Методические рекомендации МР 4.2.0327-23 "Молекулярное типирование энтеровирусов" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 июня 2023 г.)

Методические рекомендации МР 4.2.0327-23
"Молекулярное типирование энтеровирусов"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 июня 2023 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют алгоритм проведения молекулярного типирования энтеровирусов способом частичного секвенирования области VP1 генома.

1.2. Молекулярное типирование с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей региона VP1 является прямым методом идентификации серотипа энтеровируса, обладает высокими показателями специфичности.

На основании молекулярно-биологических свойств энтеровирусы разделены на 4 вида, включающие вирусы более 100 серотипов (приложение 1 к настоящим МР): Enterovirus A, Enterovirus В, Enterovirus С, Enterovirus D (приложение 1 к настоящим МР). К виду Enterovirus С относятся полиовирусы 3 типов ¹. Наибольшее количество случаев заболеваний энтеровирусной инфекцией связано с вирусами видов Enterovirus А и Enterovirus В.

------------------------------

¹_{Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний: www.picornaviridae.com (в свободном доступе).}

------------------------------

Тип энтеровируса определяется с использованием молекулярного типирования, которое основано на определении нуклеотидной последовательности области генома, кодирующей капсидный белок VP1. Полипептид VP1 содержит аминокислотные последовательности, определяющие серотип вируса.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами научно-исследовательских и медицинских организаций.

II. Показания к исследованию

2.1. Метод молекулярного типирования энтеровирусов применяется при осуществлении эпидемиологического надзора за энтеровирусной инфекцией, в том числе для проведения:

- мониторинга циркуляции энтеровирусов разных типов;

- расследования вспышек энтеровирусной инфекции;

- расследования атипичных, тяжелых и летальных случаев энтеровирусной инфекции.

2.2. Для проведения метода молекулярного типирования энтеровирусов необходимы условия для работы с возбудителями III группы патогенности и материалом, инфицированным или потенциально инфицированным диким полиовирусом ².

------------------------------

²_{Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).}

------------------------------

III. Техника безопасности

3.1. Организация рабочих помещений и техника безопасности при работе с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, а также с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом, осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³, а также методическими документами ⁴.

------------------------------

³_{Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21.}

⁴_{МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09).}

------------------------------

IV. Оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы

4.1. Настоящими МР рекомендуется применять оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы, приведенные в приложении 2.

V. Материал к исследованию

5.1. Для определения типа энтеровируса исследуются:

- нативные и пассированные в культуре ткани пробы клинического материала и объектов окружающей среды, в которых обнаружены энтеровирусы;

- нетипирующиеся ЦПА, выделенные от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и из объектов окружающей среды;

- энтеровирусы, выделенные и типированные в реакции нейтрализации в культуре ткани.

5.2. Для проведения молекулярного типирования энтеровирусов используются следующие образцы материала: положительные на присутствие энтеровирусов суспензии фекалий, спинномозговая жидкость, мазки из ротоглотки, носо/ротоглоточные смывы, мокрота, содержимое везикул, секционный материал, концентраты проб воды; культуральная жидкость пассированных образцов (содержащая неполиомиелитные энтеровирусы или нетипируемые ЦПА). В качестве исходного материала могут быть использованы препараты РНК, экстрагированные из перечисленных образцов (в случае, если с момента экстракции прошло не более 24 часов, препарат хранят при температуре плюс 4 °C, замораживание не допускается), или кДНК (допускается хранение препарата к ДНК при температуре плюс 4 °C, замораживание не рекомендуется).

5.3. Сбор, обработку, упаковку, хранение и транспортировку материала осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁵, а также методическими документами ⁶.

------------------------------

⁵_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

⁶_{МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.12.2005.}

------------------------------

При проведении молекулярно-генетических исследований используются стерильные наконечники для микропипеток и микропробирки, все операции проводятся в одноразовых перчатках, защитных очках. При работе с исходными образцами и материалом, содержащим нуклеиновые кислоты, применяются наконечники с аэрозольным барьером.

VI. Молекулярное типирование энтеровирусов с использованием секвенирования области VP1 генома

6.1. Порядок проведения исследований.

Определение типа энтеровирусов проводится путем анализа области VP1 генома, включающего:

- выделение РНК;

- постановку реакции обратной транскрипции;

- дифференциальную амплификацию фрагмента кДНК с праймерами, специфичными в отношении видов Enterovirus А и Enterovirus В (приложение 3 к настоящим МР);

- в случае отрицательного результата видоспецифичной амплификации проводят реакцию с праймерами, универсальными для видов Enterovirus A - D;

- очистку фрагмента кДНК;

- мечение фрагмента кДНК;

- очистку меченого фрагмента кДНК;

- определение нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК в автоматическом режиме;

- определение типа энтеровируса методом сравнения полученной последовательности с последовательностями энтеровирусов, представленными в международной базе нуклеотидных последовательностей ⁷.

------------------------------

⁷_{Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей - blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (в свободном доступе).}

------------------------------

На стадиях выделения РНК, постановки обратной транскрипции и амплификации кДНК рекомендуется введение отрицательного контроля.

6.2. Выделение РНК.

Проводят согласно инструкции по применению комплектов реагентов для выделения РНК.

6.3. Реакция обратной транскрипции.

Реакцию проводят в 20 мкл непосредственно после получения РНК пробы. Реагенты:

- ревертаза (M-MLV-обратная транскриптаза 200 ед./мкл) с 5-кратным ОТ-буфером, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, раствор дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ОТ, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;

- праймеры AN32, AN33, AN34, AN35.

Порядок проведения работы:

- приготовить смесь праймеров - указанные праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл смешать в отдельной пробирке в равных объемах;

- в промаркированные амплификационные пробирки внести по 1 мкл смеси праймеров AN32-35 (конечная концентрация 2 пкмоль/мкл каждого);

- индивидуальными наконечниками с фильтром внести по 10,2 мкл исследуемых проб, кратко центрифугировать;

- инкубировать при 65 °C в течение 1 мин;

- используя только индивидуальные для каждого реагента наконечники, в отдельной пробирке приготовить реакционную смесь для анализа необходимого числа проб (табл. 1), смесь перемешать;

Таблица 1

Приготовление реакционной смеси для обратной транскрипции

Реагенты	Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ОТ-буфер	4,0	8,0	12,0	16,0	20,0	24,0	28,0	32,0	36,0	40
дНТФ	4,0	8,0	12,0	16,0	20,0	24,0	28,0	32,0	36,0	40
Ревертаза	0,4	0,8	1,2	1,6	2,0	2,4	2,8	3,2	3,6	4,0
Ингибитор РНКаз	0,4	0,8	1,2	1,6	2,0	2,4	2,8	3,2	3,6	4,0

- в пробирки с пробами внести по 8,8 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

- инкубировать по программе: 42 °C - 30 мин; 95 °C - 5 мин;

- в каждую пробирку внести по 20 мкл ТЕ-буфера, кратко центрифугировать.

По 5 мкл полученной кДНК перенести в промаркированные пробирки отдельно для каждого способа амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов. Оставшуюся часть кДНК - хранить при температуре плюс 4 °C.

6.4. Амплификация фрагментов кДНК области VP1 генома энтеровирусов.

Реагенты:

- Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl ₂; модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с "отложенным стартом" 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl ₂; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; ДМСО; деионизованная вода, свободная от РНКаз; или наборы реагентов для постановки ПЦР;

- праймеры: для дифференциальной и универсальной амплификации области VP1 генома энтеровирусов методом двухраундовой ПЦР используют комбинации праймеров (табл. 2).

Таблица 2

Комбинации олигонуклеотидных праймеров, используемых на разных этапах амплификации и секвенирования кДНК области VP1 генома энтеровирусов

Этап амплификации	Способ амплификации
	Специфичный для Enterovirus А	Специфичный для Enterovirus В	Специфичный для Enterovirus A - D
1 раунд ПЦР	486 и 488	490 и 492	AN222 и AN224
2 раунд ПЦР	AN89 и EvAR	AN89 и EvBR	AN89 и AN88
Секвенирование	232 и 233m	232 и 233m	232 и 233

Амплификацию к ДНК с праймерами, специфичными в отношении вирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В или универсальными для Enterovirus А - D, проводят отдельно в разных пробирках в 2 раунда.

6.4.1. Первый раунд ПЦР.

Реакцию проводят в 15 мкл смеси. Порядок проведения работы:

- приготовить смесь праймеров для 1-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));

- отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 3);

- в амплификационные пробирки, содержащие по 5 мкл кДНК, внести по 10 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

- инкубировать в амплификаторе по программе для 1-го раунда ПЦР области VP1 генома:

[95 °C - 1 мин (95 °C - 20 сек; 42 °C - 20 сек; 60 °C - 20 сек) х 40 циклов, 60 °C - 5 мин] ⁸.

------------------------------

⁸_{Примечание : не допускается электрофоретическая детекция продукта первого раунда ПЦР перед постановкой второго раунда.}

------------------------------

Таблица 3

Приготовление реакционной смеси для 1 раунда ПЦР

Реагенты	Объем реакционной смеси в пересчете на количество и пробирок (мкл)
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ПЦР-буфер	3,0	6,0	9,0	12,0	15,0	18,0	21,0	24,0	27,0	30,0
дНТФ	0,9	1,8	2,7	3,6	4,5	5,4	6,3	7,2	8,1	9,0
Смесь праймеров	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
Taq полимераза	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
Вода	5,8	11,6	17,4	23,2	29,0	34,8	40,6	46,4	51,2	58,0

6.4.2. Второй раунд ПЦР.

Реакцию проводят в 30 мкл смеси. Порядок проведения работы:

- приготовить смесь праймеров для 2-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));

- отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 4);

- в промаркированные амплификационные пробирки, содержащие по 25 мкл реакционной смеси, внести по 5 мкл амплификата 1 раунда ПЦР, кратко центрифугировать;

- инкубировать в амплификаторе по программе для 2-го раунда ПЦР области VP1 генома:

[95 °C - 15 мин (95 °C - 10 сек; 60 °C - 10 сек; 72 °C - 10 сек) х 42 цикла, 72 °C - 5 мин].

Таблица 4

Приготовление реакционной смеси для 2-го раунда ПЦР

Реагенты	Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ПЦР-буфер	6,0	12,0	18,0	24,0	30,0	36,0	42,0	48,0	54,0	60,0
дНТФ	1,8	3,6	5,4	7,2	9,0	10,8	12,6	14,4	16,2	18,0
Смесь праймеров	0,4	0,8	1,2	1,6	2,0	2,4	2,8	3,2	3,6	4,0
Taq полимераза *	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	1,0
ДМСО	0,6	1,2	1,8	2,4	3,0	3,6	4,2	4,8	5,4	6,0
Вода	16,0	32,0	48,0	64,0	80,0	96,0	112,0	88,0	144,0	160,0
Примечание: * для 2-го раунда используют химически модифицирование то Taq ДНК-полимеразу для ПЦР с "отложенным стартом"

В результате ПЦР области VP1 генома синтезируют продукт размером 375 п.н., который визуализируют методом электрофореза в 1,5 %-м агарозном геле. При постановке проверочного электрофореза в лунку наносят 5 мкл амплификата. Электрофорез проводится при напряжении 150 В, в течение 15 - 20 мин.

6.5. Очистка полученных фрагментов ДНК для секвенирования.

Для очистки используют весь оставшийся объем амплификата (25 мкл). Очистку проводят из амплификата (если отсутствуют фрагменты ДНК неспецифичного размера) или агарозного геля (если в результате электрофореза наряду со специфичным продуктом визуализируются фрагменты ДНК неспецифичного размера) с использованием соответствующих наборов выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований. Концентрацию очищенной ДНК определяют методом электрофореза относительно концентрационного стандарта или на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

6.6. Секвенирование кДНК энтеровирусов в автоматическом режиме.

Набор реагентов для мечения ДНК выбирают в зависимости от модели используемого секвенатора, реакцию проводят согласно инструкции по применению. В случае использования капиллярных секвенаторов мечение фрагментов кДНК энтеровирусов проводят с использованием праймеров AN232 и AN233 или AN233m в соответствии со способом амплификации (табл. 2).

Очистку меченой ДНК и секвенирование в автоматическом режиме осуществляют в соответствии с протоколом производителя.

Меченые и очищенные фрагменты ДНК секвенируют в автоматическом режиме.

В случае использования капиллярных секвенаторов устанавливают нуклеотидные последовательности двух цепей фрагментов кДНК. При успешном секвенировании хроматограмма не имеет посторонних сигналов и читается до позиции, соответствующей длине анализируемого фрагмента ДНК (пики примерно одинаковой высоты). Для обеспечения достоверности филогенетического анализа каждый нуклеотид прочитывают по одному разу в каждом из направлений.

Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют методом сравнения с имеющимися в международной базе нуклеотидными последовательностями энтеровирусов с использованием программного обеспечения ⁹. Принадлежность нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК области VP1 генома энтеровируса того или иного типа определяют на основании уровня гомологии со сравниваемой последовательностью типового референтного штамма не менее 75,0 %.

------------------------------

⁹_{Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей - blast.ncbi.nlm.nih.gov (в свободном доступе). Примечание: допускается использование аналогичных или с лучшими характеристиками программных средств для сравнения установленной нуклеотидной последовательности.}

------------------------------

6.7. Результаты молекулярного типирования энтеровирусов загружаются в федеральную государственную информационную систему сведений санитарно-эпидемиологического характера (ФГИС СЭХ) ¹⁰.

------------------------------

¹⁰_{Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 N 2178 "Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера".}

------------------------------

6.8. Интерпретация результатов.

Типирование энтеровирусов с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона является прямым методом и характеризуется высокой специфичностью. Установленный с использованием данного метода тип вируса соответствует типу, определяемому в реакции нейтрализации с использованием набора гипериммунных сывороток. Если гомология установленной последовательности ни с одной из представленных последовательностей энтеровирусов известных типов не превышает 75,0 %, то предполагают выявление энтеровируса нового типа. Образцы, содержащие изоляты, соответствующие данным критериям, направляются для дальнейшего изучения в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора ¹¹, а также могут быть направлены в подведомственные организации Роспотребнадзора ¹².

------------------------------

¹¹_{Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".}

¹²_{Дальневосточный региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ХНИИЭМ Роспотребнадзора; Урало-Сибирский региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ФНИИВИ "Виром" Роспотребнадзора.}

------------------------------

6.9. Эффективность метода.

Данный алгоритм молекулярного типирования энтеровирусов был испытан на панели, содержащей 100 энтеровирус-положительных образцов. Тип энтеровируса установлен в 96 % случаев. Включение в алгоритм исследований способа дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома вирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В, в дополнение к способу универсальной амплификации генома энтеровирус видов Enterovirus А - D, повышает эффективность молекулярного типирования на 46,97 %.

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 N 2178 "Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера".

4. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

5. Приказ Минздрава России от 06.06.2012 N 4н "Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий".

6. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".

7. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

8. МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию".

9. МУ 3.1.1.2363-08 "Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполно) инфекции".

Библиографические ссылки

1. Патент N 2743352 Российская Федерация. Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus А и Enterovirus В: N 2020117726: заявл. 19.05.2020: опубл. 17.02.2021 / Голицына Л.Н.; правообладатель ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора // Бюллетень ФИПС "Изобретения. Полезные модели". 2021. N 5. 17.02.2021.

2. Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 seqences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens //J. Clin. Microbiol. 2006. Vol.44. P. 2698 - 2704.

3. Oberste M.S., Maher K, Williams A.J., Dybdahl-Sissoko N., Brown B.A., Gookin M.S., Penaranda S., Mishrik N., Uddin M., Pallansch M.A. Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses // J. Gen. Virol. 2006. Vol. 87 (Pt 1). P. 119-128.