Методические рекомендации МР 1.2.0309-22 "Использование метода атомно-силовой микроскопии для оценки активности реакции альвеолярного фагоцитоза" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 29 декабря 2022 г.)

Методические рекомендации МР 1.2.0309-22
"Использование метода атомно-силовой микроскопии для оценки активности реакции альвеолярного фагоцитоза"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 29 декабря 2022 г.)

ББК 51.24

И88

ISBN 978-5-7508-2021-4

Введены впервые

I. Область применения

1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее - МР) описан алгоритм количественной и качественной оценки активности реакции альвеолярного фагоцитоза после воздействия частиц на клетку при использовании метода атомно-силовой микроскопии.

1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими, научно-исследовательскими и иными организациями, занимающимися вопросами оценки безопасности наноматериалов.

II. Общие положения

2.1. Начальным моментом поглощения частицы фагоцитоспособной клеткой является поверхностный контакт между ними, в результате которого часть клеточной (плазматической) мембраны инвагинируется, и образуется ограниченная мембраной вакуоль, называемая эндосома или фагосома. Процесс инвагинации изменяет топографию поверхности фагоцита, характер и степень изменений зависят от преобладающего размера фагоцитируемых частиц и от фагоцитарной активности клетки [6 - 8].

2.2. Методом полу контактной атомно-силовой микроскопии (далее - пк-АСМ) оцениваются изменения поверхности топографии биологических объектов с нанометровым пространственным разрешением. Из трех режимов работы атомно-силовой микроскопии (контактный, бесконтактный и полуконтактный) - полуконтактный приобретает популярность при исследовании морфологии биологических клеток, поскольку позволяет получать трехмерные изображения рельефа поверхности клеток с нанометровым пространственным разрешением. Универсальность данного режима работы по сравнению с другими режимами атомно-силовой микроскопии позволяет получать разрешение 1 - 5 нм на большинстве исследуемых образцов.

III. Методы исследований

3.1. Принцип метода пк-АСМ.

3.1.1. Полученные методом пк-АСМ изображения выявляют особенности рельефа поверхности исследуемой клетки.

3.1.2. Вследствие зависимости сил межатомного взаимодействия от расстояния между зондом и поверхностью пк-АСМ измеряет рельеф поверхности с субнанометровым вертикальным разрешением.

3.1.3. Горизонтальное разрешение уступает вертикальному и определяется радиусом закругления острия зонда, который составляет величину от 1 до 20 нм.

3.1.4. Метод пк-АСМ заключается в регистрации сил межатомного взаимодействия между исследуемой поверхностью и колеблющимся на резонансной частоте зондовым датчиком, представляющим собой механическую иглу, закрепленную на конце кантилевера (далее - балки).

3.1.5. Механические колебания балки возбуждаются с помощью пьезокерамического привода. Амплитуда и фаза колебаний детектируются с помощью силового оптического сенсора. Последний представляет собой четырехсекционный фотодетектор, регистрирующий положение луча лазера, отраженного от кантилевера и попадающего на фотодетектор.

3.1.6. При подводе зонда к исследуемой поверхности действие сил межатомного взаимодействия приводит к изменению условий резонансных колебаний кантилевера, к изменению амплитуды и фазы колебаний. Система обратной связи поддерживается постоянными средними расстояниями между образцом и зондом за счет управления вертикальным положением кантилевера таким образом, чтобы не изменялась амплитуда колебаний. В полуконтактном режиме зонд входит в физический контакт с поверхностью (в зону сил отталкивания) только в нижней части своей траектории, постукивая поверхность.

3.1.7. В процессе сканирования образца, которое представляет собой построчное перемещение зонда над исследуемой поверхностью, электронная подсистема сканирующей зондовой микроскопии, управляемая персональным компьютером, регистрирует вертикальные перемещения кантилевера и реконструирует рельеф поверхности.

3.1.8. Одновременно с изображением рельефа поверхности дополнительно получают изображения отклонения амплитуды колебаний кантилевера от заданной рабочей величины и изображения сдвига фазы колебаний.

3.2. Порядок проведения экспериментов на животных:

3.2.1. После окончания карантинных и адаптационных мероприятий экспериментальные животные вне зависимости от выбранной экспериментальной модели содержатся в условиях специально организованного отделения вивария ¹ [6];

------------------------------

¹_{ГОСТ 33215 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными".}

------------------------------

3.2.2. В группах сравнения число экспериментальных животных используется в одинаковом количестве;

3.2.3. Для проведения исследований на животных используются любые из приведенных ниже экспериментальных моделей:

- после интратрахеального введения крысам водных суспензий изучаемых частиц с контрольной группой животных ²;

------------------------------

²_{МР N 01-19/24-17 "Методические рекомендации по использованию клеточных систем "ин витро" и "ин виво" для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей" (далее - МР N 01-19/24-17).}

------------------------------

- после ингаляционного воздействия на крыс изучаемыми частицами в ингаляционных камерах с параллельной "ложной экспозицией" животных контрольной группы, которые содержатся в условиях идентичной ингаляционной установки, питаемой равным по объему потоком чистого воздуха ³.

------------------------------

³_{МР 1.2.0151-19 "Подходы к проведению хронических ингаляционных экспериментов с наноразмерными аэрозолями на мелких лабораторных животных" (далее - МР 1.2.0151-19).}

------------------------------

Данные экспериментальные модели демонстрируют, как происходит взаимодействие между частицей и клеткой in vivo в микроокружении, которое не воспроизводится в клеточной культуре.

IV. Получение изображений клеточной поверхности

4.1. Получение клеточного материала и подготовка образцов для пк-АСМ осуществляется следующим образом:

- через 24 часа после воздействия изучаемого вещества у крыс забирается жидкость бронхоальвеолярного лаважа (далее - БАДЖ) ⁴;

------------------------------

⁴_{МР 1.2.0151-19; МР N 01-19/24-17.}

------------------------------

- суспензия клеток БАЛЖ в объеме 3 мкл осаждается на поверхность свежего скола слюды, выдерживается в течение 1 мин;

- излишек суспензии удаляется с помощью бумажного фильтра ("вытягиванием" под действием капиллярных сил);

- образец высушивается (продувкой чистым сухим воздухом или азотом в течение не менее 30 сек.).

4.1.1. Если визуализация поверхности клеток затруднена присутствием микрокристаллов соли, сформировавшихся при высушивании буферного раствора, проводится дополнительная промывка образцов.

4.1.2. Образец с осажденными и высушенными на поверхности слюды клетками помещается на поверхность капли деионизованной воды (рабочей стороной образца вниз), выдерживается в течение одной минуты, после чего остатки жидкости удаляются вытягиванием с помощью бумажного фильтра. При необходимости процедура повторяется несколько раз (каждый раз с новой каплей деионизованной воды). После этого образец высушивается продувкой чистым сухим воздухом или азотом в течение не менее 30 сек.

4.2. Порядок получения изображений с поверхности клеток:

4.2.1. Детальное исследование топографии поверхности клеток проводится с помощью зондовой нанолаборатории с использованием зондовых датчиков со следующими типичными характеристиками:

- высота зонда 10 - 15 мкм;

- угол раствора зонда 22°;

- радиус закругления острия зонда около 10 - 15 нм.

4.2.2. Измерения топографии поверхности клеток осуществляются следующим образом:

4.2.2.1. Измерения топографии поверхности клеток осуществляется при амплитуде колебаний кантилевера в диапазоне 100 - 300 нм с использованием зондов с радиусом закругления не более 20 нм;

4.2.2.2. Величина амплитуды колебаний кантилевера составляет 40 - 60 % от амплитуды свободных колебаний и удовлетворяет условию совпадения фазовых кривых подвода - отвода в рабочей точке;

4.2.2.3. При начальной подстройке величины регистрируемой фазы свободных колебаний кантилевера на уровне 90х, сканирование проводится при значениях фазы колебаний меньше 90х, что соответствует измерениям в режиме сил отталкивания;

4.2.2.4. Сканирование поверхности клеток производиться с разрешением не менее 512 x 512 точек при строчной частоте развертки 1 Гц;

4.2.2.5. Наибольший размер сканирования должен позволять получать полное изображение клетки. Для того, чтобы зафиксировать особенности морфологии поверхности клеток с наилучшим пространственным разрешением, проводятся дополнительные сканирования областей размерами 10 x 10 мкм и 2 x 2 мкм во внутренней части клетки.

V. Обработка полученных изображений

5.1. Для обработки полученных изображений проводится настройка общего наклона, кривизны поверхности образца и строчных сбоев сканирования.

5.2. В ходе дальнейшего анализа на изображениях выделяются и анализируются области, соответствующие выраженным углублениям на поверхности, ассоциированными с инвагинацией клеточной мембраны в процессе фагоцитоза частиц. Алгоритмическое решение, включает следующие основные шаги:

5.2.1. Учет общей кривизны поверхности клетки - вычитание плавных изменений рельефа поверхности;

5.2.2. Выделение на изображении областей, соответствующих углублениям, на основе градиентного анализа;

5.2.3. Создание бинаризованной маски в виде двумерного массива, где специальным образом отмечаются элементы, принадлежащие углублениям;

5.2.4. Удаление из маски элементов малой площади (менее четырех пикселей), соответствующих высокочастотным шумам на изображении;

5.2.5. Полученная на выходе маска используется для последующего статистического анализа.

5.3. С помощью алгоритма кластерного анализа на изображении-маске выделяются связанные области, соответствующие углублениям на поверхности клетки. Определяется эффективный диаметр углублений и их глубина относительно уровня поверхности клетки с использованием исходного изображения. По результатам анализа строятся гистограммы и подсчитывается средняя плотность "вдавлений" на единицу поверхности.

5.4. Созданный алгоритм анализа оценивает реакцию фагоцитарной активности клетки. Фагоцитарная активность увеличивается с увеличением среднего числа "вдавлений" на единицу поверхности клетки.

5.5. Обработка полученных изображений проводится с применением программных средств ⁵.

------------------------------

⁵_{Примеры программных средств: www.ntmdt-si.ru/products/afm-features/nova-px-control-program; www.imagemet.com/products_/spip; siams.com/produkty; www.mathcad.com/en (в открытом доступе).}

------------------------------

VI. Данные и отчетность

6.1. Оценка активности фагоцитоза частиц определяется подсчетом средней плотности "вдавлений" на единицу поверхности клетки, распределения углублений на ее поверхности по их эффективному диаметру и глубине, полученные с помощью пк-АСМ.

Рекомендуемая форма и примеры заполнения протоколов представлены в приложениях 1 и 2 к настоящим МР.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. МВИ 251.13.17.040/2009 "Методика выполнения измерений размеров наночастиц методом атомно-силовой микроскопии".

3. МВИ 251.13.17.019/2009 "Методика выполнения измерений величины шероховатости поверхности методом атомно-силовой микроскопии".

4. МР N 01-19/24-17 "Методические рекомендации по использованию клеточных систем "ин витро" и "ин виво" для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей".

5. МР 1.2.0151-19 "Подходы к проведению хронических ингаляционных экспериментов с наноразмерными аэрозолями на мелких лабораторных животных".

6. ГОСТ 33215 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными".

7. International guiding principles for biomedical research involving animals. (CIOMS Nonserial Publication Series) Geneva: Council for International Organizations of Medical Sciences, 1985 (most recent edition 2012). - 28 p.

8. Atomic force microscopy investigation of phage infection of bacteria/ E.V. Dubrovin, A.G. Voloshin, S.V. Kraevsky et al. // Langmuir. - 2008. Vol. 24(22). - P. 13068 - 13074.

9. AFM of bacterial cells subjected to different factors / A.M. Lomonosov, S.N. Egorov, M.O. Gallyamov, I.V. Yaminsky // Phys. Low-Dim. Struct. - 2003. - Vol. 3/4. - P. 125 - 130.

10. Atomic force microscopy study of fine structures of the entire surface of red blood cells / P.C. Zhang, C. Bai, Y.M. Huang et al. // Scanning Microsc. - Vol. 9(4). - P. 981 - 989.