Методические рекомендации N МР 3.1.0308-22 "Методика определения сублиний BA.1*, BA.2* геноварианта "Омикрон" вируса SARS-CoV-2 методом ПЦР в режиме реального времени" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 27 декабря 2022 г.)

Методические рекомендации N МР 3.1.0308-22
"Методика определения сублиний BA.1*, BA.2* геноварианта "Омикрон" вируса SARS-CoV-2 методом ПЦР в режиме реального времени"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 27 декабря 2022 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее - МР) представлен алгоритм проведения лабораторного исследования для определения сублиний геноварианта "Омикрон" вируса SARS-CoV-2 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (далее - ОТ-ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.

1.2. МР разработаны с целью обнаружения двух мутаций S-белка геноварианта "Омикрон" BA.1*: делеция del211 (3 нуклеотида) вместе с инсерцией Ins214EPE (9 нуклеотидов), и мутация S-белка геноварианта "Омикрон" ВА.2*: делеция del24-26 (9 нуклеотидов). Методика позволяет проводить скрининговые исследования с целью определения геноварианта "Омикрон" в образцах с выявленным вирусом SARS-CoV-2 при помощи технологии полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР).

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами лабораторий и научных организаций, проводящих исследования методом ОТ-ПЦР.

II. Общие положения

2.1. Возбудителем коронавирусной инфекции является вирус SARS-Cov-2, который с момента выявления в декабре 2019 г. накапливал изменения в структуре генома. Изменчивость вируса привела к возникновению линий, обозначенных Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) как VOC (англ. Variants of Concern) и VOI (англ. Variants of Interest) ¹. В настоящее время широкое распространение получил вариант "Омикрон" (англ. Omicron (В.1.1.529)), впервые обнаруженный в ноябре 2021 г. в Южной Африке, а в декабре был идентифицирован в более 80 странах.

------------------------------

¹_{Официальный сайт Всемирной организации здравоохранения, информация об отслеживании вариантов вируса SARS-CoV-2: www.who.int/ru/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/tracking-SARS-CoV-2-variants (в свободном доступе).}

------------------------------

Особенностью варианта "Омикрон" (В.1.1.529) является большое количество мутаций в S-белке (около 30 SNP, 3 делеции, 1 вставка) по сравнению с предыдущими геновариантами, что и обеспечило его конкурентное преимущество и вытеснение ранее циркулирующего варианта "Дельта". Внутри линии "Омикрон" выделяется несколько сублиний, при этом BA.1 и ВА.2 - доминирующие. Выявляются достоверные различия в геномной структуре сублиний ВА.1 и ВА.2 [11].

2.2. Для молекулярно-генетического мониторинга циркулирующих штаммов SARS-CoV-2 и выявления новых вариантов используются методы фрагментного и полногеномного секвенирования. В дополнение к секвенированию применение разработанной методики дает возможность оперативного реагирования в условиях неблагоприятной эпидемиологической ситуации.

III. Описание метода

3.1. Метод ПЦР способен идентифицировать возбудителей инфекционных болезней на основе выявления их генетического материала (ДНК или РНК) в пробах, полученных от обследуемого человека.

Анализ исследуемых образцов включает этапы обратной транскрипции (ОТ) РНК, выделенной из клинического материала, амплификации специфических фрагментов комплементарной ДНК (кДНК) SARS-CoV-2 в ходе ПЦР и детекции продуктов амплификации в режиме реального времени. Для оценки проведения ПЦР отдельно используются положительный контроль ПЦР (далее - К+) и отрицательный контроль ПЦР (далее - К-). Реакция ОТ проводится с целью образования кДНК на матрице РНК с дальнейшим выявлением специфического фрагмента вируса и накоплением продукта амплификации в ходе ПЦР путем детекции флуоресценции, испускаемой флуоресцентно-меченым гидролизным зондом. Начало флуоресценции и интенсивность количественно зависят от концентрации детектируемого фрагмента кДНК в образце. Для амплификации специфического участка кДНК используются олигонуклеотиды, для детекции накопления специфического продукта используются флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды. Состав набора реагентов для определения сублиний геноварианта "Омикрон" SARS-CoV-2 содержит олигонуклеотиды и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, специфичные к каждому варианту "Омикрона" в соответствии с характерными для них мутациями, и позволяющие проводить регистрацию флуоресценции по разным каналам детекции JOE/HEX и FAM для каждого типа.

Учет результатов и установление наличия РНК вируса SARS-CoV-2 производится путем анализа данных о пороговом цикле флуоресценции (Ct) образца, показывающем обратную зависимость значения цикла пороговой флуоресценции от количества целевой РНК в пробе. Наименьшее значение циклов соответствует максимальной концентрации РНК вируса. Постановку ПЦР проводят на амплификаторах с функцией детекции флуоресценции в режиме реального времени по каналам FAM/Green и HEX/Orange планшетного (например, CFX96) или роторного типа (например, Rotor-Gene 3000/6000 или Rotor-Gene Q).

Цикличность ПЦР достигается путем многократного (от 40 до 45 раз) последовательного повторения шагов инкубации реакционной смеси при температурах: плюс 95 °С (денатурация ДНК/кДНК), плюс 55 °С (отжиг праймеров и элонгация цепи ДНК).

3.2. Исследование методом ПЦР состоит из следующих этапов:

- экстракция нуклеиновых кислот (далее - НК) из образцов исследуемого биологического материала (экстракция НК может проводиться различными способами, включая автоматизированные);

- получение кДНК на матрице РНК вируса в реакции ОТ в условиях одной пробирки с последующим проведением ПЦР;

- амплификация кДНК при помощи специфичных к выбранным мутациям праймеров в присутствии флуоресцентно-меченных зондов, специфичных для определяемых мутаций SARS-Cov-2;

- анализ и интерпретация результатов.

3.3. Выбор, отбор, хранение и использование биологического материала осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ² и методическими документами ³.

------------------------------

²_{Глава IV СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21); главы II, III СП 3.1.3597-20 "Профилактика новой коронавирусной инфекции (COVID-19)", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.05.2020 N 15 (зарегистрировано Минюстом России 26.05.2020, регистрационный N 58465), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 13.11.2020 N 35 (зарегистрировано Минюстом России 16.11.2020 N 60909); от 11.10.2021 N 25 (зарегистрировано Минюстом России 14.10.2021, регистрационный N 65406); от 09.11.2021 N 29 (зарегистрировано Минюстом России 12.11.2021, регистрационный N 65801); от 04.12.2021 N 33 (зарегистрировано Минюстом России 06.12.2021, регистрационный N 66208); от 21.01.2021 N 2 (зарегистрировано Минюстом России 25.01.2022, регистрационный N 66988); от 28.01.2022 N 3 (зарегистрировано Минюстом России 22.02.2022, регистрационный N 67407); от 04.02.2022 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 04.02.2022, регистрационный N 67165); от 20.06.2022 N 18 (зарегистрировано Минюстом России 01.07.2022, регистрационный N 69091).}

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Дату названного постановления N 2 следует читать как "21.01.2022"

³_{МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09); МР 3.1.0272-22 "Молекулярно-генетический мониторинг штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 10.01.2022.}

------------------------------

3.4. ПЦР-исследования проводятся в лицензированных организациях, имеющих разрешение на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний ⁴, а также в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение ⁵.

------------------------------

⁴_{Постановление Правительства Российской Федерации от 01.06.2021 N 852 "О лицензировании медицинской деятельности (за исключением указанной деятельности, осуществляемой медицинскими организациями и другими организациями, входящими в частную систему здравоохранения, на территории инновационного центра "Сколково") и признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации".}

⁵_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

3.5. Методика скрининга предназначена для качественного определения РНК геноварианта SARS-CoV-2 "Омикрон" методом ОТ-ПЦР и позволяет дифференцировать сублинии ВА.1*, ВА.2* в ходе проведения оперативного молекулярно-эпидемиологического мониторинга с целью идентификации и типирования вируса.

IV. Биологический материал для исследования

4.1. В качестве исследуемого материала рекомендовано использовать пробы от пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом новой коронавирусной инфекции с учетом критериев для забора материала на исследование ПЦР в реальном времени ⁶.

------------------------------

⁶_{Приложение 2 МУ 1.3.2569-09.}

------------------------------

V. Материально-техническое обеспечение

5.1. Рекомендовано зонирование помещений:

- рабочая зона 1 - прием, регистрация, разбор и первичная обработка материала. Осуществление приема материала, его маркировка, регистрация в журнале, первичная подготовка, объединение или разделение проб на аликвоты, обеззараживание и хранение проб, обеззараживание остатков исследуемого материала;

- рабочая зона 2 - выделение (экстракция) нуклеиновых кислот. Проведение экстракции и очистки НК микроорганизмов из проб, подготовленных в рабочей зоне 1;

- рабочая зона 3 - проведение реакции амплификации и учет ее результатов. Приготовление реакционных смесей, проведение ОТ, амплификация НК и учет результатов амплификации.

Рекомендуется разделить рабочую зону 3 на две подзоны (3а и 3б) и разместить их в отдельных помещениях. В подзоне 3а осуществляют приготовление реакционных смесей и проведение ОТ. В подзоне 3б проводят амплификацию НК и учет результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции.

5.2. Необходимо предусмотреть для обеззараживания исследуемого материала наличие автоклавной комнаты, которая может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.

5.3. Сбор, хранение и утилизация отходов проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁷.

------------------------------

⁷_{Глава X СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный N 62297), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный N 64146); от 14.12.2021 N 37 (зарегистрировано Минюстом России 30.12.2021, регистрационный N 66692); от 14.02.2022 N 6 (зарегистрировано Минюстом России 17.02.2022, регистрационный N 67331).}

------------------------------

VI. Оборудование и материалы

6.1. Проведение ОТ-ПЦР и детекция продуктов амплификации в режиме реального времени проводится в лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот, и нуждается в применении дополнительного оборудования и материалов (приложение к настоящим МР).

VII. Проведение исследования

7.1. Использование набора реагентов подразумевает работу с готовыми образцами РНК, выделенными из клинического материала.

7.2. В рабочей зоне 3 размораживаются при температуре от плюс 20 до плюс 25 °C следующие компоненты набора: Amp 1B, Amp 1RT, Amp 2 Omicr, K+ Omicr, К-, а также образцы исследуемого материала, если они хранились в замороженном состоянии (от минус 18 до минус 25 °С). Алгоритм проведения исследования описан в п. 7.2.1 - 7.2.12.

7.2.1. Необходимо рассчитать объем компонентов для общей реакционной смеси, исходя из количества исследуемых образцов. Учесть необходимость постановки положительных и отрицательных контролей реакции К+, К- (табл. 1).

7.2.2. Содержимое пробирок тщательно перемешивается четырехкратным переворачиванием, затем встряхиванием на вортексе, не допуская образования пены; осадить капли в микроцентрифуге в течение 5 с.

Таблица 1

Компоненты реакционной смеси

Компонент	Объем на одну реакцию
Реактив Amp 1RT	1 мкл
Реактив Amp 1В	12,5 мкл
Реактив Amp 2 Omicr	1,5 мкл

7.2.3. Приготовить общую реакционную смесь и тщательно перемешать встряхиванием на вортексе; осадить капли со стенок пробирок в микроцентрифуге в течение 5 с.

7.2.4. Подготовить пробирки/стрипы/планшет для ПЦР (в зависимости от числа проб и типа амплификатора): установить в штатив, промаркировать, надписи должны быть минимальными, не использовать маркер, который флуоресцирует при возбуждении светом, избегать надписей на поверхностях пластика, задействованных в детекции флуоресценции.

7.2.5. Внести по 15 мкл общей реакционной смеси во все пробирки (лунки) для ПЦР в соответствии с числом исследуемых проб.

7.2.6. Подготовить контрольные и исследуемые образцы РНК. После размораживания контрольные и исследуемые образцы центрифугировать в микроцентрифуге в течение 5 с для осаждения капель со стенок и крышки.

7.2.7. Добавить 10 мкл К- в пробирки для ПЦР, соответствующие отрицательным контрольным образцам ПЦР.

7.2.8. Добавить по 10 мкл РНК исследуемых образцов в соответствующие пробирки для ПЦР.

7.2.9. Добавить 10 мкл К+ в пробирки для ПЦР, соответствующие положительным контрольным образцам этапа ПЦР.

7.2.10. Закрыть крышки пробирок для ПЦР; осадить капли центрифугированием в микроцентрифуге в течение 10 с.

7.2.11. Пробирки с внесенными исследуемыми образцами, К+ и К- установить в блок амплификатора.

7.2.12. Запустить программное обеспечение амплификатора. Открыть созданный ранее шаблон или ввести параметры ПЦР в зависимости от типа амплификатора для ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (табл. 2), создать разметку плашки в соответствии с установленными пробирками в блок амплификатора, выбрать каналы детекции FAM и JOE/HEX, запустить программу амплификации.

Таблица 2

Условия проведения амплификации и детекции результатов

Температура, °C	Время		Количество циклов
50	15 мин		1
95	5 мин		1
95	10 с		40
55	30 с * Детекция флуоресцентного сигнала
Omicron ВА.1 * Omicron ВА.2 *		JOE/HEX FAM
Примечание: * - детекция флуоресцентного сигнала

VIII. Анализ результатов исследования

8.1. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции, имеющей экспоненциальный подъем, с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения Ct. Достоверность результатов определяется отсутствием амплификации (не детектируемых значениях Ct) в образце отрицательного контроля.

8.2. Для анализа необходимо задать пороговую линию, соответствующую величине 10 % от среднего разгорания образцов по каждому каналу. Детекция результатов, полученных с помощью разработанной методики, проводится по каналу, указанному в таблице 3.

Таблица 3

Детекция мутации по каналу флуорофора

Геновариант	Детектируемая мутация	Канал
Омикрон BA.1*	del211	JOE/HEX
	Ins214EPE
Омикрон ВА.2*	del24-26	FAM

8.3. При определении значения Ct по соответствующему каналу мутация считается обнаруженной. Учет результатов проводят согласно таблице 4.

Таблица 4

Учет результатов

Результат	Мутация
	del211	lns214EPE	del24-26
Геновариант Омикрон ВА.1	Обнаружено	Обнаружено	Не обнаружено
Геновариант Омикрон ВА.2	Не обнаружено	Не обнаружено	Обнаружено
Отрицательный/ другие геноварианты SARS-CoV-2	Не обнаружено	Не обнаружено	Не обнаружено
Сомнительный	Обнаружено	Обнаружено	Обнаружено

IX. Интерпретация результатов

9.1. Положительный результат следует учитывать, если кривая амплификации пересекает базовую линию до порогового значения цикла Ct 35.

9.2. Определение двух мутаций S-белка делеция del211 вместе с инсерцией Ins214EPE характерно для геноварианта Омикрона ВА.1*.

9.3. Выявление мутаций S-белка делеций del24-26 определяет варианта Омикрона ВА.2*.

9.4. Отрицательный результат ОТ-ПЦР может быть получен при низком содержании РНК вируса SARS-CoV-2 в образце и не исключает возможность наличия мутаций.

9.5. В случае сомнительного результата необходимо провести повторное ПЦР-исследование соответствующего исследуемого образца, начиная с этапа экстракции. В случае повторения аналогичного результата в повторной постановке образец считать сомнительным и рекомендовать повторное взятие материала для анализа.

9.6. Полученные результаты исследования носят предварительный характер. Для достоверного установления принадлежности к геноварианту Омикрон рекомендуется использовать секвенирование.

9.7. Интерпретация результатов и оформление заключений проводятся на базе учреждений, выполнявших лабораторные исследования.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон Российской Федерации от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 01.06.2021 N 852 "О лицензировании медицинской деятельности (за исключением указанной деятельности, осуществляемой медицинскими организациями и другими организациями, входящими в частную систему здравоохранения, на территории инновационного центра "Сколково") и признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации".

3. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

4. СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".

5. Приказ Роспотребнадзора от 19.02.2021 N 56 "О совершенствовании молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции".

6. Приказ Роспотребнадзора от 08.07.2021 N 377 "О внесении изменений в приказ Роспотребнадзора от 19.02.2021 N 56 "О совершенствовании молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции".

7. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

8. МР 3.1.0272-22 "Профилактика инфекционных болезней. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции".

9. Письмо Роспотребнадзора от 20.01.2022 N 02/1167-2022-27 "О молекулярно-генетическом мониторинге штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции".

10. Всемирная организация здравоохранения. Отслеживание вариантов вируса SARS-CoV-2: www.who.int/ru/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/tracking-SARS-CoV-2-variants.

11. Shrestha L.B., Foster C., Rawlinson W., Tedla N., Bull R.A. Evolution of the SARS-CoV-2 omicron variants BA.1 to BA.5: Implications for immune escape and transmission. Reviews in Medical Virology. 2022. Vol. 32. I. 5. e2381.