Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-10-2023 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследования сенсибилизирующего действия" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1090-ст)

Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 10. Sensitization tests

УДК 615.46:002:006.354
МКС 11.100.20

Дата введения - 1 июня 2024 г.
Взамен ГОСТ ISO 10993-10-2011

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Автономной некоммерческой организацией "Институт медико-биологических исследований и технологий" (АНО "ИМБИИТ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 сентября 2023 г. N 165-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1090-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-10-2023 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2024 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 10993-10:2021 "Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследования кожной сенсибилизации" (Biological evaluation of medical devices - Part 10: Tests for skin sensitization, IDT).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Взамен ГОСТ ISO 10993-10-2011

Введение

ISO (Международная организация по стандартизации) является федерацией национальных органов по стандартизации (органов - членов ISO). Работу по подготовке международных стандартов проводят под руководством технических комитетов ISO. Каждая организация-член, заинтересованная в области деятельности, для которой создан технический комитет, имеет право быть представленной в данном комитете. Международные правительственные и неправительственные организации также принимают участие в работе ISO. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по вопросам стандартизации электротехнической продукции.

Процедуры, примененные при разработке настоящего стандарта, а также процедуры, предназначенные для его дальнейшей поддержки, приведены в Директиве ISO/IEC, часть 1. Следует отметить необходимость различных критериев утверждения для различных видов документов ISO. Настоящий стандарт подготовлен в соответствии с редакционными правилами Директив ISO/IEC, часть 2 (www.iso.org/directives).

Следует учитывать, что элементы настоящего стандарта могут быть предметом патентных прав. ISO не несет ответственности за идентификацию таких прав, частично или полностью. Сведения о патентных правах, идентифицированных при разработке настоящего стандарта, указаны во введении и/или в перечне полученных ISO деклараций о патентном праве (см. www.iso.org/patents).

Любая информация о торговой марке продукции, указанной в настоящем стандарте, является информацией, приведенной для удобства пользования.

Разъяснения добровольного характера стандартов, значений конкретных терминов ISO и понятий, связанных с оценкой соответствия, а также информации о соблюдении ISO принципов ВТО по техническим барьерам в торговле (ТВТ), приведены по URL: www.iso.org/iso/foreword.html.

Международный стандарт подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 194 "Биологическая и клиническая оценка медицинских изделий" в сотрудничестве с Техническим комитетом Европейского комитета по стандартизации (CEN) - Комитетом CEN/TC 206, "Биологическая и клиническая оценка медицинских изделий" в соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венское соглашение).

Это пятое издание отменяет и заменяет четвертое издание (ISO 10993-10:2010), которое технически пересмотрено.

Основные изменения по сравнению с предыдущим изданием заключаются в следующем:

- данный стандарт содержит только описание исследования сенсибилизации кожи;

- приложение С о методах сенсибилизации кожи, не связанных с животным (ранее приложение D), дополнено;

- исследование на раздражение приведено в ISO 10993-23.

Перечень всех частей стандартов серии ISO 10993 приведен на официальном сайте ISO.

Отзывы и вопросы по настоящему стандарту должны быть направлены в национальные органы по стандартизации пользователя. Полный список данных органов приводится по адресу: www.iso.org/members.html.

Настоящий стандарт оценивает возможный вред при контакте с химическими веществами, выделяемыми из медицинских изделий (МИ), которые могут привести к кожной сенсибилизации.

Некоторые материалы, включенные в МИ, исследованы, и их потенциал к кожной сенсибилизации зафиксирован. В частности, существуют данные по сенсибилизирующим свойствам стоматологических материалов (см. ссылку [51]). Другие материалы и их химические компоненты не исследованы и могут вызывать нежелательный эффект при контакте с человеком. Таким образом, производитель обязан оценить каждое изделие на предмет потенциальных негативных эффектов перед его реализацией.

Традиционно исследования на мелких животных проводят перед исследованием на человеке, чтобы помочь предсказать ответ человеческого организма (справочная информация приведена в приложении D). С 2015 г. одобрено несколько методов in chemico и in vitro, а также выпущено руководство Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) по оценке потенциала химических веществ к кожной сенсибилизации [75], [79], [104]. Обзор доступных альтернативных методом исследования кожной сенсибилизации приведен в приложении С. Каждый из этих методов, разработанный для конкретного ключевого события, возможно, не будет достаточным для выводов о наличии или отсутствии потенциала химических веществ к кожной сенсибилизации и должен рассматриваться в контексте комплексных подходов, таких как комплексные подходы к исследованиям и оценке (IATA), сочетая их с другой дополнительной информацией. Необходимо обратить внимание на то, что исследования кожной сенсибилизации in vitro и in chemico в приложении С одобрены только для чистых химических веществ, но не для МИ. Для подтверждения применимости МИ для анализа их потенциала к кожной сенсибилизации следует проводить надлежащие оценку и валидацию.

Предварительное использование методов in vitro рекомендовано как скрининг перед исследованиями на животных. Для сокращения числа используемых животных настоящий стандарт представляет поэтапный подход с обзором и анализом результатов исследования на каждой стадии. Предполагается, что для представления в регулирующие органы исследования кожной сенсибилизации должны быть проведены с соблюдением надлежащей лабораторной практики (GLP) или согласно ISO/IEC 17025 с учетом применения в конкретной стране и соответствовать нормам обращения с животными. Рекомендуется использовать метод статистического анализа данных по мере уместности его применения.

Настоящий стандарт включает важные инструменты для разработки безопасных продуктов и предназначен для применения специалистами, имеющими должную подготовку и опыт, способными интерпретировать надлежащим образом требования настоящего стандарта и результаты оценки каждого МИ, принимая во внимание все факторы, относительно рассматриваемого изделия и его целевого использования, обладающими современными знаниями по МИ и осуществляющими обзор научной литературы и анализ предыдущего клинического опыта.

Настоящий стандарт основан на материалах многих стандартов и руководств, включая Руководство ОЭСР, Американскую фармакопею и Европейскую фармакопею, и является основным документом для выбора и проведения исследований, позволяющих оценить реакции кожной сенсибилизации, относящиеся к безопасности медицинских материалов и изделий.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на медицинские изделия (МИ) и материалы, применяемые для их изготовления, и устанавливает требования к проведению исследований сенсибилизирующего действия на кожу.

Настоящий стандарт устанавливает требования:

- к проведению исследований методами in vivo;

- обработке и интерпретации полученных результатов.

Примечание - В приложении А приведены инструкции по подготовке образцов для проведения вышеуказанных исследований.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing within a risk management process (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования в процессе менеджмента рисков)

ISO 10993-2, Biological evaluation of medical devices - Part 2: Animal welfare requirements (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными)

ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices - Part 12: Sample preparation and reference materials (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и контрольные образцы)

ISO 10993-18, Biological evaluation of medical devices - Part 18: Chemical characterization of materials (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 18. Исследование химических свойств материалов)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

ISO и IEC поддерживают терминологическую базу данных, используемую в целях стандартизации по следующим адресам:

- электропедия IEC: доступна по адресу: http://www.electropedia.org/;

- платформа онлайн-просмотра ISO: доступна по адресу: http://www.iso.org/obp.

3.1 аллерген (sensitizer): Химическое вещество или материал, которое(ый) способно(ен) вызывать специфическую реакцию гиперчувствительности при повторном контакте с этим веществом или материалом.

3.2 аллергический контактный дерматит (allergic contact dermatitis): Клинический диагноз, основывающийся на наблюдаемой иммунологически опосредованной кожной реакции на химическое вещество.

3.3 контрольный экстрагент (blank): Экстрагент (3.17), не содержащий исследуемый образец (3.15) и подвергающийся такому же воздействию в идентичной емкости в таких же условиях, как и экстрагент с исследуемой пробой во время экстракции.

Примечание - Контрольный экстрагент предназначен для оценки возможных побочных эффектов, связанных с сосудом для экстракции, с экстрагирующей жидкостью и процессом экстракции.

3.4 провокация (challenge): Процесс, следующий за фазой индукции (3.8), в котором исследуется иммунологический эффект последующего воздействия на организм индуцирующего материала.

3.5 выявление (elicitation): Иммунологическая реакция на воздействие аллергена ранее сенсибилизированного индивидуума.

3.6 эритема (erythema): Покраснение кожи или слизистой оболочки.

3.7 экстракт (extract): Жидкость, полученная в результате экстракции исследуемого образца или контроля.

[ISO 10993-12:2021, 3.6]

3.8 индукция (induction): Процесс, ведущий к появлению de novo повышенной иммунологической активности организма после первоначального воздействия конкретного материала.

3.9 раздражитель (irritant): Агент, вызывающий раздражение (3.10).

3.10 раздражение (irritation): Локализованная неспецифическая воспалительная ответная реакция на однократное, повторное или непрерывное воздействие вещества/материала.

Примечание - Раздражение кожи является обратимой реакцией и, в основном, характеризуется такими симптомами, как местная эритема (3.6) (покраснение), отек, зуд, отслаивание, растрескивание и отшелушивание кожи.

3.11 отрицательный контроль (negative control): Материал и/или вещество с достаточно изученными характеристиками, которые при применении в конкретном методе исследования подтверждают воспроизводимость этого метода и соответствие отрицательного, нереактивного или минимального биологического ответов в тест-системе установленным требованиям.

Примечание - На практике в качестве отрицательного контроля используют контрольный экстрагент (3.3), экстрагент (3.17)/растворители и стандартные образцы.

[ISO 10993-12:2021, 3.10, изменено - Примечание 1 к определению заменено]

3.12 отек (эдема) (oedema): Увеличение объема ткани вследствие абнормальной инфильтрации жидкости.

3.13 положительный контроль (positive control): Материал и/или вещество с достаточно изученными характеристиками, которые при применении в конкретном методе подтверждают воспроизводимость этого метода и соответствие положительного или реактивного биологического ответа в тест-системе установленным требованиям.

3.14 кожная сенсибилизация (skin sensitization): Реакция гиперчувствительности замедленного типа, опосредованная Т-клетками, индуцированная низкомолекулярными химическими веществами (аллергенами), состоящая из двух фаз: индукции и выявления (элиситации).

Примечание - У человека ответная кожная реакция может проявляться как зуд, эритема (3.6), отек (эдема) (3.12), папулы, везикулы, волдыри или их комбинация. У животных реакции могут отличаться и можно увидеть только эритему и эдему.

3.15 исследуемый образец (test material): Материал, изделие, его часть или компонент, которые отбирают для биологического или химического исследования.

3.16 исследуемая проба (test sample): Материал, изделие, его часть, компонент, экстракт (3.7) или его часть, которые подвергают биологическим либо химическим исследованию или оценке.

3.17 экстрагент (vehicle): Жидкость, используемая для смачивания, разбавления, суспензирования, экстрагирования (3.7) или растворения исследуемого вещества/образца.

4 Общие принципы (поэтапный подход)

Доступные методы для исследования сенсибилизации разработаны специально для выявления кожной сенсибилизации. Другие типы неблагоприятных эффектов, как правило, не определяются этими исследованиями.

Настоящий стандарт требует поэтапного подхода, учитывая, что каждый этап может быть подтверждением того, что дальнейшее исследование сенсибилизации кожи не требуется:

a) обзор литературы и информации о поставщиках, содержащий оценку химических и физических свойств, а также информацию о потенциально возможном кожном сенсибилизирующем действии любого компонента МИ либо сходных по структуре химических реагентов или веществ (см. ISO 10993-1); проведение оценки риска на основе существующей информации для определения приемлемости риска кожной сенсибилизации или необходимости дальнейшего исследования;

b) дополнительная характеристика и оценка риска материала изделия по необходимости, включая химическую характеристику и анализ исследуемого образца в соответствии с общими принципами ISO 10993-18;

c) предпочтительность исследований in vitro и in vivo в соответствии с ISO 10993-2 и замена животных по мере появления новых научно подтвержденных и обоснованных, практически доступных методов in vitro.

Примечание - В настоящее время для обнаружения способности химических веществ вызывать кожную сенсибилизацию существует ряд одобренных и признанных на международном уровне методов in vitro; эти методы in vitro пока не одобрены для МИ. Тем не менее ведется работа по одобрению некоторых из этих методов для исследования МИ;

d) проведение исследований in vivo на животных только в тех случаях, когда исследуемые образцы не могут быть охарактеризованы и оценка риска не может быть осуществлена с использованием информации, полученной с помощью средств, описанных в перечислениях а), b) и с).

5 Предварительная оценка

5.1 Общие положения

Необходимо подчеркнуть, что результатом предварительного анализа может быть заключение о нецелесообразности проведения исследований на сенсибилизирующее действие.

Применимы требования, установленные в разделе 5 ISO 10993-1:2018, а также нижеприведенные.

Нестерильные образцы исследуют in vivo только способом аппликации, так как вероятность микробной контаминации исследуемого образца может затруднить интерпретацию результата. В тех случаях, когда стерильность исследуемого образца не может быть гарантирована, но образец тем не менее считают не контаминированным, может быть использовано интрадермальное введение.

5.2 Виды материалов

5.2.1 Первоначальная оценка

Необходимо учитывать, что в процессе изготовления и сборки МИ в качестве технологических веществ могут быть использованы дополнительные химические компоненты, например смазочные материалы или антиадгезивные добавки. Кроме того, в химических компонентах исходного материала и технологических веществ, в конечной продукции могут присутствовать остаточные количества адгезивов, растворителей и стерилизующих агентов, а также продуктов реакции, образующихся в процессе стерилизации. Степень риска при использовании данных компонентов можно определить посредством показателей выщелачивания или деградации готовых изделий. Должны быть идентифицированы те химические компоненты, которые могут вызвать кожную сенсибилизацию.

5.2.2 Керамики, металлы и сплавы

Данные материалы, как правило, менее сложны относительно входящих в их состав химических веществ по сравнению с полимерами и материалами из биотканей.

5.2.3 Полимеры

Как правило, данные материалы имеют более сложный химический состав по сравнению с описанием, приведенным в 5.2.2. Может присутствовать целый ряд реакционно активных продуктов/примесей/добавок/остаточного катализатора; степень или масштаб полимеризации может варьироваться.

5.2.4 Материалы из биологических тканей

Данные материалы сложны по своему составу. Биологические материалы часто содержат остаточные количества технологических веществ (например, сшивающие и антимикробные агенты). Образцы одного биологического материала могут отличаться друг от друга.

Методы, приведенные в настоящем стандарте, разработаны не для исследования биотканей, поэтому их результаты могут быть неадекватными. Например, методы, представленные в настоящем стандарте, не учитывают межвидовой сенсибилизации.

5.3 Информация о химическом составе

5.3.1 Общие положения

Должен быть полностью определен качественный и количественный химический состав материала. Если количественные данные не получены, то обоснование этого должно быть документировано.

5.3.2 Существующие источники данных

Качественная и количественная информация о составе по возможности должна быть получена от поставщика или изготовителя исходного материала.

Для полимеров часто требуется доступ к информации, защищенной правами на интеллектуальную собственность; для этого необходимо положение о передаче и использовании такой конфиденциальной информации.

Качественная информация о добавках, используемых в процессе обработки (например, антиадгезивные добавки), также должна быть получена от компетентных представителей производственной цепочки, включая переработчиков и производителей компонентов.

При отсутствии сведений о составе МИ рекомендуется проведение обзора литературы для установления вероятной природы исходного материала и любых добавок, чтобы помочь в выборе наиболее подходящих методов анализа для исследуемого материала.

Химический состав готовых изделий определяют в соответствии с ISO 10993-18.

Примечание - Состав керамики, металлов и сплавов должен быть указан в соответствии с международными стандартами ISO или ASTM (Американского общества по испытанию материалов) и/или может быть определен пользователем. Однако необходимо получить полные и детальные данные о качественном и количественном составах исходного материала от его поставщика или изготовителя, а также сведения от производителей компонентов о дополнительных веществах, используемых в процессе обработки. При доступности базовые файлы регуляторов также могут быть использованы. Материалы из мастер-файла (досье), хранящиеся в контролирующих органах, являются еще одним источником данных, где они доступны.

6 Методы исследования кожной сенсибилизации

6.1 Выбор методов исследований

Разработаны альтернативные подходы к методам in vitro и химическим методам для чистых химических веществ с использованием комбинации различных проб для идентификации кожных аллергенов. Некоторые из этих методов включены в руководства по исследованиям ОЭСР (TG 442С [75], TG 442D [79] и TG 442Е [104]) или в программу руководства по исследованиям ОЭСР [121] (см. приложение С).

Пробы, описанные в данных руководствах к исследованиям, охватывают три ключевых момента недавно определенного процесса с неблагоприятным исходом (АОР) для сенсибилизации кожи, включая момент молекулярной инициации (связывание белков), индукцию воспаления и активацию дендритных клеток. Эти методы исследования, разработанные для конкретного ключевого момента, по отдельности могут не являться достаточными для выводов о наличии или отсутствии потенциала химических веществ к сенсибилизации кожи и должны быть рассмотрены в контексте интегрированных подходов, таких как IATA, сочетая их с другой дополнительной информацией.

В соответствии с ISO 10993-2 такие интегрированные подходы следует учитывать при оценке способности к кожной сенсибилизации неразбавленных химических веществ. Являются ли такие подходы также применимыми к МИ или к экстрактам из МИ, пока неизвестно. Обзор существующих альтернативных исследований сенсибилизации кожи для неразбавленных химических веществ, представлен в приложении С.

На данный момент доступны три метода для определения сенсибилизирующего действия химических веществ на кожу животных. Они включают два метода на морских свинках и один метод на мышах. Проводят исследования методом максимизации на морских свинках (GPMT) и методом закрытых накожных аппликаций [проба Бюлера (Buehler)], из которых наиболее чувствителен метод максимизации [9]. Метод закрытых накожных аппликаций подходит для продуктов местного применения.

Местная проба на лимфатическом узле мыши (LLNA) является принятым на международном уровне методом, включенным в руководства к исследованию ОЭСР в 2010 г. [33] для испытаний отдельных химических веществ. LLNA является единственным альтернативным методом испытаний на морских свинках и стал предпочтительным методом для исследований химических веществ in vivo (см. [19] и [32]). В некоторых случаях может быть необходимо проведение исследований на морских свинках для оценки сенсибилизирующего действия отдельных исследуемых образцов.

Это относится к тем металлам (см. [44]), которые могут показать ложноположительные результаты, а также к тем веществам с высокой молекулярной массой, которые не проникают через кожу, или к веществам, не растворимым в рекомендуемых экстрагентах.

Примечание - Все три метода на животных разработаны для определения сенсибилизирующего действия химических веществ на кожу, таких как контактный дерматит, гиперчувствительность замедленного (IV) типа.

С учетом требований ISO 10993-2 относительно бережного отношения к животным предпочтительно использовать метод LLNA при проведении пробы in vivo. Кроме того, LLNA по сравнению с другими пробами дает объективные количественные данные.

6.2 Анализ локальных лимфатических узлов на мышах

6.2.1 Принцип

После местной обработки исследуемой пробой тыльной поверхности ушей измеряют степень пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах, дренирующих места нанесения (уши). Увеличение клеточной пролиферации в три раза или более по сравнению с контролем является пороговым критерием для определения исследуемого образца как аллергена.

При исследовании химических веществ необходимо выполнять пробы LLNA с использованием метода "доза-ответ". Для готовых продуктов/МИ может быть достаточным испытать только неразведенный экстракт.

Примечание - Ссылки с [15]-[44] содержат репрезентативные публикации по тесту LLNA. Лабораториям, проводящим пробу, рекомендуется ознакомиться с соответствующими доступными статьями.

6.2.2 Приготовление пробы

Исследуемый образец должен быть жидкостью, суспензией, гелем или пастой, чтобы его можно было нанести на ухо мыши. По возможности должна быть исследована серия доз (разведений). В противном случае следует использовать наивысшую концентрацию, приготовленную как химический раствор, суспензия или экстракт. При обнаружении сильной ответной реакции с экстрактом методом LLNA может потребоваться последующее исследование с различными дозами (разведениями) для того, чтобы оценить способность экстракта вызывать кожную сенсибилизацию. Системная токсичность и чрезмерное местное кожное раздражение могут сделать результаты исследования недействительными; таким образом, следует избегать таких реакций. В определенных случаях может стать необходимым предварительное исследование.

Наиболее часто используемым растворителем для соединений/химических веществ является смесь ацетона с оливковым маслом (АОО) в соотношении 4:1. Жидкие образцы, являющиеся гидрофильными и/или неплотно прилегающими к коже уха, должны быть модифицированы для стойкого контакта к месту испытания. Это достигается добавлением таких загущающих веществ, как карбоксилметилцеллюлоза, или гидроксиэтилцеллюлоза (с плотностью 0,5 %), или поверхностно-активное вещество (сурфактант) Pluronic L92¹⁾ с объемной долей в 1 %. Для водорастворимых химических веществ более предпочтительны диметилсульфоксид (DMSO) или диметилформамид (DMF), чем сурфактант Pluronic L92 [34]. Как альтернативу можно использовать другие экстрагенты [33]. Эффект от введения добавок в экстрагирующую среду и/или изменения состава экстрагента должны быть обоснованы и отражены документально. Для этого следует провести эксперименты с применением веществ от слабого до умеренного сенсибилизирующего действия, также часто используемых как положительные контроле Кроме того, может быть выполнено введение положительного контроля в исследуемый образец с целью демонстрации того, что тест LLNA все еще способен обнаружить присутствие потенциальных кожных сенсибилизаторов в приготовленном экстракте. Методы экстракции описаны в ISO 10993-12.

-----------------------------

¹⁾_{Pluronic L92 является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта.}

-----------------------------

Для каждого ежедневного нанесения необходимо приготовить отдельный экстракт.

Примечание - Возможный метод экстракции для полимеров приведен в приложении В.

6.2.3 Животные и условия содержания

Следует использовать здоровых небеременных самок мышей линий СВА/Са, CBA/J или BALB/c, если не утверждена другая линия [33], [41] и [42]. Другие линии мышей также являются приемлемыми (DBA/2, B6C3F1) [35]. Мыши должны быть в возрасте от 7 до 12 нед; мыши в каждом исследовании должны быть одного возраста (в диапазоне 1 нед).

Содержание и выбор животных должны быть в соответствии с ISO 10993-2. Мыши, акклиматизированные в лаборатории, должны быть индивидуально идентифицированы. Для некоторых исследуемых образцов может потребоваться отдельное размещение. Это должно быть обосновано и отражено документально.

Животные должны быть индивидуально идентифицированы методами, исключающими перфорацию ушей или меток на них.

При групповом размещении необходимо принять во внимание перекрестную контаминацию и употребление нежелательных продуктов.

6.2.4 Процедура исследования

Для химических веществ тест LLNA, как правило, проводят по методу "доза-ответ". Для твердых МИ исследуемые образцы должны быть экстрактами. В этих случаях исследуется единственная доза. Как правило, экстракт можно исследовать неразбавленным. Тем не менее, когда экстракт содержит высокотоксичные компоненты, это может привести к отрицательному результату теста LLNA. Таким образом, при исследовании цитотоксических экстрактов (см. ISO 10993-5) рекомендуется проводить тест LLNA методом "доза-ответ" и с разбавлением экстракта. Дополнительно, при обнаружении внушительного ответа на пробу LLNA возможно проведение последующего ответа на дозу для оценки возможного сенсибилизирующего действия экстракта.

Для обеспечения воспроизводимости и чувствительности исследовательская лаборатория должна включать испытания вещества положительного контроля сенсибилизации кожи для валидации тест-системы и демонстрации положительного ответа. Известные контактные аллергены от слабого до умеренного сенсибилизирующего действия (например, меркаптобензотиазол, гексил коричный альдегид или бензокаин) могут быть использованы в качестве положительного контроля. Приведенные примеры могут не подходить к каждому экстрагенту при приготовлении образца (например, экстрагенту на водной основе). В таких случаях можно выбрать другой положительный контроль. ASTM F2148 указывает на то, что при таких обстоятельствах в качестве положительных контролей следует применять формалин и 2,4-динитрохлорбензол (DNCB). Это должно быть обосновано и отражено документально.

Рекомендуется одновременное включение группы положительного контроля, но возможна ситуация, когда достаточно проведение периодического испытания (т.е. при интервалах 6 мес) исследуемого вещества с положительным контролем. Это относится к лабораториям, которые выполняют тест LLNA регулярно (не менее чем один раз в месяц) и имеют архивную базу данных положительного контроля, демонстрирующую способность лаборатории получать воспроизводимые и точные значения с положительным контролем. Адекватное владение методами LLNA может быть продемонстрировано путем получения последовательных положительных результатов с положительным контролем по крайней мере в 10 независимых исследованиях, проведенных в течение разумного приемлемого периода времени (т.е. менее одного года).

Индивидуальные массы тела должны быть зарегистрированы в начале и в конце исследования. Для выявления потенциальной токсичности исследуемого образца в течение исследования необходимо проводить и регистрировать клиническое наблюдение.

Использование положительного контроля только один раз каждые 6 мес может иметь последствия для результатов, полученных в предыдущий шестимесячный период, если этот положительный контроль показывает отрицательный результат. В [33] отмечается, что периодическое исследование вещества положительного контроля (т.е. при интервалах 6 мес) должно быть выполнено в лабораториях, регулярно проводящих LLNA (не менее одного раза в месяц) и имеющих опыт и документально подтвержденные навыки получения воспроизводимых результатов с положительными контролями. Следует учитывать, что решение проводить положительный контроль только периодически, а не одновременно с испытаниями может вызвать трудности с адекватностью и приемлемостью отрицательных результатов исследования, полученных без одновременного положительного контроля в течение интервала между каждым периодическим исследованием положительного контроля. Например, если при периодическом исследовании положительного контроля получен ложноотрицательный результат, все отрицательные результаты исследуемого вещества, полученные в интервале между последним приемлемым периодическим исследованием положительного контроля и неприемлемым периодическим исследованием положительного контроля, могут быть под вопросом. Для демонстрации того, что предыдущие отрицательные результаты исследуемого вещества приемлемы, от лаборатории может потребоваться повторить проведение всех отрицательных исследований, что вызовет дополнительные расходы и привлечение большего количества животных.

6.2.5 Опытная группа

При проведении LLNA для оценки должны быть доступны данные по меньшей мере пяти мышей на группу. Реакции лимфатических узлов определяют либо индивидуальными измерениями, либо измерением объединенных образцов лимфатических узлов. Для статистического анализа предпочтительнее выполнение индивидуальных измерений.

Когда для оценки доступна только одна доза, например экстракт, для измерения индивидуальных реакций следует использовать минимум пять мышей для каждой группы.

Группы распределяются:

- на группу контроля каждого используемого экстрагента (см. приложение А);

- если применимо, группа положительного контроля для каждого используемого экстрагента;

- опытную группу для каждого экстракта.

При исследовании отдельного химического вещества или соединения LLNA следует проводить методом "доза-ответ". Для других типов испытаний и образцов, таких как экстракты, оценка зависимости дозы от воздействия может оказаться не выполнимой. Использование только одной опытной группы должно быть обосновано и отражено документально.

Примечание - Когда собрано достаточно данных для доказательства постоянства дозового ответа положительного контроля, одна доза может быть включена для демонстрации чувствительности пробы [32].

Соответствующий образец следует наносить на тыльную сторону обоих ушей выбранных мышей в дозе 25 мкл/сут три дня подряд. Каждый день необходимо наблюдать состояние поверхности ушей на предмет признаков раздражения, которые могут помешать интерпретации результатов (см. [23], [27], [29]).

6.2.6 Определение клеточной пролиферации и приготовление образцов тканей

Пролиферирующие клетки в дренирующих ушных лимфатических узлах могут быть помечены либо радиоактивной, либо флуоресцентной меткой. Как правило, используемыми радиометками являются ³Н-метилтимидин и ¹²⁵I-йододеоксиуридин, а для флуоресценции можно использовать флуородеоксиуридин.

Через (72 2) ч после последней обработки места нанесения измеряют массу тела каждой мыши и вводят внутривенно метку для анализа пролиферации клеток. Вводят фосфатно-буферный соляный раствор (PBS) 0,25 мл, содержащий 20 мкКи (740 KBq) единиц радиоактивности ³Н-метилтимидина всем исследуемым и контрольным мышам через хвостовую вену. Для ¹²⁵I-йододеоксиуридина вводят 0,25 мл PBS, содержащего 2 мкКи (74 KBq), а для флуородеоксиуридина - 0,25 мл PBS, содержащего 10^-5 моль/л в хвостовую вену [33].

Доступны и должны быть рассмотрены другие альтернативные процедуры, не требующие радиометок [например, определение аденозинтрифосфатом (АТР) (метод DA) (OECD TG 442А [122]), определение бромодеоксиуридидом BrdU (метод ELISA или FCM) (OECD TG 442В [123]].

Примечание - Для дополнительной информации см. [33], [36], [42], [43] и [49].

Мышей усыпляют через (5 0,75) ч после введения меченого раствора согласно ISO 10993-2. Удаляют ушной дренирующий лимфатический узел. Избегают перекрестной контаминации образцов ткани. Могут быть объединены лимфатические узлы каждой группы или пары лимфатических узлов каждого отдельного животного. Предпочтительно получать данные от каждого индивидуального животного, так как это учитывает их вариабельность между каждым животным в группе. Одноклеточные препараты готовят осторожным продавливанием лимфатических узлов через сетку 200 мкм из нержавеющей стали или нейлона над контейнером. Промывают сито охлажденным PBS в контейнер для удаления клеток из сетчатого фильтра. Таким образом, контейнер содержит препарат клеток. Препараты клеток дважды промывают центрифугированием и ресуспендированием в PBS. Клетки осаждают 5 %-ной трихлоруксусной кислотой (TCA) при температуре (4 2) °С на (18 1) ч. После центрифугирования осадок ресуспендируют в 1 мл TCA и переносят в сцинтилляционные флаконы, содержащие 10 мл сцинтилляционной жидкости для ³Н-подсчета, или на гамма-счетчик для ¹²⁵I-подсчета (см. [21], [35] и [36]).

Примечание - В качестве альтернативы мечение клеток и анализ пролиферации клеток могут проводить ex vivo (см. [37] и [38]).

6.2.7 Результаты и их интерпретация

Измеряют уровень радиоактивности в клетках лимфатических узлов в единицах количества в минуту на мышь (cpm/мышь) с последующим преобразованием количество в минуту (cpm) в распад в минуту (dpm). Вычисляют среднее и стандартное отклонение dpm для по меньшей мере трех показателей для каждого животного или для каждой группы мышей. Из каждого полученного результата следует вычесть значение фоновой величины.

При использовании метода индивидуальной пробы также вычисляют среднее и стандартное отклонения dpm для каждой группы из пяти мышей. Определяют индекс стимуляции (SI) путем деления полученного среднего значения dpm исследования на значения dpm для внутреннего контроля используемого экстрактанта. Значение SI, равное трем или более ( 3,0), считают положительным для определения исследуемого образца как сенсибилизатора (см. ссылку [16]).

Для положительных контрольных образцов значения SI должны более или равны 3,0.

Для достоверного исследования положительный контроль следует проводить либо одновременно, либо в течение предшествующих 6 мес [33].

6.2.8 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать:

a) описание исследуемого материала/ов или изделия;

b) предназначенное использование/применение исследуемого материала или изделия;

c) примененный международный стандарт (включая год его публикации);

d) подробное описание метода, использованного при подготовке исследуемой пробы или исследуемого образца или изделия;

e) описание экспериментальных животных;

f) способ нанесения пробы на уши;

g) описание метода определения клеточной пролиферации;

h) любые отклонения от процедуры;

i) записи наблюдений, включая клинические и массу тела;

j) оценку результатов, включая положительный контроль;

k) дату исследования.

6.3 Исследование на морских свинках для выявления кожной сенсибилизации

6.3.1 Принцип

В настоящее время используют две пробы на морских свинках для определения сенсибилизирующей активности химических веществ и МИ - проба Бюлера (Buehler) и GPMT. Обе пробы состоят из индукционных и провокационных фаз, охватывая тем самым все стадии гиперчувствительности.

6.3.2 Выбор концентраций исследуемой пробы

Данные методы для исследования потенциального сенсибилизирующего действия простых химических веществ рекомендованы только для одного значения концентрации на каждое исследование.

Примечание - Возможный метод экстракции для полимеров приведен в приложении В.

6.3.3 Фаза индукции

Скорость сенсибилизации в большой степени зависит от индукционной дозы, которая в пробах на морских свинках должна по возможности вызывать раздражение от слабого до умеренного. Если порог раздражения кожи не достигнут, то выбирают более высокую концентрацию, которая при этом не должна сказываться на здоровье животного. Индукционную дозу в пробах на морских свинках, как правило, выбирают на основе предварительных экспериментов, как описано в индивидуальных пробах на морских свинках (см. 6.5.4.2). Неразбавленные экстракты на основе стандартных растворителей не нуждаются в предварительных исследованиях.

6.3.4 Фаза провокации

Концентрацию провокационной пробы в исследованиях на морских свинках также определяют в ходе предварительных экспериментов на животных, ранее не подвергавшихся воздействию исследуемого материала. Следует использовать наивысшую нераздражающую дозу, определенную предварительными оценками. Рекомендуется применять более чем одну концентрацию для провокационной пробы для того, чтобы упростить оценку результатов.

6.4 Важные факторы, влияющие на результат исследования

Биохимические и физические характеристики исследуемой пробы могут повлиять на выбор исследования, так как метод максимального воздействия требует внутрикожного введения. Если исследуемую пробу не допускается вводить внутрикожно, то необходимо использовать альтернативный метод (т.е. местное нанесение). Экстракты следует подготавливать в асептических условиях. Нестерильные пробы должны быть исследованы только местным нанесением, так как вероятность микробной контаминации исследуемой пробы может затруднить интерпретацию результатов. В тех случаях, когда стерильность исследуемой пробы не может быть гарантирована, но пробу считают неконтаминированной, может быть обосновано внутрикожное введение.

Выбор экстрагента влияет на биодоступность исследуемого образца. Хотя не существует оптимального экстрагента для всех материалов, следует выбирать экстрагент, который оптимизирует экстракцию за счет растворимости и проникновения. Концентрация исследуемой пробы должна быть максимально возможной, но не оказывать влияния на интерпретацию результатов. Большинство исследователей предпочитает исследуемую пробу в виде раствора, потому что дисперсии склонны к образованию осадка, что затрудняет точное дозирование. Примерами экстрагента для внутрикожной инъекции служат солевой раствор, пропиленгликоль и растительное масло.

Расхождение в результатах, полученных разными лабораториями, возможно по нескольким причинам. Следующие факторы являются существенными в процедуре испытаний:

- условия окружающей среды;

- место воздействия на животном;

- метод удаления волос (стрижка/бритье или химическая депиляция);

- тип конструкции подушечки;

- количество исследуемого образца;

- уровень окклюзии;

- время экспозиции и осмотр животных.

Реактивность животных также изменяется в зависимости от генетических факторов и условий содержания.

Сравнение количества подопытных животных с положительной реакцией на провокацию с животными соответствующих контрольных групп является ключевым для указания на положительный результат исследования, при этом степень реакции помогает интерпретировать результаты. Пограничные реакции на провокацию более всего разрешаются повторным исследованием. Гистопатологические исследования, как показано, не помогают в оценке результатов.

Чтобы гарантировать воспроизводимость и чувствительность, испытательная лаборатория должна также исследовать вещества положительного контроля для валидации тест-системы и демонстрации положительного ответа. Предпочтительно, чтобы положительные контроли являлись контактными аллергенами в диапазоне от слабого до умеренного (например, меркаптобензотиазол, гексилкоричный альдегид и бензокаин). Тем не менее при демонстрации стабильности в течение продолжительного периода 6 мес или более необязательно включать положительный контроль в каждую пробу, а можно проводить его с регулярными интервалами, не превышающими 6 мес. В исследованиях на морских свинках в группе положительного контроля, как правило, используют десять животных. Возможно использование меньшего количества животных, если исследование с веществом положительного контроля проводится чаще чем один раз в каждые 6 мес. Следует использовать по меньшей мере пять подопытных животных с положительным веществом и пять контрольных животных [1].

Примечание - Для получения положительного ответа можно использовать растворы аллергенов, от умеренных до сильных [например, формальдегид и динитрохлорбензол (DNCB)]. Тем не менее это не гарантирует, что анализ может идентифицировать ответные реакции на слабые аллергены в экстрактах из МИ.

6.5 Метод максимизации на морских свинках

6.5.1 Принцип

Проводят оценку потенциальной способности исследуемого образца вызывать кожную сенсибилизацию на морских свинках, используя метод максимального сенсибилизирующего воздействия на морских свинках, применяемый для однокомпонентных химических веществ.

6.5.2 Приготовление исследуемой пробы

Исследуемую пробу готовят в соответствии с приложением А. Концентрация исследуемой пробы должна быть максимально возможной, но не влиять на интерпретацию результатов (см. 6.5.4.2).

Примечание - Возможный метод экстракции для полимеров приведен в приложении В.

6.5.3 Животные и условия их содержания

Следует использовать здоровых молодых половозрелых морских свинок-альбиносов одной аутбредной линии, любого пола, массой 300-500 г до начала исследования. Если используют самок, то они должны быть не рожавшими и не беременными.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2. Предварительные исследования, по необходимости, должны быть выполнены на одной группе животных для определения оптимальных концентраций для исследования (см. 6.5.4.2).

Для исследования порошкообразных или жидких материалов не менее 10 животных должны быть обработаны исследуемой пробой и не менее пяти животных должны быть в контрольной группе. При необходимости для предварительных исследований используют дополнительное количество животных.

При исследовании экстрактов также используют не менее 10 животных для каждого экстракта, и не менее пяти морских свинок в группе для контрольного раствора. При необходимости предварительных исследований используют дополнительное количество животных.

Если исследование на 10 опытных и пяти контрольных животных дает полностью отрицательные результаты, то маловероятно, что дальнейшее исследование на еще 10 опытных и пяти контрольных животных приведет к положительным результатам. Однако при развитии каких-либо сомнительных реакций необходимо провести повторную провокацию (см. 6.5.6). Если сомнительные реакции остаются, то проводят новое исследование по меньшей мере на 20 опытных и 10 контрольных животных.

6.5.4 Процедура исследования

6.5.4.1 Подготовка

До начала исследования шерсть на участках нанесения исследуемой пробы на кожу тщательно выстригают.

6.5.4.2 Предварительные исследования

Предварительные исследования предназначены для того, чтобы определить концентрацию пробы, которая будет использована в основном исследовании (см. 6.5.4.3).

Неразведенные экстракты при использовании стандартных растворителей (например, физиологический раствор или растительное масло) не требуют предварительного исследования.

Для местного нанесения пропитывают подходящую фильтровальную бумагу, или впитывающую марлевую подушечку (от 4 до 8 см²), или камеру с исследуемым образцом и накладывают подушечку на выстриженный участок кожи под окклюзионной повязкой, закрепленной бинтом или попонкой и обернутой вокруг туловища животного.

При обертывании животного для фиксации окклюзионной повязки необходимо убедиться в том, что она не препятствует нормальному дыханию животного. Предпочтительно адаптивное обертывание, которое должен делать специально обученный персонал.

Местно наносят различные разведения исследуемой пробы на бока по меньшей мере двух животных. Через 24 ч удаляют окклюзионные повязки и подушечки, оценивают состояние участков нанесения на наличие эритемы и отека, используя шкалу оценки Магнуссона и Клигмана, приведенную в таблице 1. Также возможно исследование растворения объекта внутрикожной инъекцией при использовании нетрадиционных растворителей.

Возможно разбавление пробы для внутрикожной инъекции с использованием нестандартных растворителей.

Для местной фазы индукции в основном исследовании выбирают наиболее высокую концентрацию, которая вызывает эритему от слабой до умеренной и не оказывает общего отрицательного воздействия на животных в соответствии с ISO 10993-2. Необходимо помнить, что для экстрактов из МИ может быть не получен порог раздражения. В таких случаях необходимо использовать наивысшую возможную концентрацию, например неразведенный экстракт. Для конечных продуктов/МИ достаточно исследовать только неразведенный экстракт.

Для провокационной фазы в основном тесте выбирают наивысшую концентрацию, которая не вызывает эритемы (см. таблицу 1).

Таблица 1 - Шкала Магнуссона - Клигмана

Реакция на аппликацию подушечки	Шкала оценки, баллы
Отсутствие видимых изменений	0
Дискретная или фрагментарная эритема	1
Умеренная и сплошная эритема	2
Интенсивная эритема и/или отек	3

Должно быть рассмотрено предварительное введение полного адъюванта Фрейнда (FCA) всем животным.

6.5.4.3 Основное исследование

6.5.4.3.1 Внутрикожная индукционная фаза

Каждому животному в выстриженные внутрилопаточные участки кожи (А, В и С) в соответствии с рисунком 1 проводят парные внутрикожные инъекции в объеме 0,1 мл каждого из нижеперечисленного:

- участок А: смесь стабильной эмульсии полного адъюванта Фрейнда с выбранным растворителем в соотношении V/V = 50/50. Применяют физиологический раствор (BP, USP или эквивалентный) или экстрагирующую жидкость/растворитель;

- участок В: исследуемый образец (неразведенный экстракт); контрольным животным вводят только экстрагент/растворитель;

- участок С: исследуемая проба в концентрации, выбранной для участка В, эмульгированная со стабильной эмульсией полного адъюванта Фрейнда и экстрагирующей жидкостью/растворителя (раствор, примененный на участке А) в соотношении V/V = 50/50; контрольным животным вводят эмульсию экстрагирующей жидкости/растворителя с адъювантом (контроль экстрагента).

6.5.4.3.2 Местная индукционная фаза

Через (7 1) сут после внутрикожной индукционной фазы начинают накожные аппликации исследуемой пробы на внутрилопаточную область каждого животного, используя подушечку площадью примерно 8 см² (фильтровальная бумага или марля), чтобы покрыть участки внутрикожной инъекции (см. рисунок 1). При этом используют концентрацию, выбранную в процессе предварительного исследования при местном нанесении (если проводили, см. 6.5.4.3.1). Если максимальная концентрация, которая может быть достигнута в 6.5.4.3.1, не вызывает раздражения, то предварительно обрабатывают область аппликации 10 %-ным раствором натрия додецилсульфата (SDS), втерев его в кожу за (24 2) ч до аппликации. Какие-либо остатки SDS должны быть удалены до нанесения подушечек для местной индукционной фазы, так как оставшийся SDS может повлиять на абсорбцию экстракта. Фиксируют подушечки окклюзионной повязкой. Удаляют повязку и подушечки через (48 2) ч.

Предпочтительны свежеприготовленные экстракты. Если экстракты хранят более чем (24 2) ч, то их стабильность должна быть проверена.

Процедуру с контрольными животными повторяют в том же режиме, используя только контрольную экстрагирующую жидкость.

1 - голова; 2 - 0,1 мл внутрикожных инъекций (см. 6.5.4.3.1); 3 - выстриженная внутрилопаточная область; 4 - хвост; А, В, С - участки инъекции

Рисунок 1 - Расположение участков внутрикожной инъекции

6.5.4.3.3 Провокационная фаза

Для исследования провокационной фазы необходимо следовать процедуре, описанной ниже:

a) всех подопытных и контрольных животных провоцируют через (14 1) сут после завершения местной индукционной фазы;

b) для неразбавленных исследуемых экстрактов с использованием стандартных растворителей (например, физиологический раствор или растительное масло):

1) как подопытных, так и контрольных животных обрабатывают исследуемыми и контрольными экстрактами или

2) контрольных животных обрабатывают неразбавленной экстрагирующей жидкостью, а опытных животных - неразбавленным исследуемым экстрактом.

Для провокационной фазы рекомендуется применение наивысшей нераздражающей концентрации исследуемой пробы. Для исследования с экстрактами из МИ предварительное исследование для определения наивысшей не раздражающей концентрации экстрактов, как правило, не проводят. Неразбавленные экстракты с использованием стандартных растворителей, как правило, не подвергают предварительному исследованию.

Применение варианта по перечислению b), 1) позволяет определить, появляется ли какая-либо кожная реакция у опытных животных из-за раздражения, а не из-за сенсибилизации. Согласно варианту по перечислению b), 1) на опытных и контрольных животных воздействуют исследуемым и контрольным экстрактами. Если наблюдаются какие-либо кожные реакции на исследуемые экстракты у контрольных животных, то реакция может быть вызвана раздражением, а не сенсибилизацией, так как контрольные животные прежде не подвергались воздействию исследуемых экстрактов.

Согласно варианту по перечислению b), 2) на контрольных животных не воздействуют испытуемым экстрактом, а на опытных животных контрольным экстрактом. В случае кожных реакций, наблюдаемых у опытных животных, с которыми не проводили предварительное исследование, для определения наивысшей концентрации экстрактов, не вызывающей раздражение, может понадобиться дополнительное исследование для исключения ложноположительного результата;

c) при использовании нестандартных растворителей на всех опытных и контрольных животных должно быть оказано воздействие исследуемыми контрольными экстрактами;

d) экстракты следует наносить местно на выбритые участки кожи, которые не были обработаны на стадии индукции, такие как верхняя часть бока каждого животного, с использованием соответствующих накладок или камер, пропитанных исследуемой пробой при концентрации, выбранной в 6.5.4.3.1 для участка В (см. рисунок 1). Если концентрация, выбранная в 6.5.4.3.1 для участка В, не является наивысшей нераздражающей концентрацией, то необходимо использовать наивысшую нераздражающую концентрацию, определенную при предварительном исследовании (см. 6.5.4.2). Объем экстракта, используемый для пропитывания подушечек/камер, должен быть указан и обоснован;

e) подушечки/камеры должны быть зафиксированы окклюзионной повязкой;

f) повязку и подушечку удаляют через (24 2) ч.

6.5.5 Наблюдение за животными

Осматривают поверхность тех участков, которые проводили провокационную пробу опытных и контрольных животных, через (24 2), (48 2) ч после снятия повязки. Для визуализации реакций кожи рекомендуется использовать естественное или искусственное освещение с полным спектром. Описывают и оценивают степень кожной реакции, включая эритему и отек, в соответствии со шкалой Магнуссона - Клигмана, приведенной в таблице 1, для каждого участка и в каждый интервал времени наблюдения. Настоятельно рекомендуется, чтобы описание было сделано без информации о виде обработки для исключения предвзятости в оценке результатов.

Стрижку и бритье следует проводить перед каждым шагом в процедуре исследования (см. 6.5.4.1). Тем не менее повторное бритье может быть необязательным после провокационной или повторной провокационной пробы, если животное брили за сутки до этого.

6.5.6 Оценка результатов

Если оценка в баллах по шкале Магнуссона - Клигмана, полученная в опытной группе, равна 1 или выше, то наличие сенсибилизации подтверждают в том случае, если у контрольных животных этот показатель менее 1 балла. Если оценка в баллаху контрольных животных равна 1 или выше, то реакция кожи опытных животных, которая превышает наиболее сильную реакцию, наблюдаемую в контроле, является результатом сенсибилизации. Если реакция сомнительная, то рекомендуется дополнительная провокационная проба для подтверждения результатов первой провокационной пробы. Результат исследования может быть представлен в качестве положительных результатов провокационной пробы в опытной и контрольной группах.

Иногда в опытной группе у большего, чем в контроле, количества животных выявляется ответная реакция, однако интенсивность реакции не выше, чем у контрольных животных. В этом случае проводят дополнительную провокационную пробу для получения более четкого ответа организма. При необходимости дополнительную провокационную пробу проводят в срок от 1 до 2 нед после первой провокации. При этом применяют описанный выше метод, используя другой бок животного.

6.5.7 Отчет об исследовании

Отчет должен включать следующую информацию:

a) описание исследуемого(ых) образца(ов) или изделия;

b) предназначенное использование/применение исследуемой пробы или образца;

c) примененный международный стандарт (включая год его публикации);

d) подробное описание метода, использованного при подготовке испытуемой пробы или исследуемого образца или изделия;

e) описание экспериментальных животных;

f) способ нанесения на опытные участки кожи;

g) любые отклонения от процедуры;

h) маркировку опытных участков кожи и их описание;

i) данные наблюдений;

j) оценку результатов;

k) дату исследования.

6.6 Метод закрытого участка [проба Бюлера (Buehler)]

6.6.1 Принцип

Оценивают потенциальную способность исследуемого материала вызывать кожную сенсибилизацию на морских свинках.

6.6.2 Приготовление исследуемой пробы

Исследуемая проба должна быть приготовлена, как изложено в приложении А. Концентрация исследуемой пробы должна быть по возможности наивысшей, но без влияния на интерпретацию результатов (см. 6.6.4.2). Если позволяют форма и размер, то устройства для местного применения (например, электроды) могут быть использованы без приготовления пробы.

6.6.3 Животные и условия содержания

Следует использовать здоровых молодых половозрелых морских свинок-альбиносов любого пола одной аутбредной линии массой 300-500 г до начала исследования. Если используют самок, то они должны быть не рожавшими и не беременными.

Акклиматизацию и содержание животных осуществляют в соответствии с ISO 10993-2. Предварительные исследования должны быть выполнены на одной группе животных, чтобы определить оптимальные концентрации исследуемой пробы (см. 6.5.4.2).

Для исследования порошкообразных или жидких материалов используют не менее 10 животных на каждый исследуемый образец и не менее пяти животных составляют контрольную группу. Дополнительное число животных используют для проведения предварительных исследований.

При исследовании экстрактов также используют не менее 10 животных для каждого экстракта и не менее пяти морских свинок составляют контрольную группу для каждого растворителя. Дополнительное число животных используют для предварительных исследований.

Если исследование на 10 экспериментальных и пяти контрольных животных полностью отрицательное, то маловероятно, что дальнейшее исследование на 10 экспериментальных и пяти контрольных животных даст положительные результаты. Однако, если проявятся какие-нибудь неоднозначные реакции, должна быть выполнена повторная провокация (см. 6.5.6). Если сомнительные реакции остаются, то проводят новое исследование не менее чем на 20 опытных и 10 контрольных животных.

6.6.4 Процедура исследования

6.6.4.1 Подготовка

Тщательно выстригают или сбривают шерсть на всех участках нанесения перед всеми этапами тестирования.

6.6.4.2 Предварительные исследования

Предварительные исследования проводят для того, чтобы определить концентрацию исследуемой пробы, которая будет использована в основном исследовании в соответствии с 6.6.4.3.

МИ, предназначенные для местного использования, и неразведенные экстракты, полученные при использовании обычных растворителей, не требуют предварительного исследования.

Для местного нанесения пропитывают исследуемой пробой или экстрактом фильтровальную бумагу или гигроскопичную марлевую подушечку соответствующих размеров, прикладывают ее к выстриженному участку и фиксируют окклюзионной повязкой на (6 0,5) ч. Чтобы обеспечить плотное прилегание исследуемой пробы к коже, животное рекомендуется фиксировать. Если используют обертывание, то его адекватность должна быть оценена в каждом эксперименте. Описывают и оценивают степень кожной реакции, включая эритему и отек, в соответствии с таблицей 1 (по классификации Магнуссона - Клигмана) для каждого участка через (24 2) и (48 2) ч после удаления повязки.

Местно наносят четыре концентрации исследуемой пробы на боковую поверхность тела по меньшей мере двух животных, используя соответствующие аппликации, и фиксируют окклюзионной повязкой на (6 0,5) ч. Описывают и оценивают степень кожной реакции, включая эритему и отек, в соответствии с таблицей 1 (по классификации Магнуссона - Клигмана) для каждого участка через (24 2) и (48 2) ч после удаления повязки.

Выбирают:

a) для индукционной фазы в основном исследовании наивысшую концентрацию, которая вызывает незначительную эритему, но не оказывает общего отрицательного влияния на организм животного;

b) для провокационной фазы в основном исследовании наивысшую концентрацию, которая не вызывает эритемы.

6.6.4.3 Основное исследование

6.6.4.3.1 Индукционная фаза

Локально наносят исследуемый образец на выстриженную область левой верхней части спины каждого животного, используя соответствующие аппликации, пропитанные в исследуемой пробе, при концентрации раствора, выбранной по перечислению а) 6.6.4.2. Удаляют фиксирующие приспособления и повязку через (6 0,5) ч. Повторяют эту процедуру последовательно три дня в неделю в течение 3 нед. Контрольным животным проводят все процедуры в том же режиме, используя при этом только контроль экстрагирующей жидкости.

6.6.4.3.2 Провокационная фаза

Провокационную пробу проводят через (14 1) сут после последней индукционной аппликации на опытных и контрольных животных. Провокационную пробу проводят способом однократной местной аппликации на выстриженный опытный участок кожи каждого животного, используя соответствующую исследуемую пробу в концентрации, выбранной по перечислению b) 6.6.4.2. Удаляют фиксирующие приспособления и повязку через (6 0,5) ч.

6.6.5 Наблюдение за животными

При необходимости, через (24 2) ч после первой или второй провокационной пробы проводят либо:

a) удаление шерсти у всех животных на опытных участках и окружающей их коже с помощью коммерчески доступного депилятора в соответствии с прилагаемой к нему инструкцией или

b) выбривание шерсти у всех животных на опытных участках и окружающей их коже.

Тщательно промывают депилированный участок теплой водой и вытирают животных полотенцем перед их возвращением в клетки.

Через (24 2) ч после удаления провокационных накладок и не менее чем через 2 ч после описанной выше процедуры удаления шерсти оценивают состояние опытных участков кожи в соответствии с таблицей 1. Осмотр повторяют через (48 2) ч после провокационного воздействия. Для визуализации реакций кожи рекомендуется использовать естественное или искусственное освещение с полным спектром. Чтобы исключить предвзятость в оценке результатов, рекомендуется исключить информацию о проведенных процедурах.

6.6.6 Оценка результатов

Должна быть применена шкала оценок Магнуссона - Клигмана, приведенная в таблице 1.

Если оценка в баллах, полученная в опытной группе, равна 1 или выше, то о наличии сенсибилизации говорят в том случае, если у контрольных животных этот показатель менее 1 балла. Если оценка в баллах у контрольных животных равна 1 или выше, то реакция кожи опытных животных, которая превышает наиболее сильную реакцию, наблюдаемую в контроле, является результатом сенсибилизации. Для подтверждения результатов первой провокационной пробы рекомендуют дополнительную провокационную пробу. Результат испытания может быть представлен в качестве частоты положительных результатов провокационной пробы в опытной и контрольной группах.

Рекомендуется использовать новую отрицательную контрольную группу.

6.6.7 Отчет об исследовании

В отчет об исследовании включают следующую информацию:

a) описание исследуемого(ых) образца(ов) или изделия;

b) примененный международный стандарт (включая год его публикации);

c) предназначенное использование/применение исследуемого(ых) образца(ов) или изделия;

d) подробное описание метода, использованного при подготовке исследуемой пробы или образца;

e) описание экспериментальных животных;

f) способ нанесения на опытные участки кожи;

g) любые отклонения от процедуры;

h) маркировку опытных участков кожи и их описание;

i) данные наблюдений;

j) оценку результатов, включая статистические методы;

k) дату исследования.

7 Ключевые факторы в интерпретации результатов испытаний

Методы, включенные в настоящий стандарт, являются значимым инструментом при разработке безопасной продукции и должны быть выполнены в соответствии с надлежащими мерами контроля качества (например, ISO/IEC 17025 или GLP) при условии, что их выполняет и интерпретирует обученный персонал. Необходимо предоставить доказательства того, что люди, планирующие, проводящие и оценивающие результаты исследований, имеют соответствующую квалификацию путем подготовки и опыта к таким заданиям.

Обнаруженное любым из методов сенсибилизирующее действие не является причиной невозможности применения данного материала или изделия, так как объем образца при проведении исследований может существенно превышать объем, используемый в реальных условиях. Установленный любым утвержденным методом отрицательный эффект свидетельствует о необходимости дальнейшего анализа, что позволит оценить риск при воздействии на человека.

Прогнозирующие результаты исследований, полученные при процедурах, описанных в настоящем стандарте, не могут быть использованы сами по себе и должны быть интерпретированы вместе с другой информацией для оценки риска реакции гиперчувствительности или других форм иммунотоксичности. Отрицательный результат не всегда исключает возможность того, что продукция может вызывать аллергическую реакцию кожи. Для обоснования результата его необходимо проверить, используя другие источники информации, такие как:

- претензии со стороны изготовителя и покупателя;

- опыт работы с изделиями, содержащими сходные составляющие;

- результаты диагностических проб в дерматологических клиниках;

- ретроспективные эпидемиологические данные.

Библиография

Общие ссылки для исследований кожной сенсибилизации

[1]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), Guidelines for the testing of chemicals No. 406, Skin sensitization, OECD Publications, 1992
[2]	de Silva O., Basketter D.A., Barratt M.D. et al. Alternative methods for skin sensitization testing, The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 19, ATLA, 24, pp. 683-705, 1996
[3]	MHLW Notification by Director, MDED, Yakuseikishin-hatsu 0106 No.1, Jan. 6, 2020. Amendment of Basic Principles of Biological Safety Evaluation Required for Application for Approval to Market Medical Devices
[4]	Japanese Guidelines of Basic Biological Tests of Medical Materials and Devices, 1995

Библиография для исследований кожной сенсибилизации

[5]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins, OECD Series on Testing and Assessment, n° 168, Editions OCDE, Paris, 2014, https://doi.org/10.1787/9789264221444-en
[6]	Andersen K.E., Vlund A. Frankild S. The guinea pig maximization test with a multiple dose design, Acta Derm. Venereol., 75, pp. 463-469, 1995
[7]	Buehler E.V. Delayed contact hypersensitivity in the guinea pig, Arch. Dermatol., 91, pp. 171-175, 1965
[8]	European Chemical Industry Ecology and Toxicology Centre Skin sensitization testing for the purpose of hazard identification and risk assessment, Monograph 29, Brussels, Belgium, 2000
[9]	Frankild S., Vlund A., Wahlberg J.E. et al. Comparison of the sensitivities of the Buehler test and the guinea pig maximization test for predictive testing of contact allergy, Acta Derm. Venereol., 80, pp. 256-262, 2000
[10]	Kaniwa M.A., Momma J., Ikarashi Y. et al. A method for identifying causative chemicals of allergic contact dermatitis using a combination of chemical analysis and patch testing in patients and animal groups: application to a case of rubber boot dermatitis, Contact Dermatitis, 27, pp. 166-173, 1992
[11]	Kojima S., Momma J., Kaniwa M.A. Phosgene (chlorophenyl) hydrazones, strong sensitizers found in yellow sweaters bleached with sodium hypochlorite, defined as causative allergens for contact dermatitis by an experimental screening method in animals, Contact Dermatitis, 23, pp. 129-141, 1990 [published erratum appears in Contact Dermatitis, 23, p. 383]
[12]	Landsteiner K., Chase M.W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds, J. Exp. Med., 69, p. 767, 1939
[13]	Magnusson В., Kligman A.M. The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test, J. Invest. Dermatol., 52, pp. 268-276, 1969
[14]	Nakamura A., Momma J., Sekignchi H. et al. A new protocol and criteria for quantitative determination of sensitization potencies of chemicals by guinea pig maximization test, Contact Dermatitis, 31, pp. 72-85, 1994

Библиография для LLNA

[15]	Albers R., Breeders A., Van Der Pijl A. et al. The use of reporter antigens in the popliteal lymph node assay to assess immonomodulation by chemicals, Toxicol. Appl. Pharmacol., 143, pp. 102-109, 1997
[16]	Basketter D.A., Lea L.J., Cooper K. et al. Threshold for classification as a skin sensitizer in the local lymph node assay: a statistical evaluation, Food. Chem. Toxicol., 37, pp. 1167-1174, 1999
[17]	Basketter D.A., Roberts D.W., Cronin M. et al. The value of the local lymph node assay in quantitative structure-activity investigations, Contact Dermatitis, 27, pp. 137-142, 1992
[18]	Basketter D.A., Scholes E.W., Kimber I. The performance of the local lymph node assay with chemicals identified as contact allergens in the human maximization test, Food. Chem. Toxicol., 32, pp. 543-547, 1994
[19]	De Bakker J.M., Kammiiller M.E., Muller E.S.M. et al. Kinetics and morphology of chemically induced popliteal lymph node reactions compared with antigen-mitogen-, and graft-versus-hostreaction-induced-responses, Virchows Archiv. В Cell Pathol., 58, pp. 279-287, 1990
[20]	Dean J., Twerdok L.E., Andersen K.E. et al. The murine local lymph node assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds, NIH publication No. 99-494, Research Triangle Park, 1999, available at https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/ docs/immunotox docs/llna/llnarep.pdf
[21]	Dearman R.J., Basketter D.A., Kimber I. Local lymph node assay: use in hazard and risk assessment, J. Appl. toxicol., 19, pp. 299-306, 1999
[22]	Descotes J., Patriarca C., Vial T. et al. The popliteal lymph node assay in 1996, Toxicol., 119, pp. 45-49, 1997
[23]	Gerberick G.F., Gruse L.W., Ryan C.A. Local lymph node assay: differentiating allergic and irritant responses using flow cytometry, Methods, 19, pp. 48-55, 1999(a)
[24]	Gerberick G.F., Gruse L.W., Miller C.M. et al. Selective modulation of B-cell activation markers CD86 and I-AK on murine draining lymph node cells following allergen or irritant treatment, Toxicol. Appl. Pharmacol, 159, pp. 142-151, 1999(b)
[25]	Ikarashi Y., Tsuchiya Т., Nakamura A. A sensitive mouse lymph node assay with two application phases for detection of contact allergens, Arch. Toxicol., 67, pp. 629-636, 1993
[26]	Kimber I., Hilton J., Dearman R.J. et al. An international evaluation of the murine local lymph node assay and comparison of modified procedures, Toxicol., 103, pp. 63-73, 1995
[27]	Lea L.J., Warbrick E.V., Dearman R.J. et al. The impact of vehicle on assessment of relative skin sensitization potency or 1,4-dihydroquinone in the local lymph node assay, Am. J. Contact Dermatitis, 10, pp. 213-218, 1999
[28]	Loveless S.E., Ladies G.S., Gerberick G.F. et al. Further evaluation of the local lymph node assay in the final phase of an international collaborative trial, Toxicol., 108, pp. 141-52, 1996
[29]	Montelius J., Wahlkvist H., Boman A. et al. Experience with the murine local lymph node assay: inability to discriminate between allergens and irritants, Acta Derm. Venereol., 74, pp. 22-27, 1994
[30]	Roberts D.W. Structure-activity relationships of skin sensitization potential of diacrylates and dimethacrylates, Contact Dermatitis, 17, pp. 281-289, 1987
[31]	Vial Т., Carleer J., Legrain B. et al. The popliteal lymph node assay: results of a preliminary interlaboratory validation study, Toxicol., 122, pp. 213-218, 1997
[32]	Warbrick E.V., Dearman R.J., Lea L.J. et al. Local lymph node assay responses to paraphenylenediamine: intra- and inter-laboratory evaluations, J. Appl. Toxicol., 19, pp. 225-260, 1999
[33]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), Guideline for the testing of chemicals No. 429, Skin sensitisation: Local lymph node assay, OECD Publications, 2010
[34]	Ryan C.A., Cruse L.W., Skinner R.A. et al. Examination of a vehicle for use with water soluble materials in the murine local lymph node assay, Food Chem Toxicol., 40, pp. 1719-1725, 2002
[35]	Woolhiser M.R., Munson A.E., Meade B.J. Comparison of mouse strains using the local lymph node assay, Toxicology 146, pp. 221-227, 2000
[36]	Takeyoshi M., Noda S., Yamasaki K. et al. Advantage of using CBA/N strain mice in a nonradioisotopic modification of the local lymph node assay, J. Appl. Toxicol., 26, pp. 5-9, 2006
[37]	Van Och F.M.M., Slob W., De Jong W.H. et al. A quantitative method for assessing the sensitizing potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of the uncertainty margins, Toxicology, 146, pp. 49-59, 2000
[38]	De Jong W.H., Van Och F.M.M., Den Hartog Jager C.F. et al. Ranking of allergenic potency of rubber chemicals in a modified local lymph node assay, Toxicol. Sc., 66, pp. 226-232, 2002
[39]	Dean J.H., Twerdok L.E., Tice R.R. et al. ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay. II Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Regul. Toxicol. Pharmacol., 34, pp. 258-273, 2001
[40]	Hanek K.E., Tice R.R., Carson B.L. et al. ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay. III Data analysis completed by the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, Regul. Toxicol. Pharmacol., 34, pp. 274-286, 2001
[41]	ASTM F2148-13, Standard Practice for Evaluation of Delayed Contact Hypersensitivity Using the Murine Local Lymph Node Assay (LLNA)
[42]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), Test No. 442B: Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA or - FCM, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, Editions OCDE, Paris, 2018, https://doi.org/10.1787/9789264090996-en
[43]	Lee J.K., Park J.H., Park S.H. et al. A nonradioisotopic endpoint for measurement of lymph node cell proliferation in a murine allergic contact dermatitis model, using bromodeoxyuridine immunohistochemistry, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 48, pp. 53-61, 2002
[44]	ICCVAM, 2010. ICCVAM Test Method Evaluation Report on Using the LLNA for Testing Pesticide Formulations, Metals, Substances in Aqueous Solutions, and Other Products. NIH Publication No. 10-7512. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences.

Библиография для исследования кожной сенсибилизации in vitro

[45]	Basketter D., Maxwell G. In vitro approaches to the identification and characterization of skin sensitizers, Cutaneous and Ocular Toxicol., 26, pp. 359-373, 2007
[46]	Ashikaga Т., Yoshida Y., Hirota M et al. Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines: The human Cell Line Activation Test (h-CLAT) I. Optimization of the h-CLAT protocol, Toxicology in vitro, 20, pp. 767-773, 2006
[47]	Sakaguchi H., Ashikaga Т., Miyazawa M. et al. Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines: the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) II. An inter-laboratory study of the h-CLAT, Toxicology in vitro, 20, pp. 774-784, 2006
[48]	Ashikaga Т., Sakaguchi H., Okamoto K. et al. Assessment of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for Skin Sensitization; Results of the First Japanese Inter-laboratory Study, Alternatives to Animal Testing and Experimentation, 13, pp. 27-35, 2008
[49]	EURL CVAM, European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing, https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/ecvam
[50]	Gibbs S., Kosten I., Veldhuizen R., Spiekstra S., Corsini E., Roggen E., Rustemeyer Т., Feilzer A.J., Kleverlaan C.J. Assessment of metal sensitizer potency with the reconstructed human epidermis IL-18 assay. Toxicology. 393, pp. 62-72, 2018
[51]	HAUGEN E. and HENSTEN-PETTERSEN A. The sensitizing potential of periodontal dressings. J. Dent. Res., 57, pp. 950-953, 1978
[52]	Johansson H., Gradin R., Forreryd A., Agemark M., Zeller K., Johansson A., Lame O., van Vlier E., Borrebaeck C., Lindstedt M. Evaluation of the GARD assay in a blind Cosmetics Europe study. ALTEX, 34, pp. 515-523, 2017
[53]	Roberts D.W. Is a combination of assays really needed fornon-animal prediction of skin sensitization potential? Performance of the GARD^тм (Genomic Allergen Rapid Detection) assay in comparison with OECD guideline assays alone and in combination. Regul Toxicol Pharmacol, 98, pp. 155-160, 2018
[54]	Cottrez F., Boitel E., Ourlin J.C., Peiffer J.L., Fabre I., Henaoui I.S., Mari В., Vallauri A., Paquet A., Barbry P., Auriault C., Aeby P., Groux H., SENS-IS, a 3D reconstituted epidermis based model for quantifying chemical sensitization potency: Reproducibility and predictivity results from an inter-laboratory study. Toxicol In Vitro, 32, pp. 248-260, 2016
[55]	Kimber I., Dearman R.J., Betts C.J., Gerberick G.F., Ryan C.A., Kern P.S., Patlewicz G.Y., Basketter D.A. The local lymph node assay and skin sensitization: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, pp. 181-185, 2006

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (общие ссылки)

[56]	Ankley G.Т., Bennett R.S., Erickson R.J., Hoff D.J., Hornung M.W., Johnson R.D., Mount D.R., Nichols J.W, Russom C.L., Schmieder P.K., Serrrano J.A., Tietge J.E., Villeneuve D.L. (2010). Adverse outcome pathways: A conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry 29:730-741
[57]	Casati S. (2017) Contact hypersensitivity: Integrated approaches to testing and assessment. Current Opinion in Toxicology 5:1-5
[58]	Ezendam J., Braakhuis H.M., Vandebriel R.J. (2016) State of the art in non-animal approaches for skin sensitization testing: from individual test methods towards testing strategies. Arch Toxicol. 90(12):2861-2883
[59]	Hoffmann S., Kleinstreuer N., Alepee N., Allen D., Api A.M., Ashikaga Т., Clouet E., Cluzel M., Desprez В., Gellatly N., Goebel C., Kern P.S., Klaric M., J., Lalko J.F., Martinozzi-Teissier S., Mewes K., Miyazawa M., Parakhia R., van Vliet E., Zang Q., Petersohn D. (2018) Non-animal methods to predict skin sensitization (I): the Cosmetics Europe database. Crit Rev Toxicol. 48(5):344-358
[60]	Kimber I., Travis M.A., Martin S.F., Dearman R.J. Immunoregulation of skin sensitization and regulatory T cells. 2012. Contact Dermatitis 67(4):179-83
[61]	Kleinstreuer N.C., Hoffmann S., Alepee N., Allen D., Ashikaga Т., Casey W., Clouet E., Cluzel M., Desprez В., Gellatly N., C., Kern P.S., Klaric M., J., Martinozzi-Teissier S., Mewes K., Miyazawa M., Strickland J., van Vliet E., Zang Q., Petersohn D. (2018) Non-animal methods to predict skin sensitization (II): an assessment of defined approaches. Crit Rev Toxicol. 48(5):359-374
[62]	Martin S.F., Esser P.R., Weber F.C., Jakob Т., Freudenberg M.A., Schmidt M., Goebeler M. (2011) Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy 66(9):1152-63
[63]	OECD, 2017. Revised Guidance Document on Developing and Assessing Adverse Outcome Pathways. Series on Testing & Assessment No. 184. ENV/JM/MONO (2013)6. Organization for Economic Co-operation and Development. Paris. 32 pp. Available at: http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2013)6&doclanguage=en
[64]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), Guidance Document on the Reporting of Defined Approaches to be Used Within Integrated Approaches to Testing and Assessment, OECD Series on Testing and Assessment, n° 255, Editions OCDE, Paris, 2017, Available at: https://doi.org/10.1787/9789264274822-en
[65]	Reisinger K., Hoffmann S., Alepee N., Ashikaga Т., Barroso J., Elcombe C., Gellatly N., Galbiati V., Gibbs S., Groux H., Hibatallah J., Keller D., Kern P., Klaric M., Kolle S., Kuehnl J., Lambrechts N., Lindstedt M., Millet M., Martinozzi-Teissier S., Natsch A., Petersohn D., Pike I., Sakaguchi H., Schepky A., Tailhardat M., Templier M., van Vliet E., Maxwell G. (2015) Systematic evaluation of non-animal test methods for skin sensitisation safety assessment. Toxicol In Vitro 29(1):259-70
[66]	Strickland J., Zang Q., Kleinstreuer N., Paris M., Lehmann D.M., Choksi N., Matheson J., Jacobs A., Lowit A., Allen D., Casey W. (2016) Integrated decision strategies for skin sensitization hazard. J Appl Toxicol. 36(9):1150-62
[67]	Urbisch D., Honarvar N., Kolle S.N., Mehling A., Ramirez Т., Teubner W., Landsiedel R. (2016) Peptide reactivity associated with skin sensitization: The QSAR Toolbox and TIMES compared to the DPRA. Toxicol In Vitro 34:194-203
[68]	Urbisch D., Mehling A., Guth K., Ramirez Т., Honarvar N., Kolle S., Landsiedel R., Jaworska J., Kern P.S., Gerberick F., Natsch A., Emter R., Ashikaga Т., Miyazawa M., Sakaguchi H. (2015) Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul Toxicol Pharmacol. 71(2):337-51
[69]	Van der Veen J.W., Pronk Т.E., Van Loveren H., Ezendam J. (2013) Applicability of a keratinocyte gene signature to predict skin sensitizing potential. Toxicol In Vitro 27(1):314-322
[70]	Van der Veen J.W., Rorije E., Emter R., Natsch A., van Loveren H., Ezendam J. (2014) Evaluating the performance of integrated approaches for hazard identification of skin sensitizing chemicals. Regul Toxicol Pharmacol. 69(3):371-9
[71]	Van der Veen J.W., Vandebriel R., Van Loveren H., Ezendam J. (2011) Keratinocytes, innate immunity and allergic contact dermatitis - opportunities for the development of in vitro assays to predict the sensitizing potential of chemicals. DOI: 10.5772/28337. In: Ro YS, (ed) Contact dermatitis. DOI: 10.5772/1167. ISBN: 978-953-307-577-8
[72]	Safford R.J. (2008) The dermal sensitisation threshold - a TTC approach for allergic contact dermatitis. Regul. Toxicol. Pharmacol. 51:195-200
[73]	Myers D.K., Goldberg A.M., Poth A., Wolf M.F., Carraway J., McKim J., Coleman K.P., Hutchinson R., Brown R., Krug H.F., Bahinski A., Hartung T. (2017) From In Vivo to In Vitro: The Medical Device Testing Paradigm Shift. ALTEX 34(4):479-500

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (DPRA)

[74]	Gerberick G.F., Vassallo J.D., Bailey R.E., Chaney J.G., Morrall S.W., Lepoittevin J.P. (2004) Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicol Sci. 81 (2):332-43
[75]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), Test No. 442C: In Chemico Skin Sensitisation: Assays addressing the Adverse Outcome Pathway key event on covalent binding to proteins, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, Editions OCDE, Paris, 2019, Available at: https://doi.org/10.1787/9789264229709-en
[76]	Urbisch D., Mehling A., Guth K., Ramirez Т., Honarvar N., Kolle S., Landsiedel R., Jaworska J., Kern P.S., Gerberick F., Natsch A., Emter R., Ashikaga Т., Miyazawa M., Sakaguchi H. (2015) Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods. Regul Toxicol Pharmacol. 71(2):337-351

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (KeratinoSens^тм)

[77]	EURL ECVAM, 2014. Recommendation on the KeratinoSens^тм assay for skin sensitization testing, 42 pp. Available at: https://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation
[78]	Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez Т., Kolle S., Eltze Т., van Ravenzwaay В., Oesch F., Landsiedel R. (2013) Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch Toxicol 87(9):1683-1969
[79]	OECD, 2018. Test No. 442D: In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase Test Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264229822-en
[80]	Thome N., Inglese J., Auld D.S. (2010) Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17(6):646-657

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (LuSens)

[81]	EURL ECVAM, 2018. The LuSens test method Validation Study Report. Доступно по адресу: https://tsar.jrc.ec.europa.eu/test-method/tm2011-10
[82]	OECD, 2018. Test No. 442D: In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase Test Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264229822-en
[83]	Ramirez Т., Mehling A., Kolle S.N., Wruck C.J., Teubner W., Eltze Т., Aumann A., Urbisch D., van Ravenzwaay В., Landsiedel R. (2014) LuSens: a keratinocyte based ARE reporter gene assay for use in integrated testing strategies for skin sensitization hazard identification. Toxicol. In Vitro 28, 1482-1497
[84]	Ramirez Т., Stein N., Aumann A., Remus Т., Edwards A., Norman K.G., Ryan C., Bader J.E., Fehr M., Burleson F., Foertsch L., Wang X., Gerberick F., Beilstein P., Hoffmann S., Mehling A., van Ravenzwaay В., Landsiedel R. (2016) Intra- and inter-laboratory reproducibility and accuracy of the LuSens assay: A reporter gene-cell line to detect keratinocyte activation by skin sensitizers. Toxicol. In Vitro 32, 278-286

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (SENS-IS)

[85]	Cottrez F., Boitel E., Auriault C., Aeby P., Groux H. (2015) Genes specifically modulated in sensitized skins allow the detection of sensitizers in a reconstructed human skin model. Development of the SENS-IS assay. Toxicol In Vitro 29 (4):787-802
[86]	Cottrez F., Boitel E., Pellevoisin C., Alonso A., Seyler S., Groux H. (2016a). Evaluation of the SkinEthicRHE model in the SENS-IS assay for prediction of skin sensitization of chemicals. Society of Toxicology Annual Meeting, New Orleans, Louisiana, USA
[87]	Cottrez F., Boitel E., Ourlin J.C., Peiffer J.L., Fabre I., Henaoui I.S., Mari В., Vallauri A., Paquet A., Barbry P., Auriault C., Aeby P., Groux H. (2016b) SENS-IS, a 3D reconstituted epidermis based model for quantifying chemical sensitization potency: Reproducibility and predictivity results from an inter-laboratory study. Toxicol In Vitro 32:248-60
[88]	Cottrez F., Pellevoisin C., Coleman K., Groux H. (2018) In vitro assessment of medical device extracts potential to produce skin sensitization. Toxicology Letters Volume 295, Supplement 1, 10 October, Page S179, https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2018.06.827
[89]	Uruno A., Motohashi H. (2011) The Keap1-Nrf2 system as an in vivo sensor for eiectrophiies. Nitric Oxide 25(2):153-60
[90]	Cottrez F., Boitel E., Berrada-Gomez M.P., Dalhuchyts H., Bidan C., Rattier S., Ferret P.J., Groux H. (2020). In Vitro Measurement of Skin Sensitization Hazard of Mixtures and Finished Products: Results Obtained With the SENS-IS Assays. Toxicol In Vitro 62:104644
[91]	Bergal M., Puginier M., Gerbeix C., Groux H., Roso A., Cottrez F., Milius A. (2020) In vitro testing strategy for assessing the skin sensitizing potential of "difficult to test" cosmetic ingredients. Toxicol In Vitro 65:104781

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (Набор IL-18 RHE)

[92]	Andres E., Barry M., Hundt A., Dini C., Corsini E., Gibbs S., Roggen E.L., Ferret P.J. (2017) Preliminary performance data of the RHE/IL-18 assay performed on SkinEthic^тм RHE for the identification of contact sensitizers. Int J CosmetSci. 39(2):121-132
[93]	Galbiati V., Papale A., Marinovich M., Gibbs S., Roggen E.L., Corsini E. (2017). Development of an in vitro method to estimate the sensitization induction level of contact allergens. Toxicology Letters 271:1-11
[94]	Gibbs S., Kosten I., Veldhuizen R., Spiekstra S., Corsini E., Roggen E., Rustemeyer Т., Feilzer A.J., Kleverlaan C.J. (2018) Assessment of metal sensitizer potency with the reconstructed human epidermis IL-18 assay. Toxicology 393:62-72
[95]	Gibbs S., Corsini E., Spiekstra S.W., Galbiati V., Fuchs H.W., Degeorge G., Troese M.J., Hayden P.M., Deng W., Roggen E. (2013) An epidermal equivalent assay for identification and ranking potency of contact sensitizers. Toxicology and Applied Pharmacology 272(2):529-41

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (EpiSensA)

[96]	Saito K., Nukada Y., Takenouchi O., Miyazawa M., Sakaguchi H., Nishiyama N. (2013) Development of a new in vitro skin sensitization assay (Epidermal Sensitization Assay; EpiSensA) using reconstructed human epidermis. Toxicol In Vitro 27(8):2213-24
[97]	Saito K., Takenouchi O., Nukada Y., Miyazawa M., Sakaguchi H. (2017) An in vitro skin sensitization assay termed EpiSensA for broad sets of chemicals including lipophilic chemicals and pre/pro-haptens. Toxicol In Vitro 40:11-25

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (SenCeeTox)

[98]	Coleman K.P., McNamara L.R., Grailer T.P., Willoughby J.A.Sr, Keller D.J., Patel P., Thomas S., Dilworth C. (2015) Evaluation of an In Vitro Human Dermal Sensitization Test for Use with Medical Device Extracts. Applied In Vitro Toxicology 1 (2): 118-130
[99]	McKim J.M.Jr, Keller D.J.III, Gorski J.R. (2010) A new in vitro method for identifying chemical sensitizers combining peptide binding with ARE/EpRE-mediated gene expression in human skin cells. Cutaneous and OcularToxicology 29(3):171-192
[100]	McKim J.M.Jr., Keller D.J.III, Gorski J.R. (2012). An in vitro method for detecting chemical sensitization using human reconstructed skin models and its applicability to cosmetic, pharmaceutical, and medical device safety testing. Cutaneous and OcularToxicology 31(4):292-305

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (h-CLAT)

[101]	Ashikaga Т., Yoshida Y., Hirota M., Yoneyama K., Itagaki H., Sakaguchi H., Miyazawa M., Ito Y., Suzuki H., Toyoda H. (2006) Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines: The human Cell Line Activation Test (h-CLAT) I. Optimization of the h-CLAT protocol. Toxicol. In Vitro 20:767-773
[102]	EC EURL ECVAM, 2015. Re-analysis of the within and between laboratory reproducibility of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT). Доступно по адресу: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the human-cell-line-activation-test-h-clat-for-skin-sensitisation-testing
[103]	Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez Т., Kolle S., Eltze Т., van Ravenzwaay В., Oesch F., Landsiedel R. (2013) Xenobiotic metabolizing enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch Toxicol 87:1683-1969
[104]	OECD, 2018. Test No. 442E: In Vitro Skin Sensitisation: In Vitro Skin Sensitisation assays addressing the Key Event on activation of dendritic cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264264359-en
[105]	Takenouchi O., Miyazawa M., Saito K., Ashikaga Т., Sakaguchi H. (2013) Predictive performance of the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for lipophilic with high octanolwater partition coefficients. J. Toxicol. Sci. 38:599-609

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (U-SENS^тм)

[106]	Alepee N., Piroird C., Aujoulat M., Dreyfuss S., Hoffmann S., Hohenstein A., Meloni M., Nardelli L., Gerbeix C., Cotovio J. (2015) Prospective multicentre study of the U-SENS test method for skin sensitization testing. Toxicol In Vitro 30:373-382
[107]	EURL ECVAM, 2017. The U-SENS^тм test method Validation Study Report. Доступно по адресу: https://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations
[108]	OECD, 2018. Test No. 442E: In Vitro Skin Sensitisation: In Vitro Skin Sensitisation assays addressing the Key Event on activation of dendritic cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264264359-en
[109]	Piroird C., Ovigne J.M., Rousset F., Martinozzi-Teissier S., Gomes C., Cotovio J., Alepee N. (2015) The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29:901-916

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (Набор IL-8 Luc)

[110]	Kimura Y., Fujimura C., Ito Y., Takahashi Т., Nakajima Y., Ohmiya Y., Aiba S. (2015) Optimization of the IL-8 Luc assay as an in vitro test for skin sensitization, Toxicol In Vitro 29:1816-30
[111]	OECD, 2018. Test No. 442E: In Vitro Skin Sensitisation: In Vitro Skin Sensitisation assays addressing the Key Event on activation of dendritic cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264264359-en
[112]	OECD, 2017. Report of the Peer Review Panel for the IL-8 Luciferase (IL-8 Luc) Assay for in vitro skin sensitisation. Series on Testing and Assessment No. 258, ENV/JM/MONO(2017)20. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm

Библиография для исследования сенсибилизации in vitro (GARD^тм)

[113]	Forreryd A., Johansson H., Albrekt A.S., Lindstedt M. (2014) Evaluation of high throughput gene expression platforms using a genomic biomarker signature for prediction of skin sensitization. BMC Genomics 15:379
[114]	Forreryd A., Zeller K.S., Lindberg Т., Johansson H., Lindstedt M. (2016) From genomewide arrays to tailor-made biomarker readout - Progress towards routine analysis of skin sensitizing chemicals with GARD. Toxicol In Vitro 37:178-188
[115]	Johansson H., Albrekt A.S., Borrebaeck C.A., Lindstedt M. (2013) The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicol In Vitro 27(3): 1163-9
[116]	Johansson H., Lindstedt M., Albrekt A.S., Borrebaeck C.A. (2011) Agenomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics. 12:399
[117]	Roberts D.W. (2018) Is a combination of assays really needed for non-animal prediction of skin sensitization potential? Performance of the GARD^тм (Genomic Allergen Rapid Detection) assay in comparison with OECD guideline assays alone and in combination. Reg. Toxocol. Pharmacol. 98:155-160
[118]	Johansson H., Gradin R., Johansson A., Adriaens E., Edwards A., V., Jerre A., Burleson F., Gehrke H., Roggen E. (2019) Validation of the GARD^тмskin Assay for Assessment of Chemical Skin Sensitizers: Ring Trial Results of Predictive Performance and Reproducibility. Toxicological Sciences, 170(2):374-381
[119]	Jenvert R.M., Johansson A., Lame O., Aaltonen E., Jerre A., Gradin R., Johansson H. (2019) In vitro skin sensitization testing of Medical Devices using GARD. Toxicology Letters, volume 31, Supplement 1, 10 October, 155
[120]	ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
[121]	OECD, 2020. OECD Test Guidelines Programme, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/oecd-guidelines-testing-chemicals-related-documents.htm
[122]	OCDE. 2010, Test No. 442A: Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay: DA, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, Editions OCDE, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264090972-en
[123]	OCDE. 2018, Test No. 442B: Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA or-FCM, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, Editions OCDE, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264090996-en
[124]	OCDE. 2017, Guidance Document on the Reporting of Defined Approaches and Individual Information Sources to be Used within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) for Skin Sensitisation, OECD Series on Testing and Assessment, n° 256, Editions OCDE, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264279285-en
[125]	ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

Ключевые слова: медицинское изделие, аллерген, эритема, индукция, сенсибилизация.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас

Получить бесплатный доступ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Приложение А (обязательное). Подготовка образцов для исследования кожной сенсибилизации

Приложение В (справочное). Метод приготовления экстрактов из полимерных исследуемых образцов

Приложение С (справочное). Методы сенсибилизации кожи без использования животных

Приложение D (справочное). Справочная информация о методах кожной сенсибилизации

Приложение ДА (справочное). Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас