Приложение 2. Пример протокола экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса бензофуранов

Приложение 2
к МР 1.2.0301-22

Пример протокола экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса бензофуранов

Протокол экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса бензофуранов
Критерий	Соответствие
1. Лаборатория, выполнившая эксперимент, имеет действующую аккредитацию в системе (ГОСТ ISO/IEC 17025, ГОСТ 33044)	ГОСТ ISO/IEC 17025, сертификат аккредитации POCC.RU.0001.510122, дата внесения в Реестр сведений об аккредитованном лице 06.04.2015. Лаборатория имеет опыт работ более 10 лет и имеет историческую базу данных
2. Испытания выполнены в соответствии с методиками (методами) (например, ГОСТ, МУ, Руководство)	1. Метод оценки обратных генных мутаций на бактериях	ГОСТ 32376 МУ 1.2.3364-16
	2. Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих	МУ 1.2.3364-16 ГОСТ 34660
	3. Щелочной кометный анализ in vivo на млекопитающих	МУ 1.2.3364-16
3. Критерии качества проведения экспериментов:
3.1. Название метода: Метод оценки обратных генных мутаций на бактериях
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Полная
2. Обоснование выбора растворителя		Приведено
3. Подтверждение генотипа каждой индикаторной культуры.		Выполнено
4. Комбинация штаммов (не менее 5 штаммов)		Исследование проведено на 5 штаммах, включая штамм, выявляющий перекрестные сшивки
5. Титр бактериальной суспензии (не менее 10 9 клеток/см 3)		Соответствует
6. Количество и диапазон концентраций (не менее 5 концентраций, рекомендуемая максимальная концентрация не менее 5 мг/чашка или нецитотоксичная концентрация)		Основной эксперимент 5 концентраций 0,05 - 5,0 мг/чашка; повторный эксперимент 1,25 - 6,0 мг/чашка
7. Выбор растворителя в соответствии с физико-химическими свойствами вещества и цитотоксичностью		Адекватный. ДМСО
8. Позитивные контроли.		Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Для штаммов Salmonella typhimurium ТА97, ТА98, ТА1535, ТА100, ТА102: 2-аминоантрацен в условиях метаболической активации. Без метаболической активации: 2-нитрофлуорен (ТА98). азид натрия (ТА100, ТА 1535), метилметансульфонат (ТА102), митомицин С и 9-аминоакридин (ТА97)
9. Условия проведения эксперимента (температура, время инкубации, количество чашек на концентрацию, присутствие/отсутствие смеси S9)		Стандартный чашечный тест в вариантах с присутствием и отсутствием системы метаболической активации при температуре плюс 37 °C, инкубация 64 - 72 час; три повтора на концентрацию
10. Контроль фона спонтанного мутирования		Соответствует литературным данным
11. Статистический анализ		Адекватный. Использован критерий Даннетта t и ранговый метод Спирмена (при = 0,05)
12. Критерии приемлемости тест-системы: - соответствие генетических характеристик, присущих каждому штамму, согласно его паспорту: наличие rfa мутации, ауксотрофность по гистидину, наличие плазмиды рКМ101 (кроме ТА1535) и pAQ1 для ТА102, чувствительность к УФ; - число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле укладывается в диапазон известной частоты спонтанных ревертантных мутаций по гистидину для каждого штамма; - положительные контроли проявляют выраженную мутагенную активность на всех штаммах в условиях метаболической активации и без нее		Соблюдены
13. Критерии определения положительного результата: - вещество рассматривается как обладающее мутагенной активностью, если оно вызывает воспроизводимое, зависящее от дозы и статистически достоверное увеличение частоты мутаций по сравнению с соответствующими отрицательными контролями у одного или более штаммов в условиях метаболической активации или без нее по меньшей мере в 2 независимых экспериментах. Число ревертантных колоний на чашку в опыте в 2 или более раз превышает число спонтанных ревертантных колоний в отрицательном контроле в случае штаммов ТА97, ТА98, ТА100, ТА102 и в 3 или более раз в случае ТА1535		Адекватны. Выбраны в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Обнаружено воспроизводимое статистически значимое повышение количества ревертантов по сравнению с отрицательным контролем при действии пестицида из класса бензофуранов в концентрациях 2,5 - 6,0 мг/чашка для штамма ТА98 в отсутствии метаболической активации и в концентрациях 5,0 - 6,0 мг/чашка для штамма TA98(+S9), а также штаммов TA100(S9), TA102(S9) и ТА1535 (S9). Также выявлена значимая монотонная зависимость повышения числа ревертантов указанных штаммов от концентрации объекта испытания. Однако кратность превышения числа ревертантов по сравнению с отрицательным контролем была меньше 2 в случае штаммов ТА100 и ТА102, что является биологически незначимым эффектом. Таким образом, биологически значимый мутагенный эффект обнаружен на штаммах ТА98 (кратность > 2) и ТА1535 (кратность > 3)
3.2. Название метода: Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих
Критерии 1. Информация об исследуемом соединении		Приведены необходимые данные
2. Обоснование выбора носителя (растворителя) в соответствии с физико-химическими свойствами вещества, способом введения (при этом носитель (растворитель) не должен оказывать токсического действия)		Приведено в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2). Растительное масло
3. Количество животных на группу (не менее 5 животных каждого пола)		5 особей каждого пола на группу
4. Разброс массы тела животных в группах перед началом исследования (не более 20 % от средней массы животных каждого пола)		Не более 14,5 % самцы; не более 18,0 % самки
5. Путь введения вещества		Внутрижелудочно (основной предполагаемый путь поступления - пероральный)
6. Положительный контроль		Циклофосфамид в дозе 40 мг/кг МТ. Выбран в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2)
7. Количество доз (не менее 3, с шагом 2 - 4 раза)		Использовано три уровня доз: 500, 1000, 2000 мг/кг МТ
8. Выбор МПД и диапазона доз с учетом общей токсичности и влияния на пролиферацию костного мозга (максимальная доза - 2000 мг/кг МТ)		МПД выбрана в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) - 2000 мг/кг МТ
9. Режим введения вещества животным и забора образцов биоматериала (2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга через 18 - 24 часа после 2-го или 3-го введения в случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно)		2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга через 22 часа после 2-го введения
10. Кодирование микропрепаратов		Выполнено
11. Микроскопический анализ микропрепаратов: - количество просчитанных клеток для доли полихроматофильных эритроцитов (далее - ПХЭ) среди общего числа эритроцитов - не менее 500 на животное; - количество просчитанных ПХЭ на животное - не менее 4000		- 500 клеток на животное; - Не менее 4000 ПХЭ на животное
12. Критерии приемлемости тест-системы: - не наблюдается смертности животных в группах положительного и отрицательного контролей, а также не наблюдается смертности, связанной с воздействием тестируемого вещества в группах экспозиции; - данные по частоте ПХЭ с микроядрами в сопутствующем отрицательном контроле находятся в границах 95 %-го распределения исторического отрицательного контроля лаборатории; - доля ПХЭ от общего числа эритроцитов после экспозиции с исследуемым веществом не должна быть менее 20 % от уровня в отрицательном контроле; - частота ПХЭ с микроядрами в группе положительного контроля должна быть статистически значимо выше этого же показателя в группе отрицательного контроля и согласовываться с базой данных положительного контроля в лаборатории		Критерии соблюдены: - не наблюдали смертности животных в группах положительного и отрицательного контролей, а также не наблюдали связанной с воздействием тестируемого вещества смертности в группах экспозиции; - средняя частота ПХЭ с микроядрами в отрицательном контроле (0,10 % у самок и 0,12 % у самцов) была на уровне исторического контроля лаборатории; - доля ПХЭ от общего числа эритроцитов в группах экспозиции с пестицидом из класса бензофуранов составляла не менее 81 % от уровня, определенного в отрицательном контроле; - частота ПХЭ с микроядрами в группе мышей, получавших циклофосфамид, была выше, чем значения этого параметра для отрицательного контроля, и сопоставима с историческими данными положительного контроля в лаборатории
14. Статистический анализ - для сравнения частоты ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции и отрицательного контроля выбран подходящий статистический метод, например метод построения 95 %-х доверительных интервалов обобщенной лог-линейной модели для распределения Пуассона; - для обнаружения линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы (или для оценки тренда) выбран подходящий статистический метод, например Мантеля-Хензеля		Адекватный. Использованы: - для сравнения частоты ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции и отрицательного контроля - метод построения 95 %-х доверительных интервалов профильного правдоподобия в рамках обобщенной лог-линейной модели для распределения Пуассона (при = 0,05); - метод Мантеля-Хензеля для оценки тренда (обнаружения линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы)
15. Критерии определения положительного результата. Исследуемое вещество является генотоксичным, если в исследовании обнаружено: - что по меньшей мере в одной из групп экспозиции наблюдается статистически значимое повышение частоты ПХЭ с микроядрами по сравнению с сопутствующим отрицательным контролем; - такое повышение частоты ПХЭ с микроядрами связано с дозой (на основании подходящего теста оценки тренда); - какой-либо из полученных результатов находится вне границ распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (например, выходит за 95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона)		Адекватны. В соответствии с методиками (методами) (см. п. 2): - средняя частота ПХЭ с микроядрами в группах экспозиции с пестицидом из класса бензофуранов в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг МТ значимо не отличалась от средней частоты ПХЭ с микроядрами в группе отрицательного контроля при = 0,05; - не обнаружено линейной зависимости частоты встречаемости ПХЭ с микроядрами от дозы при внутрижелудочном введении пестицида из класса бензофуранов при = 0,05 (р = 0,530); - ни один из полученных результатов не выходит за границы распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона)
3.3. Название метода: Щелочной анализ ДНК-комет на млекопитающих in vivo
Критерии: 1. Информация об исследуемом соединении		Полная
2. Обоснование выбора носителя (растворителя) в соответствии с физико-химическими свойствами вещества, способом введения (при этом носитель (растворитель) не должен оказывать токсического действия)		Приведено. Выбор растворителя корректный
3. Выбор животных для исследования (здоровые половозрелые грызуны в возрасте 6 - 10 недель)		Соблюдено
4. Количество животных на группу (не менее 5 животных каждого пола)		По 5 особей каждого пола в группе
5. Разброс массы тела животных в группах перед началом исследования (не более 20 % от средней массы животных каждого пола)		Не более 16,1 % самцы, не более 17,6 % самки
6. Выбор тканей для исследований (исходя из предполагаемого механизма действия, пути введения)		Адекватно - костный мозг, печень
7. Выбор положительного контроля (должен давать явно выраженный позитивный эффект)		Метилметансульфонат - генотоксикант прямого действия, выбранный в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) и подходящий для используемых тканей (печени и костного мозга)
8. Количество доз (не менее 3 с шагом менее )		Использовано три уровня доз: 500, 1000, 2000 мг/кг МТ
9. Выбор МПД и диапазона доз с учетом общей токсичности (максимальная доза - 2000 мг/кг МТ)		МПД выбрана в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) - 2000 мг/кг МТ
10. Режим введения вещества животным и забора образцов биоматериала (2 - 3 введения с интервалом 24 часа; забор образцов тканей через 2 - 6 часов после 2-го или 3-го введения в случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно)		2 введения с интервалом 24 часа; забор образцов костного мозга и печени через 3 часа после 2-го введения
11. Путь введения вещества (с учетом пути воздействия)		Внутрижелудочно (основной предполагаемый путь поступления - пероральный)
12. Время и условия хранения суспензий клеток от извлечения до приготовления микропрепаратов. Клетки должны храниться на льду в охлажденном буфере как можно более короткое время		Соблюдено. Образцы клеток хранили на ледяной бане вплоть до наслаивания на стекло. Время хранения образцов было не более 1,5 - 2 часов
13. Условия и параметры лизиса и электрофореза в соответствии с методиками (методами) (лизис - не менее часа при температуре плюс 2 - 8 °C в отсутствие белого света, продолжительность релаксации не менее 20 мин; электрофорез - напряженность электрического поля 0,7 В/см, сила тока 300 мА, продолжительность электрофореза не менее 20 мин при температуре плюс 2 - 10 °C)		Соблюдены. Лизис: 17 часов при температуре плюс 2 - 8 °C в отсутствие белого света. Температура буфера для электрофореза плюс 5 - 10 °C, сила тока 300 мА, напряженность электрического поля 0,7 В/см, время релаксации 20 мин, время электрофореза 30 мин
14. Микроскопирование и подсчет клеток (проводят с использованием автоматической или полуавтоматической системы анализа изображений; микропрепараты должны быть закодированы; подсчитывается не менее 150 клеток на животное. Количество клеток "ежей 3" учитывается отдельно. Для оценки индукции первичных повреждений ДНК используют показатель "% ДНК в хвосте")		Использована программа с автоматическим подсчетом параметров клетки; микропрепараты были закодированы; просчитаны не менее 150 клеток каждой ткани каждого животного. Количество клеток "ежей" подсчитывали отдельно. При оценке повреждающего действия производного бензофурана использован показатель "% ДНК в хвосте"
15. Наличие базы исторических данных, устанавливающей диапазоны распределения отрицательного и положительного контролей		Да
16. Статистический анализ: - для уменьшения эффекта нулевых значений первичные данные трансформируют путем логарифмирования или извлечения квадратного корня и/или добавления ко всем значениям малого числа, например 0,001; - рассчитывают медианное значение для каждого микропрепарата и среднее медианных значений для каждого животного; - выбраны подходящие методы статистической обработки данных, включающие: проверку нормальности распределения данных, проверку однородности дисперсии, сравнение групп отрицательного и положительного контролей, выявление наличия/отсутствия эффекта в группах экспозиции и оценку наличия/отсутствия дозозависимого эффекта		Адекватный: - данные были трансформированы (логарифмирование и прибавление малого числа (0,001) ко всем значениям); - рассчитаны: медианное значение логарифма "% ДНК в хвосте" для каждого микропрепарата и среднее медианных значений для каждого животного; - проверку нормальности распределения данных производили методом Шапиро-Уилка; проверку однородности дисперсии - методом Ливиня; сравнение групп отрицательного и положительного контролей было осуществлено t-тестом Стьюдента для независимых выборок; сравнение эффектов в группах экспозиции с отрицательным контролем осуществляли тестом Даннетта; - оценку наличия зависимости эффекта от дозы производили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена
17. Критерии приемлемости тест-системы: - отрицательный контроль оценивают по процентному содержанию ДНК в хвосте комет клеток животных из группы отрицательного контроля и сравнивают с известными опубликованными данными; - в группе положительного контроля получен ожидаемый высокий процент содержания ДНК в хвосте, статистически значимый по сравнению с отрицательным контролем; - проанализировано достаточное количество клеток (не менее 150 клеток на животное в каждой ткани и не менее 3 доз); - при выборе МПД соблюдены критерии, установленные в соответствии с методиками (методами) (см. п. 2) (для нетоксичных веществ МПД составляет не более 2000 мг/кг МТ)		Выполнены: - среднее значение "% ДНК в хвосте" для костного мозга в группе отрицательного контроля 1,470,45 %; - среднее значение "% ДНК в хвосте" для печени в группе отрицательного контроля 2,311,25 % (значения соответствуют опубликованным данным (костный мозг 3 %, печень 6 %)); - среднее значение "% ДНК в хвосте" комет в группе положительного контроля для костного мозга 21,98,4; для печени - 32,77,4 (статистически значимо выше значения отрицательного контроля); - проанализировано не менее 150 клеток на животное в каждой ткани и 3 дозы; - производное бензофурана, по литературным данным, является малотоксичным, МПД - 2000 мг/кг МТ
18. Критерии определения положительного результата: - как минимум в одной из групп экспозиции наблюдают статистически значимое увеличение показателя повреждения ДНК по сравнению с соответствующим отрицательным контролем; - при анализе зависимости эффекта от дозы подходящим методом найден положительный тренд; - какие-либо результаты выходят за пределы распределения данных исторического отрицательного контроля для данного вида, носителя, пути введения, ткани и количества введений		- ни в одной из групп экспозиции эффект статистически значимо не отличался от значений в сопутствующем отрицательном контроле; - не обнаружено зависимости эффекта от дозы методом ранговой корреляции Спирмена; - все результаты не выходят за пределы распределения данных исторического отрицательного контроля для данного вида, носителя, пути введения, ткани и количества введений
Оценка результатов в тестах in vitro и in vivo
Метод: а) метод оценки обратных генных мутаций на бактериях; б) микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих; в) щелочной анализ ДНК-комет на млекопитающих in vivo		Результат: а) положительный (вещество индуцирует обратные генные мутации); б) отрицательный (вещество не индуцирует образование микроядер); в) отрицательный (не индуцирует разрывы в молекулах ДНК)
Заключение: Представлены необходимые результаты исследований для проведения экспертной оценки генотоксичности пестицида из класса бензофуранов. Исследования проведены с использованием тестов, позволяющих выявлять все основные типы генетических повреждений. Поскольку в тесте in vitro получены положительные отклики, а в микроядерном тесте in vivo - отрицательные, дополнительно были предоставлены результаты 2-го теста in vivo, которые свидетельствуют об отсутствии генотоксичности пестицида из класса бензофуранов в условиях проведенного эксперимента. Таким образом, общее заключение - вещество не является мутагеном

------------------------------

³_{Клетки "ежи" - сильно поврежденные клетки с большими диффузными хвостами, в которых показатель уровня фрагментации ДНК превышает 85 % (% ДНК в хвосте комет 85 %)}

------------------------------