Методические указания МУК 4.1.3776-22 "Методика определения синефрина и октопамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 7 июня 2022 г.)

Методические указания МУК 4.1.3776-22
"Методика определения синефрина и октопамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 7 июня 2022 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (далее - ВЭЖХ-ДМД) и масс-спектрометрическим детектором (далее - ВЭЖХ-МС) для определения массовых концентраций синефрина и октопамина в биологически активных добавках (далее - БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (далее - СПП) в диапазоне от 0,05 до 30,0 мг/г.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Физико-химические свойства синефрина и октопамина

2.1. Рациональные названия: синефрин - ()-(4-[1-гидрокси-2-(метиламино)этил]фенол, октопамин - ()-4-(2-амино-1-гидрокси-этил)фенол (в виде гидрохлорида). Химические названия и химические формулы веществ изображены на рис. 1.

Рис. 1. Структурные формулы синефрина и октопамина

Синефрин и октопамин представляют собой порошки или кристаллы от белого до светло-желтого и от светло-бежевого до бежевого цвета. Свободные октопамин и синефрин малорастворимы в воде, соответствующие гидрохлориды растворимы в воде на уровне 40 - 50 мг/мл. Молярная масса синефрина составляет 167,21 г/моль, октопамина - 153,18 г/моль.

УФ-спектры синефрина и октопамина в метаноле характеризуются максимумами поглощения при длинах волн 226 нм и 276 нм.

Синефрин и октопамин применяются в БАД к пище и СПП для контроля массы тела и улучшения спортивных результатов.

III. Метод измерений

3.1. Методика основана на определении синефрина и октопамина методом ион-парной ОФ ВЭЖХ-ДМД с подтверждением структуры с помощью ВЭЖХ-МС. Подготовка пробы включает в себя экстракцию водно-метанольным раствором. Идентификацию синефрина и октопамина проводят по совпадению времен удерживания, УФ-спектров и данных МС. Количественное определение проводится по данным ВЭЖХ-ДМД методом внешней калибровки.

IV. Метрологические характеристики

4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические характеристики

Анализируемый показатель	Диапазон измеряемых концентраций, мг/г, мг/см 3	Показатель точности (границы относительной погрешности), , % (Р = 0,95)	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости),  r, %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости),  R, %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, % (Р = 0,95)
Октопамин	0,05 - 30,0	15	2,8	5,0	8	14
Синефрин	0,05 - 30,0	15	2,4	5,3	7	15

V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.

Таблица 2

Средства измерений

Наименование средств измерения	Обозначение и наименование документов, технические характеристики
Хроматограф жидкостный с ДМД	Внесено в реестр "Утвержденные типы средств измерений" Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений
Хроматограф жидкостный с МС-детектором	Внесено в реестр "Утвержденные типы средств измерений" Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений
Весы лабораторные аналитические	Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228
Колбы	Тип 2-50-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770
Стаканы	Тип В-1-500 по ГОСТ 25336
Цилиндры	Тип 1-100-1, 1-500-1 по ГОСТ 1770
Пипетки	Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2 и 1-2-2-5 по ГОСТ 29227
Дозаторы медицинские лабораторные	ДПОП-1-100-1000, ДПОП-1-500-5000 по ГОСТ 28311

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Таблица 3

Вспомогательное оборудование и материалы

Наименование вспомогательного оборудования, средств, материалов	Обозначение и наименование документов, технические характеристики
Центрифуга	Для пробирок объемом не менее 1,5 см 3 и относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g
Ультразвуковая водяная баня	Рабочая частота не менее 30 кГц
Пробирки типа "Эппендорф" с герметичной крышкой	Объем 1,5 - 2,0 см 3
Хроматографическая колонка RP-C18 или ODS (с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом)	Линейные размеры 250 мм х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений. устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Таблица 4

Реактивы

Наименование реактивов	Обозначение и наименование документов, технические характеристики
Синефрин, стандарт	Содержание основного вещества не менее 95 %
Октопамина гидрохлорид, стандарт	Содержание основного вещества не менее 95 %
Метанол для ВЭЖХ	Содержание основного вещества не менее 99,9 %
Ацетонитрил для ВЭЖХ	Содержание основного вещества не менее 99,9 %
Вода дистиллированная	ГОСТ Р 58144
Вода для лабораторного анализа	ГОСТ Р 52501
Формиат аммония	Содержание основного вещества не менее 99 %
Гексансульфоновой кислоты натриевая соль	Содержание основного вещества не менее 95 %

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

VI. Требования безопасности проведения измерений и квалификации операторов

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов.

6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методом ВЭЖХ.

VII. Отбор проб

7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб с целью определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

VIII. Условия измерений

8.1. При проведении измерений соблюдаются следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 15 - 30 °C и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

IX. Подготовка к выполнению измерений

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

9.1.1. Приготовление растворов хранения стандартов синефрина и октопамина.

9.1.2. Приготовление раствора хранения стандарта синефрина.

Навеску синефрина (250,2) мг помещают в мерную колбу на 50 см ³, добавляют 40 см ³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 0,5 мг/см ³.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс (4 - 8) °C не более 12 месяцев.

9.1.3. Приготовление раствора хранения стандарта октопамина.

Навеску октопамина гидрохлорида (310,2) мг помещают в мерную колбу на 50 см ³, добавляют 40 см ³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 0,5 мг/см ³.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 12 месяцев.

9.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандартов синефрина и октопамина.

9.2.1. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта синефрина.

Для получения разбавленных градуировочных растворов синефрина с концентрацией 0,001; 0,01; 0,1 мг в см ³ в ряд колб на 50 см ³ помещают 0,1 см ³, 1 см ³ и 10 см ³ раствора хранения стандарта синефрина и доводят объем раствора до 50 см ³ метанолом.

Приготовленные растворы хранят при температуре 4 - 8 °C не более 3 месяцев.

Далее строят график зависимости площадей пиков (S) градуировочных растворов от концентрации синефрина (мг/см ³) А = f (С) по четырем точкам 0,001; 0,01; 0,1; 0,5 мг/см ³. По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание синефрина в пробе.

9.2.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта октопамина.

Для получения разбавленных градуировочных растворов октопамина с концентрацией 0,001; 0,01; 0,1 мг в см ³ в ряд колб на 50 см ³ помещают 0,1 см ³, 1 см ³ и 10 см ³ раствора хранения стандарта октопамина и доводят объем раствора до 50 см ³ метанолом.

Приготовленные растворы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 3 месяцев.

Далее строят график зависимости площадей пиков (S) градуировочных растворов от концентрации октопамина (мг/см ³) А = f (С) по четырем точкам 0,001; 0,01; 0,1; 0,5 мг/см ³. По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание октопамина в пробе.

9.2.3. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание синефрина и октопамина в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,001 до 0,5 мг/см ³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

, где

X - концентрация синефрина или октопамина в пробе при контрольном измерении, мг/см ³;

С - известная концентрация градуировочного раствора синефрина или октопамина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мг/см ³;

В - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (В = 10 % при Р = 0,95).

Если величина расхождения (А) превышает 10 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

9.3. Приготовление подвижной фазы.

9.3.1. Приготовление водного раствора формиата аммония (10 ммоль NH ₄HCO ₂).

Для приготовления раствора формиата аммония NH4HCO2 с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см ³ отмеряют 400 см ³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 315,3 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см ³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.3.2. Приготовление водного раствора формиата аммония (20 ммоль NH ₄HCO ₂) и гексансульфоновой кислоты (5 ммоль).

Для приготовления раствора формиата аммония NH ₄HCO ₂ с концентрацией 20 ммоль и гексансульфоновой кислоты с концентрацией 5 ммоль в стакан объемом 1000 см ³ отмеряют 800 см ³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 1261,2 мг формиата аммония и 941,2 мг натриевой соли гексансульфоновой кислоты. Содержимое переносят в мерную колбу на 1000 см ³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.3.3. Подготовка образцов сухих БАД к пище и СПП к анализу.

Содержимое 5 капсул извлекают из оболочки, 5 таблеток измельчаются в ступке, берется навеска 1 г усредненного образца. Навеску образца помещают в мерную колбу на 50 см ³, добавляют 40 см ³ смеси метанол - вода (50:50). Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 15 мин, затем доводят до метки смесью метанол - вода (50:50), перемешивают. Отбирают 1,5 см ³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ ¹.

------------------------------

¹_{В случае высоких концентраций синефрина из объема  V (50 см3) отбирают 5 см3 аликвоты и разбавляют смесью метанол - вода (50:50) в  N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.}

------------------------------

9.3.4. Подготовка образцов жидких БАД к пище и СПП к анализу.

К 5 см ³ аликвоты образца добавляют 5 см ³ метанола, перемешивают. Отбирают 1,5 см ³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ ².

------------------------------

²_{В случае высоких концентраций синефрина из объема пробы отбирают 5 см3 аликвоты и разбавляют смесью метанол - вода (50:50) в  N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.}

------------------------------

X. Проведение измерений

10.1. Параметры используемых методик.

10.1.1. Условия проведения ион-парной ОФ ВЭЖХ-ДМД.

Условия проведения ОФ ВЭЖХ-ДМД приведены в таблице 5.

Таблица 5

Условия
проведения измерений ВЭЖХ-ДМД

Параметр	Значение
Насос
- Состав подвижной фазы *	А - водный раствор формиата аммония 20 ммоль и гексансульфоновой кислоты 5 ммоль В - ацетонитрил
- Режим элюирования	Градиентное элюирование: 0 мин - 0 % В, 20 мин - 30 % В, 21 мин - 0 % В, 30 мин - 0 % В
- Скорость потока	1,0 см 3/мин
Инжектор
- Объем ввода	0,010 см 3
Термостат колонок
- Температура	40 °C
Детектирование	ДМД при = 224 нм и = 272 нм
Хроматографические характеристики методики
- Примерное время удерживания октопамина, t R - Примерное время удерживания синефрина, t R	12,50,2 мин 13,40,2 мин
Примечание: * При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

10.1.2. Условия проведения ВЭЖХ-МС.

Условия детектирования ВЭЖХ-МС приведены в табл. 6.

Таблица 6

Условия
проведения измерений ВЭЖХ-МС

Параметр	Значение
Насос
- Состав подвижной фазы *	А - водный раствор формиата аммония 10 ммоль В - ацетонитрил
- Режим элюирования	Градиентное элюирование: 0 мин - 10 % В, 13 мин - 20 % В, 15 мин - 20 % В, 16 мин - 10 % В, 20 мин - 10 % В
- Скорость потока	0,5 см 3/мин
Рабочие параметры:
Температура колонки	40 °C
Объем вводимой пробы	0,005 см 3
Сканирование масс
- Источник ионизации	Прогреваемый электроспрей
- Режим ионизации	Регистрация положительных ионов
- Диапазон детектируемых масс веществ	100 - 500 Да
- Детектируемые массы, Да	Синефрин: 168 [М + Н] +, 150 [М - Н 2О + Н] + Октопамин: 154 [М + Н] +, 136 [М - Н 2О + Н] +
- Напряжение на капилляре	3,5 кВ
- Поток газа-осушителя (азот)	10,0 л/мин
- Температура газа	350 °C
Хроматографические характеристики методики
- Примерное время удерживания октопамина, t R - Примерное время удерживания синефрина, t R	7,70,2 мин 8,70,2 мин
Примечание: * При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы и параметров источника ионов с целью обеспечения удовлетворительных разрешения и чувствительности.

10.2. Идентификация синефрина и октопамина.

Идентификацию синефрина и октопамина осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами соответствующих стандартов (рис. 2 - 7).

Рис. 2. УФ-хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина при = 224 нм

Рис. 3. Спектр поглощения синефрина

Рис. 4. Спектр поглощения октопамина

Рис. 5. МС-хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина: вверху - полный ионный ток, внизу - выделенные ионы октопамина m/z 136,16 и синефрина m/z 168,16

Рис. 6. Масс-спектр октопамина

Рис. 7. Масс-спектр синефрина

XI. Обработка результатов измерений

11.1. Расчет содержания синефрина и октопамина в образцах.

Расчет содержания в образце синефрина и октопамина в твердых образцах проводят по формуле:

, где

X - количество синефрина или октопамина в образце, мг/г;

С - концентрация стандарта синефрина или октопамина, найденная по калибровочному графику, мг/см ³;

V - объем раствора пробы, см ³;

N - коэффициент разбавления образца;

m _{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г.

Расчет содержания в образце синефрина и октопамина в жидких образцах проводят по формуле:

, где

X - количество синефрина или октопамина в образце, мг/см ³;

С - концентрация стандарта синефрина или октопамина, найденная по калибровочному графику, мг/см ³;

2 - разведение образца метанолом;

N - коэффициент разбавления образца.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

, где

X ₁, Х ₂ - результаты параллельных определений, мг/г (мг/см ³);

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8· _r.

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r) измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

XIII. Оформление результатов

13.1. Результат анализа представляют в виде:

, мг/г (мг/см ³), при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/г (мг/см ³),

- граница абсолютной погрешности, мг/г (мг/см³);

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/г (мг/см ³)".

XIV. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (1-6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

5. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования (ИСО 835-1-81)".

6. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

7. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия (ИСО 3696)".

8. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

9. ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

10. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

11. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

12. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

13. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".