Методические указания по лабораторной диагностике копытной гнили овец (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 декабря 1985 г.)

1. Общие положения

1.1. Копытная гниль - инфекционная, хроническая болезнь овец, проявляющаяся хромотой с периодами обострения и характеризующаяся поражением кожи межкопытной щели, отслоением и гнилостным распадом копытного рога подошвы, а также боковых стенок копытец одной или нескольких конечностей.

К заболеванию восприимчивы взрослые овцы всех пород, а также ягнята старше 3-4 месяцев (после отъема).

1.2. Возбудитель болезни - Bacteroides nodosus (синонимы Fusiformis nodosus, Ristella nodosa, Sphaerophorus nodosus) представляет собой крупную прямую или слегка изогнутую по оси грамотрицательную палочку, не образующую спор и капсул. Палочки располагаются одиночно или попарно. Большинство из них имеют на одном или обоих концах утолщения, что делает их похожими на гантели. Палочки Bacteroides nodosus бывают окружены более мелкими грамотрицательными палочками, отходящими радиально.

1.3. Диагноз на копытную гниль устанавливают на основании комплекса показателей, включающих: клинические, эпизоотологические данные и результаты лабораторных исследований.

1.4. Для исследования в ветеринарную лабораторию направляют:

мазки-отпечатки из свежепораженных тканей;

мазки из слизи и слизь, покрывающую кожу межкопытной щели;

кусочки тканей, отобранные на границе здоровых и пораженных участков;

пораженные копыта от вынужденно убитых животных.

Отбор материала необходимо проводить от не подвергавшихся лечению и обработкам животных.

2. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика копытной гнили включает световую, люминесцентную микроскопии и биологическую пробу.

2.1. Световая микроскопия

2.1.1. Полученное мазки, мазки-отпечатки или препараты вновь приготовленные из доставленного патологического материала, окрашивают по Граму и исследуют под иммерсионной системой светового микроскопа.

2.1.2. Учет результатов исследования:

положительный - обнаружен возбудитель копытной гнили Bacteroides nodosus, который окружен мелкими грамотрицательными палочками, отходящими радиально;

сомнительный - обнаружен возбудитель морфологически сходный с Bacteroides nodosus (радиальное окружение грамотрицательными палочками отсутствует);

отрицательный - возбудитель копытной гнили не обнаружен.

2.2. Люминесцентная микроскопия

Для обнаружения возбудителя копытной гнили в патологическом материале применяют непрямой метод иммунофлуоресценции.

2.2.1. Компоненты реакции:

сухая гипериммунная кроличья сыворотка крови против возбудителя копытной гнили овец;

сухая люминесцирующая антикроличья сыворотка крови;

нормальная сыворотка крови кролика.

2.2.2. Методика исследования.

На предметных стеклах делают мазки или мазки-отпечатки из патологического материала. Высохшие препараты фиксируют ректифицированным спиртом (96°) в течение 20 минут.

Содержимое ампулы с сухой гипериммунной кроличьей сывороткой растворяют в 1 мл стерильного физиологического раствора рН 7,2-7,4 (неиспользованную разведенную сыворотку допускается хранить в холодильнике при температуре 4-10°С не более семи суток).

На фиксированные препараты наносят цельную гипериммунную кроличью сыворотку против копытной гнили овец. Препараты помещают во влажную камеру или в чашку Петри (для предупреждения высыхания сыворотки на их дно кладут фильтровальную бумагу смоченную водой). Камеру или чашку Петри ставят в термостат при 37°С на 45 мин. По истечении этого срока, для удаления несвязавшейся гипериммунной сыворотки, препараты промывают дважды по 10 мин физиологическим раствором (рН 7,2-7,4) и высушивают на воздухе.

Затем на препараты наносят люминесцирующую антикроличью сыворотку в рабочем разведении (рабочее разведение сыворотки будет в 2 раза меньше ее титра, указанного на этикетке, то есть если указан титр сыворотки 1:32, то ее рабочее разведение будет 1:16) и препараты вновь помещают во влажную камеру при температуре 37°С на 20 минут.

После окраски люминесцирующей сывороткой препараты промывают вначале физиологическим раствором (pH 7,2-7,4) в течение 10 минут, затем дистиллированной водой - в течение 5 минут и высушивают на воздухе.

На окрашенные и высушенные мазки и мазки-отпечатки наносят по одной капле забуференного глицерина (9 частей глицерина и 1 часть фосфатного буфера - рН 8,0), накрывают покровными стеклами и просматривают под люминесцентным микроскопом. В качестве иммерсионной среды используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло.

Одновременно ставят контроли:

исследуемый мазок или мазок-отпечаток из патологического материала (окрашивают люминесцирующей антикроличьей сывороткой без предварительной обработки гипериммунной кроличьей сывороткой);

исследуемый мазок или мазок-отпечаток из патологического материала (в первой фазе обрабатывают нормальной кроличьей сывороткой, во второй - люминесцирующей антикроличьей сывороткой).

2.2.3. Учет результатов исследования.

(++++) - очень яркая люминесценция по периферии микробных клеток, четко контрастируемая с их центром. Результат положительный;

(+++) - яркая люминесценция периферии микробных клеток, контрастируемая с их центром. Результат положительный;

(++) или (+) - слабая люминесценция периферии микробных клеток. Результат сомнительный;

(-) - люминесценция микробных клеток отсутствует. Результат отрицательный.

Учет результатов исследований будет достоверным при условии отсутствия люминесценции микробных клеток в контролях.

2.3. Биологическая проба

2.3.1. Биологическую пробу проводят при получении сомнительных результатов микроскопических исследований. Для опыта используют овец из благополучных по копытной гнили хозяйств.

С целью мацерации копыт животных перед заражением содержат в течение 10 дней на влажной подстилке.

2.3.2. У двух подопытных животных скарификатором или скальпелем на двух конечностях скарифицируют мацерированную кожу межкопытной щели путем нанесения по всей площади 10-15 линейных надрезов эпидермиса до появления лимфы.

2.3.3. Исследуемый материал растирают в стерильной ступке с добавлением мясо-пептонного бульона или физиологического раствора (pH 7,2-7,4) в соотношении 1:5-1:10.

2.3.4. Каждую овцу заражают в две конечности (переднюю и заднюю) путем втирания суспензии из патологического материала в скарифицированную кожу межкопытной щели. Дополнительно в межкопытные щели помещают тампоны из обезжиренной ваты, пропитанные этой же суспензией. Копыта бинтуют крестообразной повязкой. Животных содержат на влажной подстилке.

2.3.5. Через 4 дня после заражения повязку снимают, а копытца осматривают. В положительных случаях обнаруживают признаки начальной стадии болезни - алопецию, воспаление кожи межкопытной щели и наличие серовато-белой слизи с характерным ихорозным запахом. В последующем может наступить отслоение боковых стенок копытец и подошвы, развивается хромота.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 15 дней.

2.3.6. От заболевших животных отбирают материал и делают мазки и мазки-отпечатки для световой и люминесцентной микроскопии.

При положительных результатах биопробы в мазках и мазках-отпечатках обнаруживают возбудитель копытной гнили.

2.3.7. Если патологический материал взят от овец, пораженных некробактериозом, то на коже свода межкопытной щели у подопытных животных развивается неспецифическая гнойно-воспалительная реакция, которая заканчивается выздоровлением через 8-14 дней.

В мазках-отпечатках из мест поражения возбудитель копытной гнили отсутствует.

3. Сроки исследования:

- световая микроскопия - 1 день;

- люминесцентная микроскопия - 1 день;

- постановка биопробы - до 15 дней.

С изданием настоящих методических указаний утрачивают силу Временные методические указания по обнаружению возбудителя копытной гнили (Fusiformis nodosus) в патологическом материале от больных овец с помощью непрямого метода иммунофлуоресценции, утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 11 декабря 1978 года.

Начальник Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР

А.Д. Третьяков