелкие и плоские - на кровяном агаре. При микроскопическом исследовании эти микроорганизмы представляют собой грамотрицательные мелкие короткие палочки кокковидной формы. Они очень полиморфны и могут образовывать длинные нити; неподвижны, спор не имеют, медленно окрашиваются анилиновыми красками. Колонии можно снимать на кровяные, плотные или жидкие среды. Гемофильные палочки обладают ферментом каталазой и дают отрицательную оксидазную пробу.

При выделении из организма в первых генерациях (S-форма) Н. influenzae имеет капсулу. Капсульные штаммы сохраняют в свежей кроличьей крови при t - 4 °С. Если эти условия не соблюдаются, то капсульные штаммы в связи с диссоциацией в R-форму могут потерять капсулу.

Дифференциация палочки инфлюэнцы от других гемоглобинофильных бактерий основывается на изучении следующих тестов: потребность в V- и Х-факторах, образование капсулы в свежевыделенных культурах, отсутствие гемолиза (табл. 17).

Таблица 17

Дифференциальные свойства микробов рода Haemophillus

Тесты	Н. influenzae	Н. parainfluenzae	Н. haemolyticus	H. parahaemolyticus	H. aegypticus	H. aphrophilis
Факторы роста	XV	V	XV	V	XV	X
Гемолиз на кровяных средах	-	-	+	+	-	-
Капсула	+	-	-	-	-	-
Уреаза	+	-	-	-	+	-

Для серологической идентификации штаммов Н. influenzae разработаны капсульные политиповые и типовые сыворотки (к типам a, b, с, d, е, f), которые выпускает ГНИИСК. им. Л.А. Тарасевича.

Род Corunebacterium

Род Corynebacterium включает несколько видов, встречающихся у человека. Corynebacterium diphtheriae является возбудителем дифтерии у человека, бактериологическая диагностика изложена в "Инструкции по бактериологическому исследованию на дифтерию" (приложение N 4 к приказу МЗ СССР N 580 от 26 июня 1974 г.).

Corynebacterium xerosis выделен из конъюнктивального мешка глаз человека, непатогенен, представляет собой грамположительную палочку с гранулами (зерна волютина), растет круглыми мелкими колониями на агаре; на кровяном агаре растет более крупными колониями, не разжижает сыворотку, не дает гемолиза на кровяных средах, ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу с кислотой без газа. При бактериоскопии характерно расположение клеток попарно, под острым или прямым углом друг к другу, а также неравномерностью окраски тела каждой клетки, что обычно выявляется при окраске метиленовой синью. Corynebacterium xerosis следует дифференцировать от С. diphtheriae и С. pseudodiphtheriticum (табл. 18).

Таблица 18

Культуральная характеристика Corynebacterium

Тесты	С. xerosis	С. diphtheriae	С. preudodiphtheriticum
Бактериоскопия	Имеет гранулы волютина	Характерная морфология клеток с зернами волютина	Не имеет зерен волютина
Гемолиз	-	+	-
Сахароза	+	-	-
Уреаза	-	-	+
Желатина	-	-	-

Рецепты питательных сред

Кровяной агар. Расплавляют определенное количество 2 % мясо-пептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры 45 °С (не выше!) и прибавляют 5 - 10 мл дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика, барана или человека. Добавление крови производят соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, предварительно нагретые в термостате, дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

Желточно-солевой агар. Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясо-пептонный агар (pH 7,2 - 7,4) с содержанием 10 % хлорида натрия. После разлива во флаконы по 100 - 200 мл агара стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 1 атм. Перед употреблением растапливают, охлаждают до 45 - 50° и добавляют 20 % (по объему) стерильной желточной взвеси: один желток куриного яйца на 150 - 200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Среду быстро перемешивают и разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике.

Желчный бульон. К мясо-пептонному бульону, приготовленному на переваре Хеттингера, добавляют нативную желчь, устанавливают pH 7,6. При добавлении к 900 мл бульона 100 мл желчи получается 10 % желчный бульон. При добавлении к 800 мл бульона 200 мл желчи получается 20 % желчный бульон. Приготовленный бульон стерилизуют в автоклаве 20 - 30 минут при 1 атм.

Кровяной агар Левинталя. К растопленному 2 % агару, приготовленному на мясном бульоне и охлажденному до 70, добавляют 10 % дефибринированной крови, тщательно перемешивают и ставят на огонь через асбестовую сетку, все время встряхивая. При образовании пены агар снимают с огня. Повторяют такое кипячение три раза, после чего смеси дают немного отстояться для осаждения сгустков. Стерильно разливают отдельно прозрачную часть - во флаконы (для чашек), нижнюю часть (с осадком) - в пробирки. Контроль стерильности питательных сред проводят в термостате при 37° в течение 24 - 48 часов.

Цитратный агар Симмонса. В 1 л дистиллированной воды растворяют 0,2 г сульфата магния, 1,5 г фосфата натрия-аммония, 1 г одноосновного фосфата калия, 3 г цитрата натрия кристаллического. Смесь стерилизуют в автоклаве, прибавляют 20 г агар-агара, нагревают до его расплавления, устанавливают pH 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5 % спиртового раствора бромтимолового синего.

Цитратная среда Христенсена включает в себя лимоннокислый натрий 3 г, глюкозу - 0,2 г, дрожжевой экстракт - 22 мл, цистин солянокислый - 0,1 г, фосфорнокислый калий однозамещенный - 1 г, хлористый натрий - 5 г, феноловый красный 0,4 %, водный раствор - 3 мл, агар-агар-15 г, дистиллированную воду - 1000 мл. Среду стерилизуют в течение 15 мин при 1 атм, pH среды не устанавливается.

Для приготовления среды все соли предварительно растворяют в малых количествах воды. Затем соединяют с агаром и оставляют до его набухания. Состав кипятят до полного растворения агара, фильтруют и добавляют 0,4 % водный раствор фенолового красного (3 мл на 1 л среды). При образовании щелочи среда краснеет.

Приготовление дрожжевого экстракта для среды Христенсена производят следующим образом. В 1 л воды растворяют 500 г хлебных дрожжей, кипятят в течение 1 часа, после чего фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют в течение 30 минут при 0,5 атм. Добавляют 22 мл экстракта на 1 л среды Христенсена.

Сахарный бульон (бульон с глюкозой). К 100 мл мясо-пептонного бульона нейтральной реакции прибавляют 0,5 - 1 г глюкозы. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при 0,5 атм 30 минут.

Среда с желатиной. К мясо-пептонному бульону прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10 - 15 г на 100 мл. Желатине дают набухнуть, затем ее растворяют при медленном нагревании в водяной бане, доведенной до температуры 40 - 45 °С. Устанавливают pH 7,0, прибавляя к расплавленной желатине 10 % раствор бикарбоната натрия.

Профильтрованную среду разливают в пробирки по 5 - 8 мл так, чтобы не намочить край и верхнюю часть пробирки, соприкасающуюся с пробкой. Стерилизацию среды производят дробно 3 дня подряд по 1 часу при температуре 100 °С или однократно при 0,5 атм в течение 20 минут. После стерилизации среду охлаждают в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застудневании оставалась совершенно ровной.

Бульон с хлористым натрием. К 100 мл мясо-пептонного бульона нейтральной реакции прибавляют 6,5 г хлористого натрия. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при 0,5 атм 30 минут.

Ацетатная среда. В 1 л дистиллированной воды растворяют 0.2 г сульфата магния, 1,5 г фосфата натрия-аммония, 1 г одноосновного фосфата калия, 3 г ацетата натрия. Смесь стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20 г агар-агара и нагревают до его расплавления, устанавливают pH 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5 % спиртового раствора бромтимолового синего. Среда имеет травянисто-зеленый цвет.

Среда Тароцци. Нежирное мясо или печень нарезают мелкими кусочками, взвешивают и заливают тройным количеством (по весу) питательного бульона. После кипячения в течение 30 минут среду фильтруют. Кусочки мяса отмывают на сите водопроводной водой, просушивают, раскладывают по 2 - 3 кусочка в пробирки и по 8 - 10 кусочков в колбочки. Затем заливают их бульоном - по 5 - 6 мл в пробирки и по 100 мл в колбочки - и стерилизуют при 1 атм 30 минут.

Модифицированная среда Олькеницкого включает в себя сухой питательный агар (можно агар "Д") - 3 г, сухую среду Гисса с лактозой и индикатором ВР - 40 г, глюкозу х. ч. - 1 г, мочевину х. ч. - 10 г, гипосульфат натрия - 0,3 г, соль Мора - 0,2 г, воду дистиллированную до 1000 мл.

Предварительно в пробирке с небольшим количеством дистиллированной воды растворяют соль Мора с гипосульфитом. Мочевину с глюкозой растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в колбе на водяной бане. Оба раствора смешивают, добавляют сухой агар и среду Гисса с лактозой и доливают дистиллированную воду. Устанавливают pH 7,2 - 7,4, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 минут, после стерилизации устанавливают пробирки так, чтобы после застывания агара в пробирках образовался столбик и косяк.

На этой среде изучают свойства микроорганизмов с помощью следующих тестов:

- разложение глюкозы с образованием кислоты и газа определяют по посинению столбика с пузырьками газа в толще столбика;

- разложение лактозы - по посинению скошенной верхней части агара;

- образование фермента уреазы - по изменению цвета среды в оранжевый;

- способность к образованию сероводорода - по почернению среды (от темной линии по месту ее прокола до почернения всего столбика).

Среды с углеводами (Гисса). Среды приготавливают из расчета 2 г сухого агара с индикатором ВР и глюкозой, лактозой, маннитом, сахарозой, мальтозой на 100 мл холодной дистиллированной воды, тщательно перемешивают, кипятят на слабом огне до полного расплавления агара, после чего фильтруют через ватный фильтр, устанавливают pH 7,0 - 7,4. Горячую среду разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 минут в день или при 0,5 атм 20 минут.

Молоко с метиленовым синим. Свежее молоко доводят до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки, освобождают от сливок, вторично кипятят, оставляют снова на сутки и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10 % раствором карбоната натрия до pH 7,2. К 100 мл молока добавляют 2 мл 1 % водного раствора метиленового синего. Приготовленную среду разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут. Среда после остывания имеет насыщенно голубой цвет, при редукции метиленового синего среда обесцвечивается и приобретает кремовый цвет.

Среда с малонатом натрия. В 1 л воды растворяют 2 г сернокислого аммония - (NH ₄) ₂SO ₄, 0,4 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH ₂РО ₄), 0,6 г двузамещенного фосфорнокислого калия (К ₂НРО ₄), 2 г NaCl, 3 г малоната натрия, 0,25 глюкозы х. ч., 30 мл дрожжевого экстракта и 12 мл 0,2 % раствора бромтимол синего водного. Растворяют при подогревании плотные части, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют индикатор. Разливают в серологические пробирки по 2 мл, стерилизуют при 0,5 атм 30 минут.

Фенилаланиновый агар. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,1 г L- или 0,2 DL-фенилаланина, предварительно растворенного в 1 мл дистиллированной воды, 0,1 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, 0,5 г хлористого натрия, 0,3 г дрожжевого экстракта, 1,2 г агар-агара. Смесь подогревают в воде, фильтруют, разливают в серологические пробирки по 2 мл, стерилизуют при 0,5 атм 30 минут и сразу после стерилизации скашивают длинным косяком (среда не должна повторно подогреваться!).

Отдельно готовят 10 % раствор FeCl ₃, который является индикатором реакции (не стерилизуют). Несколько капель индикатора добавляют на поверхность роста культуры. При дезаминировании фенилаланина образуется фенилперувинная кислота, в результате чего на конденсате и косяке появляется зеленое окрашивание.

Среда Кларка. Смешивают в ступке 0,5 г пептона, 0,5 г глюкозы, 0,5 г К ₂НРО ₄ и растворяют в 80 мл дистиллированной воды, подогревая и помешивая на водяной бане в течение 20 минут. Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до 20° и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют дробно три дня подряд при 100 °С.

Среда Кларка служит для определения интенсивности кислотообразования из глюкозы с помощью реакций с метил-рот и Фогес-Проскауера. Приводим эти реакции.

1. Реакция с метил-рот. Культуру засевают на среду Кларка. К 5 мл четырехсуточной культуры прибавляют 5 капель 0,04 % раствора метилового красного (1 мл 1,6 % спиртового раствора метил-рота и 39 мл 96° спирта, раствор сохраняется неограниченное время). При сильном кислотообразовании (рН < 5) появляется красное окрашивание, при слабом (рН > 5) - желтое. При красном окрашивании реакции обозначают MR +, при желтом окрашивании MR -.

2. Реакция Фогес-Проскауера (образование ацетилметилкарбинола из глюкозы). Культуру засевают на среду Кларка и выращивают в течение 4 - 5 дней при температуре 30°. К 5 мл культуры прибавляют 1 мл 10 % водного раствора едкого калия и ставят в термостат при температуре 37°. Окраска появляется постепенно, поэтому реакция оценивается через 18 - 24 часа. Розовая окраска с желтой флюоресценцией, характерная для спиртовых растворов эозина, означает положительный результат. Если цвет не изменяется и среда остается бесцветной, результат отрицательный. Обычно эта реакция получается у бактерий, которые сбраживают глюкозу и дают отрицательную реакцию с метиловым красным (рН < 5).

Среды с аминокислотами (лизином, аргинином, орнитином) приготовляются следующим образом. К 120 мл бульона добавляют 180 мл дистиллированной воды, 1,5 пептона, 0,3 глюкозы (pH 6 - 6,1). Смесь кипятят, фильтруют и смешивают с 1,6 мл 0,2 % бромтимола синего. Полученную смесь делят на две части, к одной из них добавляют 1,5 г лизина, аргинина или орнитина. Вторая часть остается в качестве контроля. Среда должна иметь цвет зеленой травы. Стерилизацию проводят в течение 30 минут при 0,5 атм.

Комбинированная среда для посева крови. Во флаконы емкостью 100 мл разливают по 30 - 40 мл 2,0 % агара Хоттингера или сахарного агара. Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм, затем агар скашивают. Стерильно добавляют 0,5 - 1 % сахарный бульон, чтобы он не покрывал всю поверхность агара.

Среда с мочевиной (по Преусу) имеет следующий состав: мартеновский бульон (pH 7,0) - 100 мл, глюкоза 5 г, 50 % раствор мочевины - 20 мл, 0,2 % раствор бромтимола синего - 12 мл. Среда может быть приготовлена жидкой или плотной. Для получения плотной среды добавляют 17 г агар-агара. Среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром 15 минут или при 0,3 атм 20 минут. Среда имеет светло-зеленый цвет.

Среда для пневмококка и палочки инфлюэнцы. К агару Хоттингера (аминный азот 170 мг%, pH 7,6), добавляют 2,5 % свежей дефибринированной кроличьей крови и разливают в чашки Петри по 20 мл.

Тесты идентификации микроорганизмов

Определение индола. Полоски фильтровальной бумаги пропитывают реактивом, представляющим собой смесь парадиметиламидобензальдегида - 5 г, спирта этилового 96° - 50 мл, фосфорной кислоты очищенной концентрированной - 10 мл. После растворения порошка полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и хранят их в банке темного стекла. Цвет бумажек желтый. Посев культуры производят на среду с 0,3 % полужидким агаром, который одновременно служит для определения подвижности культуры. Для определения индола берут приготовленные бумажки и помещают в пробирки под пробку. Посевы ставят в термостат при температуре 37° на 18 - 24 часа. О наличии индола судят по изменению цвета бумажек от серовато-розового до интенсивно-малинового.

Определение сероводорода проводят при посеве на среду Олькеницкого. Положительный результат определяется по почернению среды.

Определение подвижности бактерий проводят при посеве уколом в столбик 0,3 % агара в пробирке, содержащей 5 мл среды. Подвижные микробы растут в толще среды по ходу укола.

Ферментация глюкозы и маннита в анаэробных условиях. Среду Гисса с глюкозой или маннитом и индикатором ВР разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют 20 минут при 0,5 атм. Перед посевом среду "регенерируют". Посев производят в две пробирки уколом. Одну пробирку заливают стерильным вазелиновым маслом - 1,0 мл. Помещают в термостат при температуре 37°. Наблюдение ведут до 5 суток. Стафилококки образуют кислоту из глюкозы в обеих пробирках. Микрококки образуют кислоту только в аэробных условиях. Все виды стафилококков ферментируют маннит аэробно, в анаэробных условиях ферментирует маннит только золотистый стафилококк. При ферментации нижняя часть столбика окрашена в синий цвет, при окислении верхняя часть столбика синеет.

Реакция плазмокоагуляции является одним из основных тестов определения патогенности стафилококков. Для реакции может быть использована сухая или жидкая кроличья плазма, жидкая человеческая плазма. Сухая кроличья плазма выпускается предприятием по производству бактерийных препаратов Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ БССР. Жидкую плазму получают при взятии крови в пробирку с 1,0 мл 5 % раствора лимоннокислого натрия. Для перемешивания крови пробирку вращают между ладонями (не образовывать пены!), затем центрифугируют и отсасывают плазму пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Приготовленную плазму хранят на холоде. Для опыта плазму разводят стерильным физиологическим раствором в 2 или 4 раза. Разведенную плазму разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки с пробками и вносят одну петлю испытуемой культуры. Культуру растирают до образования равномерной мути. Пробирки ставят в термостат на 3 - 6 часов, просматривая через каждый час, и оставляют при комнатной температуре до утра, отмечая результаты реакции. К каждой постановке опыта ставят для контроля пробирки, в одной из которых - плазма и физиологический раствор, в другой - плазма и заведомо плазмокоагулирующая культура стафилококка. При положительном результате плазма уплотняется и появляется сгусток. Если была использована цельная плазма, сгусток уплотняется полностью (+ + + +). Результаты учитываются следующим образом: плазма с физиологическим раствором дает отрицательный результат; плазма с плазмокоагулирующим стафилококком + + + +; плазма с испытуемой культурой может давать положительный результат, оцениваемый (+ +), (+ + +), (+ + + +), или отрицательный. Культуры стафилококка, коагулирующие плазму в течение 2 - 4 часов, обладают большей патогенностью, чем коагулирующие плазму в более поздние сроки или на следующий день.

Оксидазная проба. Для оксидазной пробы на стерильную фильтровальную бумагу (5 см в диаметре), помещенную в чашку Петри, наносят 1 каплю 0,5 - 1 % раствора ди- или тетраметилпарафенилендиамина. Затем петлей наносят 18-часовую испытуемую агаровую культуру. Реакцию учитывают через 20 - 30 секунд. При наличии оксидазы колонии окрашиваются в розовый или темно-красный цвет. Можно использовать бумажные диски, заранее пропитанные данным реактивом.

Определение уреазной активности проводится одним из двух методов. Первый на среде с мочевиной (по Преусу). В среду засевают культуру, учет результатов проводят через 18 часов. Культуры, обладающие ферментом уреазой, утилизируют мочевину и изменяют цвет среды.

Согласно второму методу, суточную культуру микроорганизмов с МПА петлей помещают в 0,5 % раствор мочевины, разлитый в агглютинационную пластину. Затем проводят инкубацию в термостате при температуре 37° в течение 1,5 часа. Образование аммония проверяется реактивом Несслера. При положительной реакции образуется желтая "пуговка" на дне лунки.

Определение ДНК-азной активности. В чашку Петри с 2 % МПА, содержащим ДНК из расчета 1 мг на 1 мл среды (10 мг на 10 мл среды в каждой чашке), засевают на сектора полоской 10 - 12 культур стафилококка. Чашки помещают в термостат на 18 часов, затем каждую чашку заливают 5 мл 1 N соляной кислоты. Вокруг колоний стафилококков, выделяющих ДНК-азу, образуются прозрачные зоны.

Определение протеина А стафилококков методом иммунофлюоресценции. Для постановки реакции необходимы: чистая культура стафилококков в концентрации 10.9 кл/мл в 0,15 М растворе NaCl, нормальная сыворотка барана, инактивированная при 56° в течение 30 минут, люминесцирующие антитела к гамма-глобулинам барана в рабочем разведении.

На обезжиренное предметное стекло с помощью пастеровской пипетки наносят каплю суспензии стафилококков. Мазок подсушивают на воздухе, затем фиксируют в 96° этиловом спирте в течение 15 - 20 минут и снова подсушивают. На фиксированный мазок наносят одну каплю инактивированной прогретой при 60° в течение 30 минут нормальной сыворотки барана в разведении 1:8 - 1:16. Время инкубации в термостате при температуре 37° - 15 - 20 минут. Мазок промывают в трех сменах 0,15 М NaCl с pH 7,0 - 7,2, затем высушивают на воздухе. На высушенный мазок наносят одну каплю люминесцирующих антител к гамма-глобулинам барана в рабочем разведении. Инкубация проводится в течение 15 - 20 минут при температуре 37°. Затем мазок отмывают от люминесцирующего глобулина и промывают последовательно в трех - четырех сменах физиологического раствора с pH 7,2 - 7,4. После последнего промывания мазок подсушивают. Просматривают препараты под люминесцентным микроскопом с иммерсионным объективом х 90. О наличии протеина А на клеточной стенке стафилококков судят по свечению клеток микроорганизмов. Оценка свечения: + + + + - четкое, очень яркое свечение ободка при темной середине клетки; + + + - четкое, яркое свечение ободка, при темной середине; + + - заметное окрашивание всей клетки; + - видны контуры клетки. О наличии протеина А судят по реакции, оцениваемой в + + + и + + + +.

Определение чувствительности стафилококков к новобиоцину. Стафилококки по чувствительности к новобиоцину дифференцируют на Staphylococcus aureus, epidermidis и saprophyticus. Минимальная подавляющая концентрация для Staphylococcus aureus, и epidermidis составляет 2 мкг. При данной концентрации новобиоцина и больше 2 мкг растут S. aureus и S. epidermidis. При концентрации новобиоцина меньше 2 мкг растут S. saprophyticus.

Для определения чувствительности стафилококков готовят новобиоцин в следующих разведениях: 1) 12 мг новобиоцина + 10 мл дистиллированной воды - исходное разведение; 2) 1 мл исходного разведения + 10 мл дистиллированной воды (100 мкг новобиоцина в 1 мл); 3) 1 мл второго разведения + 4 мл дистиллированной воды (20 мкг новобиоцина в 1 мл).

Для посева берут 9 мл расплавленного агара (МПА, Хоттингера), добавляют по 1 мл третьего разведения, разливают в чашки. Дают агару застыть. Посев производят петлей штрихом. Инкубируют в термостате при температуре 37° 18 - 24 часа, после чего учитывают результаты.

Проба с желчью служит для дифференциации пневмококков и зеленящих стрептококков. Стерильные диски из фильтровальной бумаги (можно использовать чистые диски, предназначенные для пропитывания антибиотиками) с соблюдением правил асептики пропитывают стерильным раствором 10 % желчи и подсушивают в закрытых чашках Петри. Диски с желчью накладывают на посеянный газон исследуемого материала, выросшего на 5 % кровяном агаре. Через 18 часов роста в термостате при температуре 37° производят учет результатов. Пневмококки образуют зону лизиса вокруг диска с желчью.

Определение потребностей в X- и V-факторах крови. Чашки Петри с простым агаром и агаром с кровью засевают: одну половину исследуемой культурой, а другую - исследуемой культурой с культурой Staphylococcus aureus. Если наблюдается рост на агаре с кровью, то исследуемый микроб требует Х-фактор. Если наблюдается на кровяном агаре рост испытуемой культуры совместно со стафилококком, то исследуемый микроб требует X- и V-факторы. Если наблюдается рост вместе со стафилококком на простом агаре, то микробы требуют V-фактор. Если наблюдается рост на простом агаре на секторе без стафилококка, то исследуемая культура не требует ни X, ни V-факторов.

При наличии дисков с X- и V-факторами на засеянную поверхность питательного агара накладывают диски на расстоянии 2 см друг от друга. Определяют рост вблизи одного из них. Для такого метода определения необходимо приготовить диски с X- и V-факторами.

При приготовлении дисков с Х-факторами центрифугируют 40 мл крови, к осадку эритроцитов добавляют при встряхивании 100 мл ацетона, содержащего 1,2 мл концентрированной HCl, фильтруют, затем к фильтрату добавляют 100 - 120 мл воды для осаждения гемина. Собирают фильтрат и промывают его водой. Растворяют гемин в 25 мл 0,1 М Na ₂HPO ₄ и стерилизуют при 115° 10 минут.

Диски с V-факторами готовят следующим образом: суспензируют 50 г прессованных хлебных дрожжей в 100 мл 0,2 М KH ₂РО ₄, нагревают в водяной бане при 80° 20 минут. Осветляют центрифугированием и стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией. Хранят в рефрижераторе.

Фильтровальную бумагу (ватман N 3) разрезают на диски диаметром около 1 см. Диски смачивают растворами X- и V-факторов и их смесью.

Определение щелочной фосфатазы. К 100 мл расплавленного и охлажденного 2 % МПА добавляют паранитрофенилфосфат (двунатриевая соль) из расчета конечной концентрации 0,05 %, и среду разливают в чашки Петри. Посев исследуемых штаммов (агаровые культуры) осуществляют петлей или штампом-репликатором. Учет результатов производят через 18 часов роста при 37° по появлению желтого окрашивания вокруг колоний стафилококка.