Приложение С (справочное). Методы сенсибилизации кожи без использования животных

Приложение С
(справочное)

Методы сенсибилизации кожи без использования животных

С.1 Введение

С.1.1 История альтернативных методов исследования кожной сенсибилизации

Попытки сократить или заменить применение животных в исследованиях токсичности привели к развитию новых методов, не связанных с животными. Так как изначально методы были приняты для тестирования химических веществ, интерес к этим новым методам для оценки безопасности лекарств и МИ вырос в последние годы. Для сенсибилизации кожи часто применяют методы исследования in vivo на животных и людях, так как они позволяют наблюдение неблагоприятного результата (например, аллергического контактного дерматита) на живом объекте. Тем не менее по мере развития понимания молекулярных и клеточных механизмов процесса кожной сенсибилизации разработаны методы для оценки потенциала химических веществ или материалов к кожной сенсибилизации, не связанные с животными [57]. Эти методы могут быть разделены на три категории:

- химические методы (in chemico assays): исследование или процедура, связанные с присущей реактивностью материала, включающие скорее физико-химические измерения, а не биологическое тестирование;

- методы моделирования (in silico assays): исследование или процедура, проводимые методами компьютерного моделирования [например, такие как компьютерная модель молекулы или клетки, которая точно имитирует ее поведение, или оценка количественного соотношения структура-активность (QSAR)];

- методы in vitro: исследование или процедура, проводимые вне живого организма и при контролируемых условиях (например, культуры клеток в планшете).

На данный момент ни один из валидированных методов в этих категориях не способен полностью воспроизвести точную и сложную сеть механизмов молекулярного, клеточного и органного уровней, которые действуют в живых организмах.

Как следствие, каждый метод при индивидуальном рассмотрении не способен полностью воспроизвести события, приводящие к неблагоприятному результату. Скорее, прогноз потенциала к сенсибилизации кожи химическим веществом в человеке основан на механистичных подходах, сочетающих несколько анализов в стратегиях исследований [66], [70].

С.1.2 Процесс с неблагоприятным исходом (АОР), ведущим к кожной сенсибилизации

В руководстве OECD описана последовательная цепь связанных событий на молекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях, ведущих к кожной сенсибилизации [5].

Эта серия событий структурирована таким образом, чтобы разработать и создать подробную и стандартную картину пути, ведущего к неблагоприятному исходу, наблюдаемому во всем организме (животном или человеке).

Данную серию событий называют процессом с неблагоприятным исходом (АОР).

Процесс с неблагоприятным исходом (АОР) линейно связывает существующие знания по одной или нескольким сериям случайно связанных ключевых событий (KE) между двумя точками - молекулярное инициирующее событие (MIE) и неблагоприятный исход (АО) [56]. Процесс с неблагоприятным исходом (АОР) является центральным элементом токсикологической базы знаний, созданной для поддержки оценки химического риска, основанной на механистических рассуждениях.

Процесс с неблагоприятным исходом (АОР) для сенсибилизации кожи начинается после воздействия и абсорбции сенсибилизирующего агента. После того как агент проникает в роговой слой кожи, происходит серия событий на молекулярном, клеточном и органном уровнях, приводящая к неблагоприятной конечной точке аллергического контактного дерматита или контактной гиперчувствительности. Четырьмя ключевыми моментами для сенсибилизации кожи в АОР являются следующие:

- ключевое событие 1 - ковалентное связывание с белками кожи: молекулярное инициирующее событие после проникновения в роговой слой является необратимым формированием комплекса гаптен-белок. В живом организме это событие связано с выработкой специфичного ответа Т-клетки памяти;

- ключевое событие 2 - ответ кератиноцитов: этот ключевой момент включает активацию биохимических путей в кератиноцитах и воспалительные медиаторные ответы, а также изменения в экспрессии гена, связанные с путями клеточных сигналов, такими как элемент ответа антиоксидант/электрофил (ARE);

- ключевое событие 3 - активация дендритных клеток: подробные биохимические события после формирования комплекса гаптен-белок пока полностью не ясны. Тем не менее известно, что задействованные пути связаны с воспалением, такие как сигнальный путь протеинкиназы, активированной митогеном, и путь ответа оксидативного стресса, которые особенно фиксируются в кератиноцитах и дендритных клетках. Эффекты на клеточном и тканевом уровнях также полностью не известны, но включают эпидермальные ответы, в которые входят:

1) иммунное распознавание химических аллергенов кератиноцитами, специализированными эпидермальными дендритными клетками (т.е. клетками Лангерганса) и дермальными дендритными клетками;

2) ответы в форме экспрессии специфичных маркеров клеточной поверхности, таких как адгезивные молекулы, хемокины и цитокины, такие как IL-1 или IL-12p70, как правило, воспринимаются как свидетельство созревания дендритной клетки;

- ключевое событие 4 - пролиферация Т-клетки: на органном уровне (лимфатические узлы и кожа) ответами являются:

1) миграция дендритных клеток в лимфатический узел, где антиген представлен молекулами основного комплекса гистосовместимости (МНС) к нативным Т-лимфоцитам (Т-клеткам), и

2) дифференциация и пролиферации Т-клеток на аллергенспецифические активные Т-клетки и Т-клетки памяти.

Финальным физиологическим ответом является приобретение чувствительности; ключевым ответом организма - кожное воспаление после получения провокации веществом на фазе элиситации. Этот ответ связан со стимуляцией специфичной Т-клетки памяти, производимой на фазе индукции. Общий эффект у млекопитающих - аллергический контактный дерматит у людей или его эквивалент, контактная гиперчувствительность у грызунов [65].

С.1.3 Интегрированные подходы к исследованию и оценке

IATA являются практическими, научно-обоснованными подходами к характеристике химической опасности, которые полагаются на интегрированный анализ существующей информации в сочетании с получением новой информации посредством стратегии испытаний. Для прогноза потенциала химических веществ к кожной сенсибилизации у человека альтернативные методы, не связанные с животными, применяют в комплексе или в сочетании с имеющейся соответствующей информацией для полной характеристики биологической конечной точки. Конечная точка сенсибилизации может быть определена путем применения интегрированного подхода, когда вся существующая и надежная информация о химическом веществе или материале объединяется с данными биохимических (in chemico), моделируемых (in silico) и/или клеточных (in vitro) методов для адекватного прогнозирования токсичности материала или химического вещества. Иногда интегрированный подход может потребовать выработки дополнительных данных с использованием подходов, не связанных с животными, для получения полной приемлемости для прогнозирования конкретной конечной точки токсичности.

Примерами наборов для кожной сенсибилизации in vitro являются KeratinoSens ^тм, LuSens, U-SENS ^тм, набор для активации линии клеток человека (h-CLAT) и набор IL-8 Luc. Набор прямой реактивности пептидов (DPRA) - это пример для кожной сенсибилизации in chemico. Примерами моделируемых методов сенсибилизации in silico являются QSAR Toolbox и платформа моделирование Times MEtabolism, используемая для прогнозирования сенсибилизации кожи (TIMES SS) [56], [67]. Некоторые из этих методов могут комбинироваться в IATA для оценки потенциала к сенсибилизации кожи химических веществ или материалов.

Для стандартизации оценки при помощи IATA при принятии нормативных решений OECD разработала руководство принципов и шаблонов для сообщения установленных подходов (DA) и индивидуальных источников информации [57], [67]. DA состоит из процедуры интерпретации закрепленных данных (DIP), применяемой к данным, выработанным с определенным набором источников информации для выведения результата, который может быть использован самостоятельно или вместе с другими источниками информации в IАТА для удовлетворения конкретных нормативных нужд.

Для приобретения нормативной приемлемости IАТА для потенциала к сенсибилизации кожи интегрированные подходы включают DA, в то время как для каждого DA четко описаны соответствующая информация и конкретные применяемые методы, не связанные с животными, а также предоставляется процедура для интерпретации данных этих обозначенных методов. Таким образом, DA являются стратегиями, основанными на правилах, которые могут исключить необходимость экспертной оценки, как только конкретный подход описан, валидирован, стандартизован и принят [61].

В руководстве OECD 256:2017, приложение I [124] (см. таблицу С.1) приведено описание 12 наглядных предметных исследований DA для сенсибилизации кожи. Некоторые из них в настоящее время рассматриваются в OECD для руководства по исследованиям "Установленные подходы для сенсибилизации кожи".

Таблица С.1 - Предметные исследования руководства ОЭСР 256:2017, приложение I [124]

Предметное исследование		Цель
I	Интегрированный подход стратегии исследования к идентификации опасности для кожи "2 из 3", основанный на цепи неблагоприятного результата (BASF)	Идентификация опасности
II	Последовательная стратегия исследования (STS) для идентификации опасности сенсибилизаторов кожи (RIVM)	Идентификация опасности
III	Конвейерный подход без тестирования для сенсибилизации кожи (Г. Патлевич)	Идентификация опасности
IV	Вертикальная мета-модель для идентификации опасности сенсибилизации кожи (L'Oreal)	Идентификация опасности
V	Стратегия интегрированного решения для опасности сенсибилизации кожи (ICCVAM)	Идентификация опасности
VI	Согласованное классификационное древо для прогноза опасности кожной сенсибилизации (ЕС JRC)	Идентификация опасности
VII	Прогноз потенциала сенсибилизатора, основанный на ключевом моменте 1 + 2: комбинация данных реактивности кинетических пептидов и данных KeratinoSens  (Givaudan)	Прогноз потенциала
VIII	Модель искусственной нейросети для прогнозирования LLNA ЕС3 (Shiseido)	Прогноз потенциала
IX	Байесовская сеть DIP (BN-ITS-3) для идентификации опасности и мощности сенсибилизаторов кожи (P&G)	Прогноз потенциала
X	STS для классификации сенсибилизирующей мощности, основанной на данных in chemico и in vitro (Kao Corporation)	Прогноз потенциала
XI	Интегрированная стратегия исследования (ITS) для классификации сенсибилизирующей мощности, основанная на данных in silico, in chemico и in vitro (Kao Corporation)	Прогноз потенциала
XII	DIP для оценки риска кожной аллергии (SARA) (Unilever)	Прогноз потенциала

С.2 Анализ в условиях in vitro для исследования кожной сенсибилизации

С.2.1 Общие положения

В С.2 приведены обобщения проб сенсибилизации кожи in vitro, включенные в недавние обзоры и международные исследования оценки [58], [59], [65], [68].

С.2.2 Методы испытания

С.2.2.1 DPRA

DPRA - это биохимический метод, который количественно определяет реакционную способность исследуемого химического вещества путем его истощения синтетическими пептидами, содержащими цистеин или лизин. Вычисляют значения истощения, %, и в прогностической модели классифицировано химическое вещество как сенсибилизатор или несенсибилизатор кожи (см. таблицу С.2).

Таблица С.2 - DPRA

Ключевое событие 1. Молекулярное инициирующее событие связывания ковалентного белка
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442С [75]
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 80 %, чувствительность 80 %, специфичность 77 %
Экспериментальная система	Концентрацию цистеина или лизина, остающегося в синтетическом пептиде, определяют после инкубации при температуре от 22,5 °С до 30 °С на 24 ч с исследуемым химическим веществом. Для помощи в обнаружении синтетические пептиды содержат фенилаланин. Концентрации пептидов измеряют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ/HPLC) с градиентной элюцией и УФ-детектированием при длине волны 220 нм
Принцип исследования	Определяют процентные показатели убывания пептидов цистеина и лизина и используют в модели прогнозирования, которая классифицирует исследуемое химическое вещество в один из четырех классов реактивности, которые разделены на сенсибилизаторов и несенсибилизаторов кожи
Считывание данных	Относительные концентрации пептидов измеряют HPLC с обнаружением при длине волны в 220 нм
Время воздействия	24 ч
Применимость	Метод неприменим к тестированию металлических соединений, так как они могут вступать в реакцию с белками посредством других механизмов, кроме ковалентного связывания. Исследуемое химическое вещество должно быть полностью растворено в надлежащем растворителе при концентрации в 100 ммоль. Исследование смесей возможно, если их состав известен
Применение к МИ	Отсутствие данных. DPRA работает с ацетонитрилом, водой, изопропанолом и ацетоном. Тем не менее метод, возможно, не будет работать с неполярными растворителями МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масло. Так как проба использует излишек химического вещества против пептидов в пробе, маловероятно, что проба подходит для обнаружения сенсибилизаторов кожи в экстрактах МИ
Примечание - См. ссылки [74]-[76].

С.2.2.2 KeratinoSens ^тм1)

-----------------------------

¹⁾_{KeratinoSens является торговой маркой продукта, поставляемого Givaudan Schweiz AG, СН-8310 Кемптталь. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

-----------------------------

Набор KeratinoSens ^тм использует иммортализованную линию адгезивных клеток кератиноцитов человека, содержащую репортерный ген люциферазы, контролируемый антиоксидант-ответственным элементом (ARE) гена человека AKR1C2, который повышающе регулируется сенсибилизаторами кожи (см. таблицу С.3).

Таблица С.3 - KeratinoSens ^тм

Ключевое событие 2. Активация эпидермальных кератиноцитов
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442D [79]
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 77 %, чувствительность 78 %, специфичность 79 %
Экспериментальная система	Трансгенная клеточная линия KeratinoSens тм: иммортализованная линия адгезивных клеток, полученная из кератиноцитов человека, стабильно накапливающих репортерный ген люциферазы, контролируемый ARE гена человека AKR1C2
Принцип исследования	Клеточная линия KeratinoSens тм содержит ген люциферазы под транскрипционным контролем конститутивного активатора, объединенного с элементом ARE. Сигнал люциферазы указывает на активацию эндогенных Nrf2-зависимых генов путем электрофильных сенсибилизаторов кожи. Индукцию гена люциферазы определяют количественно измерением люминесценции, производимой субстратами люциферазы, генерирующими свет. Исследуемые химические вещества признают сенсибилизаторами кожи, если они вызывают статистически значимое повышение в активности люциферазы (т.е. 50 %-ное увеличение) ниже концентрации, которая не вызывает значительного сокращения в активности клеток
Считывание данных	Количественное измерение (обнаружением люминесценции) индукции гена люциферазы
Время воздействия	48 ч
Применимость	Проба KeratinoSens тм применима к исследуемым химическим веществам, включающим различные органические функциональные группы, механизмы реакции, мощности сенсибилизации кожи и физико-химические свойства. Дополнительно проба применима к растворимым химическим веществам или тем, которые формируют стабильные дисперсии (например, суспензии или коллоиды) в среде воздействия.
Применение к МИ	Данные отсутствуют. KeratinoSens тм работает с DMSO и водными растворами, но возможно не будет работать с неполярными жидкостями для МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масло, потому что их значения log Р превышают 15,0
Примечание - См. ссылки [77]-[80].

С.2.2.3 LuSens

Набор LuSens использует иммортализованную линию клеток кератиноцитов человека, накапливающую репортерный ген люциферазы под контролем антиоксидант-ответственным элементом (ARE) гена хинона оксидоредуктазы крысы 1 (NQO1), который усилен сенсибилизаторами кожи (см. таблицу С.4).

Таблица С.4 - LuSens

Ключевое событие 2. Активация эпидермальных кератиноцитов
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442D
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 74 %, чувствительность 74 %, специфичность 74 %
Экспериментальная система	Трансгенная клеточная линия LuSens: иммортализованная линия адгерентных клеток, полученная из кератиноцитов человека, стабильно накапливающая репортерный ген люциферазы под контролем ARE гена крысы NQO1
Принцип исследования	Трансгенная клеточная линия LuSens содержит репортерный ген люциферазы под транскрипционным контролем активатора, объединенного с элементом ARE. Сигнал люциферазы указывает на активацию электрофилами эндогенных Nrf2-зависимых генов. Индукция гена люциферазы измеряют количественно по люминесценции, производимой субстратами люциферазы, генерирующими свет, как индикатор активности в клетках фактора транскрипции Nrf2 после воздействия электрофильных сенсибилизаторов кожи
Считывание данных	Количественное измерение (обнаружением люминесценции) индукции гена люциферазы
Время воздействия	48 ч
Применимость	Проба LuSens применима к исследуемым химическим веществам, включающим различные органические функциональные группы, механизмы реакции, мощности сенсибилизации кожи и физико-химические свойства. Дополнительно проба применима к растворимым химическим веществам или тем, которые формируют стабильные дисперсии (например, суспензии или коллоиды) в среде воздействия
Применение к МИ	Данные отсутствуют. LuSens работает с DMSO и водными растворителями, но возможно не будет задействовать с неполярными растворителями МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масло, потому что их значения log Р превышают 15,0
Примечание - См. ссылки [81]-[84].

С.2.2.4 SENS-IS

Набор SENS-IS является моделью in vitro, разработанной для химических веществ и смесей, которая измеряет KE2 путем оценки профилей экспрессии гена в моделях кожи человека [Episkin  RhE или SkinEthic ^тм RHE ¹⁾]. SENS-IS позволяет классифицировать сенсибилизаторы кожи по категориям мощности [84]. Проба SENS-IS валидирована в исследовании от индустрии [86], [87] и в настоящее время оценивается EURL-ECVAM (см. таблицу С.5).

-----------------------------

¹⁾_{Episkin RhE и SkinEthicтм RHE (EPISKIN) являются примерами коммерчески доступных подходящих продуктов. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта.}

-----------------------------

Таблица С.5 - SENS-IS

Ключевое событие 2. Активация эпидермальных кератиноцитов
Руководство ОЭСР	Проект 4.107. Новое техническое руководство - токсигеномный анализ на 3D реконструированном эпидермисе для измерения мощности сенсибилизации кожи - проба SENS-IS
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 96,6 %, чувствительность 97,7 %, специфичность 95,2 % [86], [87]
Экспериментальная система	Модели реконструированного человеческого эпидермиса (RhE) Episkin  RhE или SkinEthic тм RHE (EPISKIN)
Принцип исследования	Измеряют экспрессию гена двух групп генов: одна группа (группа REDOX) включает набор из 17 генов, имеющих в своем активаторе антиоксидантный реагирующий элемент и отслеживающих защитные окислительно-восстановительные сигналы, индуцированные взаимодействием сенсибилизаторов кожи, связывающих с аминокислотами цистеина комплекса Keap1-NRF2 [89]. Вторая группа (группа SENS-IS) включает набор из 21 гена, задействованных в воспалении, сигналах опасности и миграции клеток для реакции на сложный каскад событий, ведущих к активации дендритных клеток химическим веществом, сенсибилизирующим кожу
Считывание данных	Количественный анализ экспрессии 64 генов, измеряемый количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (qRT-PCR)
Время воздействия	15 мин воздействия; ткани RHE затем промываются и постинкубируются 6 ч.
Применимость	Проба SENS-IS использует 3D ткани RHE для четкого учета шага проникновения сквозь кожу продуктов с разной растворимостью или физическим состоянием. SENS-IS может производить количественный анализ не только химических веществ, но и натуральных продуктов, смесей и готовых изделий [90], [91]
Применение к МИ	Проба SENS-IS работает с полярными (соляной) и неполярными (кунжутное масло) носителями экстракции и может быть использована для тестирования экстрактов МИ. В исследовании, подтверждающем концепцию оценки чувствительности кожи к экстрактам МИ, были проанализированы пять известных сенсибилизаторов кожи, имеющихся в составе медицинского силикона, и отрицательный контроль. Все исследуемые объекты экстрагированы в полярном (физиологический раствор) и неполярном (кунжутное масло) растворителях и правильно идентифицированы как сенсибилизаторы или несенсибилизаторы кожи [88]
Примечание - См. ссылки [85]-[91].

С.2.2.5 Набор IL-18 RHE

Оценка сенсибилизации кожи путем измерения базального высвобождения IL-18 после нанесения химического вещества на поверхность раздела воздух-жидкость RHE приведена в таблице С.6.

Таблица С.6 - Проба IL-18 RhE

Ключевое событие 2. Активация эпидермальных кератиноцитов
Руководство ОЭСР	На настоящий момент не существует
Рабочие показатели (ответ да/нет)	На ограниченном наборе (< 10) соединений для различных исследованных моделей. Андрес и др. [92] рассчитали рабочие показатели на наборе из 19 химических веществ. В статье обсуждаются пять моделей прогнозирования, дающие разные рабочие показатели
Экспериментальная система	Модели восстановленного человеческого эпидермиса SkinEthic тм RHE (EPISKIN), VUmc-EE, EpiCS a (CellSystems), и EpiDerm тм (MatTek Corp.) b[92], [93], [94], [95]
Принцип исследования	После химического воздействия эпидермисы подвергались пробе жизнеспособности клеток и поддерживающие среды получены для исследования IL-18 ELISA
Считывание данных	Количественное исчисление IL-18 с использованием ELISA в среде культуры RHE; параллельно, жизнеспособность клеток измеряют тестом MTT
Время воздействия	24 ч
Применимость	Проба применима для исследования растворимых контактных аллергенов и катионных металлов на предмет потенциала к сенсибилизации кожи [94]
Применение к МИ	Данные отсутствуют. Так данная проба использует ткани RHE, она, возможно, будет работать с полярными и неполярными экстрактами из МИ
а VUmc-EE, EpiCS  (CellSystems) является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. b Epiderm тм EPI-200 (MatTek Corp) является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта.

С.2.2.6 EpiSensA ¹⁾

-----------------------------

¹⁾_{EpiSensA является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта.}

-----------------------------

Проба эпидермальной сенсибилизации EpiSensA использует модели ткани RhE. Проба основана на индукции маркерных генов, связанных с ответом кератиноцитов на воспаление и цитозащиту в индукции кожной сенсибилизации (см. таблицу С.7).

Таблица С.7 - EpiSensA

Ключевое событие 2. Активация эпидермальных кератиноцитов
Руководство ОЭСР	На настоящий момент не существует
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 90 %, чувствительность 94 %, специфичность 78 % [96]
Экспериментальная система	Модели восстановленного человеческого эпидермиса LabCyte EPI-MODEL 24 (Japanese Tissue Engineering Co., Ltd.) a и Epiderm тм EPI-200 (MatTek Corp.)
Принцип исследования	Эта проба основана на индукции множественных маркерных генов (ATF3, IL-8, DNAJB4 и GCLM), связанных с двумя ответами кератиноцитов (воспалительный или цитопротекторный) в индукции сенсибилизации кожи. Механистическая значимость маркерных генов подтверждена фокусированием на ключевых молекулах, регулирующих ответы кератиноцитов in vitro (Р2Х7 для воспалительных и Nrf2 для цитопротективных ответов). Повышающая регуляция ATF3 IL-8, или DNAJB4 и GCLM, индуцированная 2,4-динитрохлорбензолом в кератиноцитах человека значительно подавляется Р2Х7 специфичным антагонистом KN-62 или Nrf2 siRNA соответственно, который поддерживает механистическую релевантность маркерных генов
Считывание данных	Количественный анализ экспрессии четырех маркерных генов, измеряемый количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (RT-PCR)
Время воздействия	6 ч
Применимость	EpiSensA может быть тестом сенсибилизации кожи на механической основе, применимом к широкому кругу химических веществ, включая липофильные химические вещества и пре-/про-гаптены [97]
Применение к МИ	Данные отсутствуют. Так данная проба использует ткани RhE, она, возможно, будет работать с полярными и неполярными экстрактами из МИ
а LabCyte EPI-MODEL 24 (Japanese Tissue Engineering Co., Ltd.) является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта.

С.2.2.7 SenCeeTox ¹⁾

-----------------------------

¹⁾_{SenCeeTox является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта.}

-----------------------------

Проба SenCeeTox  измеряет экспрессию 11 генов, связанных с сенсибилизацией кожи в кератиноцитах 3D тканей RHE. Повышенная экспрессия генов, а также реактивность и цитотоксичность определяют потенциал сенсибилизации кожи (см. таблицу С.8).

Таблица С.8 - SenCeeTox 

Ключевое событие 2. Активация эпидермальных кератиноцитов
Руководство ОЭСР	На настоящий момент не существует
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 84 %, чувствительность 81 %, специфичность 92 % [99]
Экспериментальная система	Пробы реконструированного человеческого эпидермиса EpiDerm тм EPI-200 (MatTek Corp.) и Skin-Ethic тм RhE (EPISKIN)
Принцип исследования	Экспрессию восьми Nrf2/ARE, одного AhR/XRE и двух генов, контролируемых Nrf1/MRE, измеряют количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (qRTPCR). Индуцирование сложения при каждой концентрации воздействия сочетается с данными реактивности и цитотоксичности для определения потенциала к сенсибилизации
Считывание данных	Количественный анализ экспрессии 11 генов измеряют qRT-PCR. Также определяют химическую реактивность и цитотоксичный потенциал. Результаты этих индивидуальных проб анализируются при помощи алгоритма, который включает все данные каждой пробы для прогноза потенциала к кожной сенсибилизации
Время воздействия	24 ч
Применимость	Проба SenCeeTox  может использоваться для оценки химических и металлических сенсибилизаторов кожи различной мощности [98]
Применение к МИ	Проба SenCeeTox  работает с полярным (солевым) и неполярным (кунжутное масло) экстрагентом и применима для испытания экстрактов МИ. В ссылках [98] и [100] сообщалось, что проба SenCeeTox  способна точно определять растворы отдельных химических и металлических сенсибилизаторов кожи, связанных с МИ, экстрагированных из силикона медицинского назначения, используя полярные и неполярные растворители, такие как физраствор и кунжутное масло

С.2.2.8 h-CLAT

Набор h-CLAT определяет количественно изменения в экспрессии маркеров клеточной поверхности, связанных с процессом активации моноцитов и дендритных клеток после воздействия сенсибилизаторов кожи. Уровни экспрессии маркеров поверхности используют для идентификации сенсибилизаторов и несенсибилизаторов кожи (см. таблицу С.9).

Таблица С.9 - h-CLAT

Ключевое событие 3. Активация эпидермальных дендритных клеток
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442Е
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 85 %, чувствительность 93 %, специфичность 66 %
Экспериментальная система	Клеточная линия hCLAT: моноцитная клеточная линия лейкемии человека ТНР-1
Принцип исследования	Проба h-CLAT измеряет изменения в экспрессии маркеров клеточной поверхности CD86 и CD54 на клетках ТНР-1 после воздействия исследуемого химического вещества в течение 24 ч. Эти молекулы поверхности являются типичными маркерами моноцитной активации ТНР-1 и могут имитировать активацию дендритных клеток, имеющую большее значение в праймировании Т-клеток. Изменения в экспрессии маркеров поверхности измеряют проточной цитофлуометрией. Определяют относительную флуоресценцию маркеров поверхности по сравнению с контрольными экстрагентами и используют для дифференциации между сенсибилизаторами и несенсибилизаторами кожи [104]
Считывание данных	Уровни экспрессии клеточных маркеров поверхности CD86 и CD54 измеряют проточной цитометрией после окраски клеток антителами, маркированными флуорохромом
Время воздействия	24 ч
Применимость	Набор h-CLAT применима к исследуемым химическим веществам, которые растворимы в подходящем растворителе или формируют стабильные дисперсии в подходящем носителе. Исследуемые химические вещества со значениями Log Р выше 3,5 имели тенденцию выдавать ложноположительные результаты [104], [105]
Применение к МИ	Данные отсутствуют. h-CLAT работает с физиологическим раствором и растворителями DMSO, но, возможно, не будет задействовать неполярные жидкости для МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масла, потому что их значения log Р превышают 15,0

С.2.2.9 U-SENS ^тм1)

-----------------------------

¹⁾_{U-SENS является торговой маркой продукта, поставляемого L'Oreal, 41 улица Март, Клиши, 92110. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

-----------------------------

Метод исследования активации клеточной линии U937 (U-SENS ^тм) является пробой in vitro, которая количественно определяет экспрессию маркера клеточной поверхности CD86 проточной цитометрией на клеточной линии гистиоцитарной лимфомы человека, клетки U937 (см. таблицу С.10).

Таблица С.10 - U-SENS ^тм

U-SENS тм - Ключевое событие 3. Активация эпидермальных дендритных клеток
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442Е
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 86 %, чувствительность 91 %, специфичность 65 %
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442Е
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 86 %, чувствительность 91 %, специфичность 65 %
Экспериментальная система	Клеточная линия U-SENS тм: U937, клеточная линия гистиоцитарной лимфомы человека
Принцип исследования	CD86 считают ко-стимулирующей молекулой, которая может имитировать моноцитную активацию, занимающую ключевое место в праймировании Т-клеток. Изменения экспрессии маркера клеточной поверхности CD86 измеряют методом проточной цитометрии после окрашивания клеток, как правило, антителами, маркированными флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Одновременно проводят измерение цитотоксичности (например, используя PI) для оценки, происходит ли повышающая регуляция экспрессии маркера клеточной поверхности CD86 при субцитотоксичных концентрациях. Вычисляют индекс стимуляции (SI) маркера клеточной поверхности CD86 по сравнению с растворителем/контролем носителя и используют в прогностической модели для поддержки различия между сенсибилизаторами и несенсибилизаторами кожи [104]
Считывание данных	Изменения экспрессии маркера клеточной поверхности CD86 измеряют методом проточной цитометрии после окрашивания клеток, как правило, антителами, маркированными флуоресцеинизотиоцианатом (FITC)
Время воздействия	(45 3) ч
Применимость	Проба применима к исследуемым химическим веществам, которые растворимы или формируют стабильные дисперсии (т.е. коллоид или суспензию, в которых исследуемое химическое вещество не осаждается либо не отделяется от растворителя/носителя на разные фазы) в подходящем растворителе/носителе [104]
Применение к МИ	Данные отсутствуют. U-SENS работает с физиологическим раствором и растворителями DMSO, но вряд ли будет работать с неполярными растворителями МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масла, потому что их значения log Р превышают 15,0

С.2.2.10 Набор IL-8 Luc

Набор репортерного гена интерлейкин-8 (проба IL-8 Luc) использует репортерную клетку IL-8, полученную из ТНР-1 (клетки THP-G8), которая позволяет количественно измерить индукцию гена люциферазы путем обнаружения люминесценции из зарекомендовавших себя субстратов люциферазы, продуцирующих свет, в качестве индикатора активности IL-8 и GAPDH в клетках после воздействия химических веществ, сенсибилизирующих кожу (см. таблицу С.11).

Таблица С.11 - Проба IL-8 Luc

Ключевое событие 3. Активация эпидермальных дендритных клеток
Руководство ОЭСР	Техническое руководство OECD 442Е
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 86 %, чувствительность 96 %, специфичность 41 %
Экспериментальная система	Клеточная линия IL8 Luc: репортерная клеточная линия IL-8, полученная из ТНР-1 (THP-G8)
Принцип исследования	Проба IL-8 Luc использует репортерную клеточную линию IL-8, полученную из ТНР-1, THP-G8, которая накапливает стабильный люциферазный оранжевый (SLO) и стабильный люциферазный красный (SLR) гены люциферазы под контролем активаторов IL-8 и глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) соответственно (1). Это позволяет количественно измерить индукцию гена люциферазы путем обнаружения люминесценции из зарекомендовавших себя субстратов люциферазы, производящих свет, в качестве индикатора активности IL-8 и GAPDH в клетках после воздействия химических веществ, сенсибилизирующих кожу [104]
Считывание данных	Изменения в экспрессии IL-8, цитокина, связанного с активацией дендритных клеток
Время воздействия	16 ч
Применимость	Хотя проба IL-8 Luc использует X-VIVO тм 15 в качестве растворителя, она точно определяет химические вещества с коэффициентом растворения октанола/воды log Kow > 3,5 и с растворимостью в воде около 100 g/мл. Тем не менее отрицательные результаты для исследуемых химических веществ, которые не растворяются при 20 мг/мл, могут произвести ложноотрицательные результаты из-за их неспособности раствориться в XVIVO тм 15. Следовательно, отрицательные результаты для этих химических веществ не следует рассматривать. В процессе валидации обнаружен высокий ложноотрицательный уровень для ангидридов. Более того, из-за ограниченной метаболической способности клеточной линии (8) и условий эксперимента, про-гаптены (вещества, требующие метаболической активации) и пре-гаптены (вещества, активируемые окислением воздухом) могут произвести отрицательные результаты в пробе. Проба IL-8 Luc может классифицировать химические вещества как сенсибилизаторы и несенсибилизаторы кожи, тем не менее на данный момент она не предоставляет оценки мощности [105]
Применение к МИ	Данные отсутствуют. Культуральную среду X-VIVO тм 15, DMSO или воду используют в качестве экстрагента для исследуемых химических веществ. Неизвестно, будет ли проба работать с неполярными жидкостями для МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масла

С.2.2.11 Быстрое обнаружение геномного аллергена ^тм1)

-----------------------------

¹⁾_{GARD является торговой маркой продукта, поставляемого SenzaGen АВ, Medicon Village (406), 22381 Лунд, Швеция. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

-----------------------------

Быстрое обнаружение геномного аллергена ^тм (GARD ^тм) является пробой на клеточной основе, которая использует естественное распознавание инородных веществ дендритными клетками, измеряемое многопараметровым считыванием геномных биомаркеров. После клеточной стимуляции химические вещества классифицируют как сенсибилизаторы или несенсибилизаторы кожи, основываясь на индуцированных транскрипционных профилях (см. таблицу С.12). Проба GARD была валидирована в исследовании от индустрии [118] и на данный момент оценивается EURL-ECVAM, а также получила положительное научное мнение ESAC по коже GARD ^тм.

Таблица С.12 - GARD ^тм

Ключевое событие 3. Активация дендритных клеток
Руководство ОЭСР	Проект 4.106. Новое техническое руководство - тест кожи GARD тм: метод in vitro для идентификации сенсибилизаторов кожи, основывающийся на геномной интерпретации влияния химических веществ на человеческие дендритные клеткоподобные клетки (ключевое событие 3 АОР) [121]
Рабочие показатели (ответ да/нет)	Точность 94 %, чувствительность 93 %, специфичность 96 % [118]. Примечание - Проба кожи GARD тм может сочетаться с измерением мощности GARD тм для получения класса согласно европейским правилам классификации, маркировки и упаковки (CLP) (например, слабый или сильный сенсибилизатор кожи)
Экспериментальная система	Клеточная линия GARD тмskin: SenzaCells тм (SenzaGen) человеческого миелоидного происхождения с характеристиками, сходными с дендритными клетками
Принцип исследования	GARD тмskin измеряет экспрессию 200 генов, индуцированных в SenzaCells тм в ответ на химическое воздействие. 200 генов, относящиеся к прогностически значимым asGARD (GPS), включают биомаркеры активации и созревания дендритных клеток (KE3), несколько путей сигнализирующих об опасности и рецепторов распознавания структур (KE2), а также антиген-представляющие молекулы и пути клеточной пролиферации (KE4) [116], [117]
Считывание данных	GPS включает механистично релевантные гены, задействованные в процессе сенсибилизации кожи, таком как повышающая регуляция состимулирующих молекул и индукция клеточного и окислительного стресса [115]. Экспрессию гена 200 генов в GPS измеряют с использованием аналитической системы Nanostring a. Полученную экспрессию гена анализируют путем распознавания взаимосвязей, используя алгоритм машинного обучения, основанный на закрепленном наборе эталонных образцов [114]. Каждый образец классифицируют как сенсибилизатор или несенсибилизатор кожи, не прибегая к субъективной оценке
Время воздействия	24 ч
Применимость	Проба GARD тмskin широко применима в обширном химическом пространстве, охватывающем множество органических функциональных групп и конечных использований, включая пре-/про-гаптены и вещества с низкой водной растворимостью [113], [116]
Применение к медицинским изделиям	Пробы GARD тм работают с полярным (солевым) и неполярным (кунжутное и оливковое масла) экстрагентами и применимы для исследования экстрактов из МИ. В исследовании с целью подтверждения сенсибилизирующего действия экстрактов из МИ проанализированы четыре известных сенсибилизатора кожи, содержащиеся в силиконе медицинского назначения и полиуретане, и отрицательный контроль. Исследуемые объекты экстрагированы в полярном (физиологическом) и неполярном (масло) экстрагентах и четко определены как сенсибилизаторы или несенсибилизаторы кожи [119]
а Nanostring  является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO или IEC означенного продукта.

С.3 Обсуждение

С.3.1 Наборы для идентификации, одобренные OECD

Руководствами по исследования# OECD 442 [75], [79], [104] одобрено шесть наборов для идентификации in vitro химических кожных аллергенов, которые относятся к ключевым событиям 1, 2 и 3 и могут быть применены для обнаружения химических аллергенов в экстрактах из МИ - это DPRA, KeratinoSens ^тм, LuSens, h-CLAT, U-SENS ^тм и IL-8 Luc. Тем не менее, так как DPRA использует избыток химического вещества для обнаружения реактивности пептида, данный набор возможно не будет способен определять низкие уровни сенсибилизаторов в разбавленных экстрактах МИ. Данные наборы валидированы с использованием чистых исследуемых веществ, а не химических смесей. Из-за ограниченной метаболической способности клеточных линий, используемых в некоторых пробах in vitro, про-гаптены (т.е. вещества, требующие ферментной активации, например посредством ферментов Р450) могут также предоставлять ложноотрицательные результаты [82], [104]. Наконец, эти методы исследования, разработанные для конкретного ключевого события, поодиночке могут не являться достаточными для выводов о наличии или отсутствии потенциала химических веществ к кожной сенсибилизации и должны рассматриваться в контексте интегрированных подходов, таких как IATA, сочетая их с другой дополнительной информацией.

Учитывая специфичность исследований биосовместимости МИ, используемых для оценки готовых изделий или материалов в существующем виде или после экстрагирования в полярных и неполярных жидкостях, применимость наборов OECD должна быть подтверждена. У многих из них могут быть ограничения с неполярными экстрагентами для МИ, такими как кунжутное, хлопковое или оливковое масла. Помимо проблемы несовместимости веществ и растворителей некоторые наборы, валидированные OECD, возможно, не будут способны обнаружить потенциальные кожные сенсибилизаторы в экстрактах МИ, потому что они часто присутствуют в чрезвычайно низких концентрациях.

С.3.2 Геномные наборы

Геномными наборами, относящимися к ключевым событиям 2 и 3, являются SenCeeTox, SENS-IS, EpiSensA и GARD ^тм и приведены в С.2.2. Первые три работают с тканями RHE, а четвертый основан на патентованной клеточной линии. Они все незначительно отличаются, но их общая черта - использование маркерных генов для идентификации кожных сенсибилизаторов. Также все наборы, кроме EpiSensA, результативно завершили пилотные проекты с использованием полярных и неполярных экстрактов из полимерных МИ с добавлением кожного сенсибилизатора. Точность на ограниченном наборе образцов для пилотных проектов была сопоставима или превышала точность наборов, валидированных OECD. Два из этих наборов, SENS-IS и GARD ^тм, в настоящее время рассматривают в рамках раздела 4 Программы Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) секцией "Руководство по исследованию" [121] (проекты, связанные с руководствами исследований по влиянию на здоровье).

Эти наборы могут быть использованы для оценки потенциала МИ к кожной сенсибилизации с учетом их точности, способности работать с полярными и неполярными жидкостями и потенциалом быть самостоятельными методами для исследования сенсибилизации кожи МИ. Однако их способность к обнаружению катионных металлических сенсибилизаторов должна быть подтверждена.

С.3.3 Другие наборы

Набор IL-18 RHE относится к ключевому событию 2. Данный набор измеряет выделение IL-18 и жизнеспособность клеток. Эти исследования для набора IL-18 RHE имеют ограничения. Так как набор использует ткани RHE, он возможно может работать с полярными и неполярными экстрактами из МИ. Тем не менее, если данный набор не валидирован OECD или включен в какое-либо крупное сравнительное исследование кожной сенсибилизации in vitro, его применение в исследовании МИ должно быть подтверждено.

С.3.4 Общие соображения для валидации методов испытания МИ в условиях in vitro

В руководстве исследований OECD для определения потенциала химических веществ к кожной сенсибилизации включены шесть валидированных наборов in chemico и in vitro (DPRA, Keratinosens, LuSens, h-Clat, U-Sens, IL-8 Luc), а также два набора (GARD ^тм, SENS-IS) [75], [79], [104] добавлены в Программу OECD по Руководству исследований [121]. Включение любого из этих наборов кожной сенсибилизации in vitro для исследований МИ должно поддерживаться данными валидации, подтверждающими эквивалентность/превосходство метода in vitro по сравнению с текущими методами in vivo, используемыми для оценки потенциала МИ/экстрактов МИ к кожной сенсибилизации.

Такой процесс валидации должен позволить сравнить рабочие показатели между пробами-кандидатами и исследовать как при самостоятельном использовании, так и в качестве части стратегии тестирования.

На этапе валидации при планировании исследований необходимо учитывать следующее:

- решение относительно использования референтных материалов сенсибилизации кожи или экстракты несенсибилизирующих материалов, к которым сенсибилизаторы будут добавлены в указанных концентрациях;

- идентификацию репрезентативных классов химических веществ, сенсибилизирующих кожу, которые могут присутствовать в МИ;

- выбор списка референтных химических веществ для построения вариационной базы данных, содержащей физико-химические характеристики, исторические данные методов на животных и человеке, а также данные in vitro и in chemico валидированных проб OECD;

- идентификацию материалов отрицательного и положительного контроля для использования при валидации;

- определение значений минимальной надежности (в пределах между воспроизводимостью) и точности (чувствительность, специфичность) по сравнению с методами на человеке и/или животных для валидации пробы in vitro;

- идентификацию тех химических или физических свойств материалов МИ, которые могут привести к помехам тестирования, ложноотрицательным или ложноположительным результатам;

- определение сферы применимости рассматриваемых проб in vitro, таких как: материалы, подходящие для экстракции, или материалы, не подходящие для экстракции (например, жидкостей, гелей, паст, газов, паров, аэрозолей, конденсатов, наноматериалов).

С.4 Выводы

Примерно 20 % химических веществ в мировой коммерции являются сенсибилизаторами [72]. Тем не менее только около 1 % экстрактов МИ показывают положительные результаты в тестах сенсибилизации кожи на животных [94]. Эти факты, а также наличие современных проб сенсибилизации кожи in vitro убедили экспертов в том, что коренной сдвиг в сторону признания проб in vitro для тестирования МИ неизбежен [73]. Тем не менее, чтобы это произошло, необходимы тщательно спланированные исследования оценки/валидации наиболее многообещающих наборов для кожной сенсибилизации in vitro или комбинации наборов.